Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, dynamisch-mechanisch-druckbelastete Hydrogele mit dynamischer mechanischer Druckbelastung zu bestücken. Dazu werden Primärzellen durch Dissektion und enzymatischen Verdau von Knorpelscheiben gewonnen. Die isolierten Zellen werden in einem 2%igen Agros, Hydrogel verkapselt, und die zellgesäten Konstrukte werden mit einem Biopsiestanzer hergestellt.

Die Proben werden dann in die Druckbelastungsanlage gegeben und in einen mikromechanischen Mach-One-Stimulator geladen. Die dynamische Kompressionsbelastung wird dann auf zellausgesäte Konstrukte angewendet, um die Kollagen- und Prot-Glykansynthese zu beurteilen. Die Konstrukte werden nach der Inkubation inkorporiert radiomarkiert.

Die Isotope werden durch Szintillation quantifiziert, indem die resultierenden Daten gezählt werden, die auf DNA normalisiert werden. Der Inhalt zeigt Veränderungen in der extrazellulären Matrixsynthese nach mechanischer Stimulation. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Reaktion der Gegenstelle und die mechanische Stimulation geben.

Es kann auch auf andere Systeme wie Stammzellen, anderes Bindegewebe oder mechano-rezeptive Zellen angewendet werden. Die hier verwendeten Mittelhand-Phalgelenke von skelettreifen Kühen wurden aus einem örtlichen Schlachthof gewonnen, der in einem sterilen Präparierbereich arbeitet. Legen Sie die Knorpelscheiben in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 100 Millimetern mit 20 Millilitern Schinken, F 12 mit 0,5 % Protease und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Nach dem Inkubationsvakuum die Proteaselösung ansaugen und die Scheiben mit Schinken abspülen. F 12 Kulturmedium sanft schwenken, dann aspirieren. Wiederholen Sie dies, waschen Sie nach dem dritten Waschgang noch zwei Mal und saugen Sie das Nährmedium ab.

Fügen Sie 20 Milliliter Schinken F 12 mit 0,15 % Kollagenase A hinzu und inkubieren Sie die Gerichte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag pipettieren Sie die Zellsuspension durch einen 200-Mesh-Siebfilter in eine saubere Petrischale, um den Filter zu waschen, pipettieren Sie weitere fünf Milliliter Schinken F 12 und sammeln Sie den Durchfluss in derselben Schale. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Die Petrischale mit 10 Millilitern Schinken F 12 waschen. Geben Sie dann die Waschlösung in das konische Rohr. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 600 bis 800 RZB für sechs bis acht Minuten bei Raumtemperatur.

Sobald die Drehung abgeschlossen ist, saugen Sie den Überstand an und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in 40 Millilitern Nährmedium. Zentrifugieren Sie das Röhrchen sechs bis acht Minuten lang bei 600 bis 800 RZB.

Wiederholen Sie die Aspiration, die Wiederbelebungssuspension und die Zentrifugation noch zweimal für insgesamt drei Mal, bevor Sie die dritte Drehung durchführen. Wiederbelebung. Suspendieren Sie den Gaumen durch Rühren und nehmen Sie ein 500 Mikroliter Aliquot für die Zellzählung. Während der dritten Drehung verwenden Sie ein Hämozytometer und ein inverses Lichtmikroskop, um die lebensfähigen Zellen im Aliquot durch Trianblau-Ausschluss zu zählen.

Sobald die Zellzahl bestimmt wurde und die dritte Drehung abgeschlossen ist, aspirieren Sie die Schlinge und die Wiederbelebung. Hängen Sie das Pellet in einem Volumen Kulturmedium mit der doppelten Sitzdichte. Hier werden die Chondrozyten mit 20 mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter resuspendiert.

Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die isolierten primären Gelenkchondrozyten in einem Aros-Hydrogel in einem Becherglas einzukapseln und 0,8 Gramm Arous zu suspendieren. In 20 Millilitern sterilem PBS. Stellen Sie das Becherglas auf eine auf 120 Grad Celsius eingestellte Platte, sobald sich der Becher aufgelöst hat.

Reduzieren Sie die Hitze in einem konischen 50-Milliliter-Rohr auf 60 Grad Celsius. Kombinieren Sie gleiche Volumina der Zellsuspension mit der doppelten gewünschten Konzentration der erhitzten aro-Lösung. Hier werden fünf Milliliter Zellsuspension zu fünf Millilitern 4%Agro-Suspension gegeben, um eine abschließende 2%Agros-Hydrogel-Mischung durch Pipettieren zu erhalten, wobei die Bildung großer Blasen vermieden wird, die die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen könnten.

Anschließend 10 Milliliter der Chondrozyten-Agros-Mischung vorsichtig in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 Millimetern geben. Auch hier gilt, dass keine großen Blasen entstehen. Decken Sie die Form mit dem Deckel ab.

Anschließend die Mischung 30 Minuten bei Zimmertemperatur ziehen lassen. Sobald sich die Mischung verfestigt hat, verwenden Sie einen vier Millimeter langen Biopsiestempel, um so viele Chondrozyten-Agros-Hydrogel-Proben wie möglich zu erhalten. In der Regel sind es 20 bis 30.

Legen Sie die Proben mit einem Mikrometermaß in eine saubere Petrischale und notieren Sie den Durchmesser und die Höhe jeder Probe. Idealerweise sollte das Konstrukt etwa fünf Millimeter hoch sein. Entsorgen Sie alle Proben, die aus einem Bereich gewonnen wurden, in dem die Probenhöhe mehr als 2 % beträgt. Übertragen Sie die Proben in eine frische 60-Millimeter-Petrischale, die 10 Millimeter vollständiges Medium enthält. In diesem Teil des Protokolls werden die zellsitzenden Konstrukte durch dynamische Kompression mechanisch stimuliert.

Dies wird mit Hilfe eines speziell entwickelten Kompressionsgeräts erreicht, das die Konstruktlade-PLAs mechanisch an ein mikromechanisches Scheinsystem koppelt, das die Menge der auf die Konstrukte angewendeten Kompression steuert. Der schwierigste Aspekt des Verfahrens ist das Laden der Proben in die Kompressionsanlage. Es ist wichtig, die Platten im Bohrgerät richtig einzustellen, um die angemessene Anwendung der dynamischen Druckbelastung zu gewährleisten.

Sterilisieren Sie vor der Verwendung die metallischen Komponenten der Kompressionsanlage in einem Autoklaven. Sterilisieren Sie die Kunststoffkomponenten mit 70% Ethanol über Nacht und UV-Licht für mindestens 15 Minuten. Um die Chondrozyten aros Hydrogel-Konstrukte vor dem Umfallen zu bewahren.

Setzen Sie mit einer Pinzette 12 sterile Kunststoff-Sicherungsringe in die Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte ein. Die Innendurchmesser der Sicherungsringe sollten größer sein als die Konstruktionsdurchmesser. Vorsichtig mit der Pinzette.

Übertragen Sie die Chondro-Aros-Hydrogele aus der Petrischale auf die 24-Well-Platte und befestigen Sie jedes in einem Sicherungsring. Übertragen Sie 400 Mikroliter des vollständigen Mediums auf jede Probe. Als nächstes montieren Sie die sterilisierte Kompressionsanlage und befestigen Sie die PLAs mit Stellschrauben.

Befestigen Sie das Kompressionspräparat an der 24-Well-Kulturplatte, um den Hydrogel-Kontakt zu lösen und wieder zu sichern. Die Konstruktionsverformung der Stellschrauben wird auf diesen unbelasteten Referenzzustand oder Nulldehnungszustand angewendet. Laden Sie den montierten Kompressionsprüfstand mit dem Fixierstift in ein mikromechanisches Prüfsystem von Mach one.

Befestigen Sie das Rig an der vertikalen Bühne und verriegeln Sie es dann mit einer Stellschraube. Entfernen Sie die Abstandsvorrichtung. Mit der Mach one Softwareschnittstelle können Sie die Frequenz auf ein Hertz, die Amplitude auf 350 Mikrometer und die Anzahl der Zyklen auf 1.200 einstellen.

Dadurch wird eine dynamische Druckbelastung mit einer Dehnungsamplitude von 10 % basierend auf der ursprünglichen Höhe der Proben angewendet. Um die mechanische Stimulation zu starten, drücken Sie die Starttaste, den Mach One-Aktuator. Die Ladevorrichtung, die an der Kulturplatte befestigt ist, hat sechs Vertiefungen, die sich auf und ab bewegen und sechs Proben gleichzeitig stimulieren.

Die nicht stimulierten Kontrollproben befinden sich ebenfalls in derselben Kulturplatte, werden jedoch nicht in die Vertiefungen mit den Vertiefungen gegeben. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, piept der Mach One und der Aktuator bewegt sich in den unbelasteten Referenzzustand. Ersetzen Sie nach Abschluss der mechanischen Stimulation die Abstandsvorrichtung.

Lösen Sie die Stellschraube des Fixierstifts und entfernen Sie die Kompressionsplatte und die Kulturplatte aus dem Testsystem neben der Radiomarkierung, die Zellhydrogel-Konstrukte pipettieren Sie beide fünf Mikrocuries von Tritium Prolene Proteinmarkierung für die Chondrozyten-spezifische Kollagensynthese und S 35 Schwefel für die Proteoglykansynthese in jeden, inkubieren Sie die radioaktiv markierten Konstrukte gut für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid zur Gewinnung der radioaktiv markierten Hydrogel-Konstrukte. Verwenden Sie eine Pinzette, um jedes Hydrogel-Konstrukt dreimal durch Eintauchen in PBS zu spülen. Um nicht eingebaute Isotope zu entfernen, legen Sie das gespülte Konstrukt in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Pape-Lösung in die 1,5-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie sie auf einen Heizblock und lassen Sie sie 72 Stunden lang bei 65 Grad Celsius verdauen. Sobald der Aufschluss abgeschlossen ist, sollte die Probe relativ klar aussehen.

Unmittelbar nach dem Pape-Aufschluss werden von jeder Probe Aliquots von 100 Mikrolitern entnommen, um den DNA-Gehalt mit dem Picogrün-D-Assay zu bestimmen. Nehmen Sie dann von jeder Probe ein Aliquot von 100 Mikrolitern, um die eingebaute Isotopenaktivität durch Beta-Flüssigszintillationszählung zu bestimmen. Die resultierende Isotopenaktivität sollte dann für die Analyse auf den DNA-Gehalt normiert werden.

Rinder-Gelenk-Chondrozyten-Aros-Hydrogel-Konstrukte bestehen aus 2%aros mit 10 mal 10 bis zum sechsten. Zellen pro Milliliter verkapselter Zellen wurden mechanisch bei einer Amplitude von 10 % Druckdehnung bei einer Frequenz von einem Hertz für 20 bis 60 Minuten oder 1.200 bis 3.600 Zyklen stimuliert. Anschließend wurden sie auf DNA-Gehalt und extrazelluläre Matrixsynthese durch Radioisotopeneinbau untersucht.

Wie hier zu sehen ist, wurde die DNA- und extrazelluläre Matrixsynthese dosisabhängig beeinflusst. Der DNA-Gehalt zeigte eine signifikante Abnahme von 35 % als Ergebnis einer 20- oder 30-minütigen Stimulation mit einem p-Wert von weniger als 0,01. 60 Minuten Stimulation zeigten keine Wirkung. Die knorpelspezifische Kollagen- und Proteoglykansynthese wurde durch den Einbau von Tritium, Prolin bzw. S 35-Schwefel bestimmt.

Diese zeigten signifikante Steigerungen von etwa 60 % als Reaktion auf 20 oder 30 Minuten Stimulation mit einem p-Wert von weniger als 0,01. 60 Minuten Stimulation zeigten keinen beobachtbaren Effekt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Hydrogelkulturen mit dynamischem Abdruck mechanisch stimuliert und dieses Protokoll für den Einsatz in ähnlichen Anwendungen angepasst werden kann.