Name: Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-27T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Erfahren Sie die dynamische mechanische Kompression von Chondrozyten in Agarose-Hydrogelen zur Untersuchung von Kollagen- und Proteoglykansynthese. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in den Stoffwechsel von Knorpelzellen unter mechanischer Belastung.

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Ein. Isolation of Primary Chondrozyten Ernte 10-15 volle Dicke Knorpel Scheiben von den Gelenkflächen des tierischen Gelenken (zB das Mittelhandknochen-Phalangealgelenk von ausgewachsenem Skelett Kühen von einem lokalen Schlachthof gewonnen). <ol><li> Ort Knorpel Scheiben in einer 100 mm Petrischale und Inkubieren in 20 ml 0,5% Protease in Ham-F-12 (w / v) für 2 Stunden bei 37 ° C. Spülen Sie drei Mal in Ham-F-12 Kulturmedien und inkubieren mit 20 ml 0,15% Collagenase A in Hams F-12 Kulturmedien über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Filtern der Zellsuspension durch ein 200 mesh-Sieb-Filter in einen sauberen Teller. Waschen Sie den Filter mit 5 ml Ham F-12 und zu dem Gericht. Übertragen der Zellsuspension in ein 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Petrischale mit 10 ml Ham F-12 und zu dem konischen Rohr. </li><li> Zentrifugieren bei 600-800 rcf für 6-8 min bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand, wodurch nicht th störene Zellpellet und in 40 ml Ham-F-12 Kulturmedium erneut zu suspendieren. </li><li> Zentrifugieren bei 600-800 rcf für 6-8 min. </li><li> Wiederholen Schritte 1.4 und 1.5 noch zweimal mit insgesamt 3 mal. Vor dem Zentrifugieren zum dritten Mal, das Pellet über Agitation und erhalten eine 500 ul Aliquot zur Zellzählung. </li><li> Zählen lebensfähigen Zellen unter Verwendung des Trypan-Blau-Ausschluss-Methode 9 mit einem Hämozytometer und eines invertierten Lichtmikroskops. </li><li> Überstand und resuspendieren des Pellets in einem Volumen von Ham-F-12 Medium, um den gewünschten Einsaatdichte verdoppeln (z. B. 20 x 10 6 Zellen / ml für eine Endkonzentration von 10 x 10 6 Zellen / ml nach der Verkapselung). </li></ol> 2. Chondrozyten-Agarose Hydrogel Encapsulation <ol><li> Wärme 0,8 g autoklavierten Typ VII Agarose in 20 ml sterilem 1x PBS (pH 7,4) auf einer Heizplatte bei 120 ° C bis zur Auflösung. Einmal gelöst, die Hitze auf 60 ° C höhere Temperaturen als will beeinträchtigen die Lebensfähigkeit der Zellen. </li><li> In einem 50 ml konischen Röhrchen wird gründlich gemischt gleichen Volumina der Zellsuspension mit der doppelten gewünschten Konzentration aus Agarose (z. B. 4% Agarose Suspension für eine abschließende 2% Agarose Hydrogel). Vermeiden Sie die Erstellung von großen Blasen, wie sie die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen können und bauen Lebensdauer. </li><li> Sorgfältig Aliquot von 10 ml der Chondrozyten-Agarose Mischung in eine 60 mm Petrischale Durchmesser, unter Vermeidung der Bildung großer Blasen. </li><li> Lassen Sie stehen für 30 min bei Raumtemperatur bis geliert. </li><li> Zu erhalten, wie viele Chondrozyten-Agarose Hydrogel Proben nach Bedarf (typischerweise 20-30) mit einem 4 mm Biopsiestanze. </li><li> Messung und Aufzeichnung der physikalischen Abmessungen (Durchmesser und Höhe) von repräsentativen Proben mit einem Mikrometer. Konstrukte sollte etwa 5 mm betragen in der Höhe, verwerfen Proben aus einem Bereich, wo der Probenhöhe Varianz größer als 2% erhalten. </li><li> Übertragen Proben zu einem neuen 60 mm Petrischale und Ergänzungmit 10 ml komplettem Medium (z. B. 20% fötalem Rinderserum in Ham-F-12 Kulturmedium mit 20 mM HEPES, 100 ug / ml Ascorbinsäure und 2x Antibiotika / Antimykotika). </li></ol> 3. Mechanische Stimulation und Radiomarkierung von Chondrozyten-Agarose Hydrogele <ol><li> Autoklaven werden die metallischen Komponenten des Kompressions-rig. Sterilisieren Sie die Kunststoffteile mit 70% Ethanol (über Nacht) und UV-Licht (mindestens 15 min). </li><li> Konstrukte Umfallen, mit Pinzette Platz 12 sterile Plastik Halteringe (mit einem Innendurchmesser größer als der Durchmesser Konstrukt) (n = 6, Proben und Kontrollen) innerhalb der Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte zu halten. </li><li> Mit einer Pinzette, transferieren es vorsichtig die Chondrozyten-Agarose Hydrogele aus der Petrischale auf den 24-Well-Platte, die Sicherung jedes in einem Haltering. </li><li> Übertragen 400 ul komplette Medien (zB 20% FBS in Ham-F-12 Kulturmedium mit 20 mM HEPES, 100 ug / ml Ascorbinsäure und2x Antibiotika / Antimykotika) zu jedem Probenbehälter. </li><li> Montieren Sie die sterilisiert Kompression rig (Abbildung 1) und befestigen Sie die Platten mit Stellschrauben. Bringen Sie die Kompression rig auf die 24-well Platte. </li><li> Lösen und wieder sichern die Stellschrauben Platte-Hydrogel-Kontaktlinsen (spannungslosen Zustand) zu etablieren. </li><li> Legen Sie die zusammengebauten Kompression rig in eine Mach-1 Mikromechanische Testing System. Sichere rig auf die vertikale Stufe über Fixierstift und einrasten mit Stellschraube. Entfernen Sie den Abstand jig. </li><li> Anwenden dynamischen Druckbelastung an gewünschten Amplitude (z. B. 10% Dehnung Amplitude auf der ursprünglichen Höhe der Proben basierend), Frequenz (zB 1 Hz) und Dauer oder Anzahl der Zyklen (zB Zeitintervallen bis zu 60 min). </li><li> Nach Abschluss der mechanischen Stimulation, ersetzen Sie den Abstand jig, lösen Sie die Fixierstift Stellschraube und entfernen Sie die Kompression rig und Kultur Platte aus dem Mach-1 Mikromechanische Testing System. </li&gt; <li> Radiomarkierung Zell-Hydrogel-Konstrukte durch Ergänzung der Medien mit 5 uCi gewünschte Isotop (zB [3 H]-Prolin-Protein-Label für Chondrozyten-spezifische Kollagen-Synthese und [35 S]-Schwefel für Proteoglykan-Synthese). </li><li> Inkubieren der radiomarkierten Konstrukten für 24 h bei 37 ° C, 5% CO 2 10. </li><li> Ernten Sie die radioaktiv markierten Hydrogel Konstrukten und spülen 3 mal in 1x PBS (pH 7,4) auf eine nicht rechtsfähige Isotop entfernen. Ausgewählte Proben unter Verwendung von Papain (40 ug / ml in 20 mM Ammoniumacetat, 1 mM ethyldiaminetetraacetic Säure und 2 mM Dithiothreitol bei 65 ° C für 72 h). </li><li> Assay Digest für DNA-Gehalt mit dem PicoGreen Farbstoff Assay 11 und eingebauten Isotops Aktivität, normiert auf DNA-Gehalt von β-Flüssig-Szintillationszählung 12,13 unmittelbar folgenden Papainverdau. </li></ol> Hinweis: Der Kauf und die Entsorgung von radioaktiven Materialien (Abfälle Isotope und Artikeldie möglicherweise in Kontakt radioaktiver Stoffe gekommen sind) müssen den einschlägigen institutionellen (und / oder staatlichen) Vorschriften und Verfahren für die sichere Handhabung und Entsorgung von radioaktiven Substanzen. 4. Repräsentative Ergebnisse Bovine Gelenkchondrozytenprobe-Agarose Hydrogele Konstrukte (2% Agarose mit 10 x 10 6 Zellen / ml eingekapselten Zellen) wurden mechanisch mit einer Amplitude von 10% Stauchung bei einer Frequenz von 1 Hz für 20 bis 60 min (oder 1.200 bis 3.600 Zyklen angeregt ) und im Hinblick auf DNA-Gehalt und extrazellulären Matrix-Synthese durch Einbau Radioisotop. Und extrazellulären Matrix-DNA-Synthese wurde in einer Dosis-abhängigen Weise beeinflusst. DNA-Gehalt zeigte eine signifikante Abnahme von 35% als Ergebnis von 20 oder 30 min der Stimulation (p &lt;0,01), während 60 min Stimulation zeigte keinen Effekt (Abb. 2). Knorpel-spezifische Kollagen und Proteoglykan-Synthese (bestimmt durch [3 H]-Prolin und[35 S]-Schwefel Einarbeitung jeweils) zeigten signifikante Anstiege von etwa 60% in Reaktion auf 20 bis 30 min der Stimulation (p &lt;0,01), 60 min mit der Stimulation aufweist keinen beobachtbaren Effekt (Abb. 3). <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> . Abbildung 1 Schematische Darstellung des custom-built dynamische Kompression rig zur Stimulierung Chondrozyten-Agarose Konstrukte. Links: Assembled rig. Rechts: Explosionszeichnung zeigt Einzelkomponenten. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Veränderungen in der DNA-Gehalt der Chondrozyten-Agarose Hydrogele mechanisch unter einer 10% Stauchung Amplitude bei 1 Hz für 20 bis 60 min (Mittelwert ± SEM, n = 6/Gruppe) stimuliert. Abbildung 3. Veränderungen der extrazellulären Matrixsynthese (Kollagen und Proteoglykane) der Chondrozyten-Agarose Hydrogele mechanisch unter 10% Stauchung Amplitude bei 1 Hz für 20 bis 60 min (Mittelwert ± SEM, n = 6/Gruppe) stimuliert.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

<html> Das beschriebene Verfahren für das Auftragen kontrollierter mechanische Reize auf Zellen seeded Agarose Hydrogele ermöglicht die direkte Untersuchung der Auswirkungen von dynamischen Druckkräfte auf Chondrozytenmetabolismus. Die Verwendung des kundenspezifischen Prüfstand in Verbindung mit den Halteringen versehen seitliche Beschränkung für die Konstrukte, um mögliche Probleme der Probe Kippen zu vermeiden. Die Verwendung von dead-gewichtete Belastung Platten durch Mengen Crews gesichert gewährleistet den direkten...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagens oder Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Ham-F-12 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SH3001002 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase A </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> C0130 </td><td></td></tr><tr><td> Protease </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> F1051 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbat </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A4034 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotika / Antimykotika </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop Canada Ltd </td><td> HEP001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> 93595 </td><td></td></tr><tr><td> Reichert Hell-Line Hämazytometer </td><td> Hausser Scientific </td><td> 1490 </td><td></td></tr><tr><td> Quant-iT PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> Papain aus Papaya Latex </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> P3125 </td><td></td></tr><tr><td> Ammoniumacetat </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A1542 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyldiaminetetraacetic Säure </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Dithiothreitol </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> 43819 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, Typ VII </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A9045 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Mesh-Screen (200) Filter </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> S4145 </td><td></td></tr><tr><td> Mach-1 Mikromechanische Tester </td><td> Biomomentum Inc. </td><td> V500cs </td><td></td></tr><tr><td> Compression Loading Jig </td><td> Custom-built </td><td></td><td> Ein Produkt ähnlich könnte Biomomentum Inc. geliefert werden </td></tr><tr><td> Falcon 24 Well Zellkulturplatten </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> B353047 </td><td></td></tr><tr><td> β-Flüssigkeits-Szintillationszähler </td><td> Beckman Coulter </td><td> LS6500 </td><td></td></tr><tr><td> [3H] Proline </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NET323005MC </td><td></td></tr><tr><td> [35S] Sulfur </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEX041005MC </td><td></td></tr></tbody></table>

mechanische stimulation der chondrozyten-agarose hydrogele

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Gelenkknorpel leidet unter einer begrenzten Kapazität, wenn Reparatur durch mechanische Insult oder abgebaute durch Krankheiten, wie Osteoarthritis beschädigt. Um diesem Mangel abzuhelfen, haben mehrere medizinische Eingriffe entwickelt. Eine solche Methode ist, um den beschädigten Bereich mit Tissue-Engineering Knorpel wieder auftauchen, aber die gezüchteten Gewebe in der Regel fehlen die biochemischen Eigenschaften und Haltbarkeit von nativen Knorpel Frage der langfristigen Überlebensfähigkeit. Dies beschränkt die Anwendung von Knorpelgewebe Engineering zur Reparatur von kleinen fokalen Fehlern, die sich auf das umgebende Gewebe, um die implantierte Material zu schützen. Um die Eigenschaften des entwickelten Gewebe zu verbessern, ist eine mechanische Stimulation eine beliebte Methode verwendet, um die Synthese von Knorpel extrazellulären Matrix sowie die resultierenden mechanischen Eigenschaften des gezüchteten Gewebe zu verbessern. Mechanische Stimulation gilt Kräfte auf das Gewebe konstruiert analog zu den erfahrensten in vivo. Diesbasiert auf der Prämisse, dass die mechanischen Umgebung, teilweise, reguliert die Entwicklung und Wartung von nativem Gewebe 1,2 basiert. Die am häufigsten angewandte Form der mechanischen Stimulation im Knorpel Tissue engineering ist Dynamikkompression bei physiologischem Stämme von etwa 5-20% bei einer Frequenz von 1 Hz 1,3. Mehrere Studien haben die Auswirkungen der dynamischen Kompression untersucht und haben gezeigt, dass es einen positiven Effekt auf Chondrozytenmetabolismus und Biosynthese haben, letztendlich auch die funktionellen Eigenschaften des entwickelten Gewebe 4-8. In diesem Papier zeigen wir die Methode zur mechanischen Stimulierung Chondrozyten-Agarose Hydrogel Konstrukten unter dynamischer Kompression und Analyse der Veränderungen in der Biosynthese durch biochemische und radioaktiven Assays. Dieses Verfahren kann auch ohne weiteres modifiziert werden, um alle möglicherweise induzierte Veränderungen in zelluläre Reaktion als Folge der mechanischen Reizen zu beurteilen.

Die Biosynthese von knorpeligen extrazellulären Matrix durch Chondrocyten können durch Einwirkung mechanischer Reize beeinflußt werden. Diese Methode beschreibt die Technik der Anwendung dynamisch Druckspannungen zu Chondrozyten in 3D-Konstrukte und die Auswertung der induzierten Veränderungen in Chondrozytenmetabolismus verkapselt.

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Gelenkknorpel weist eine begrenzte Reparationsfähigkeit auf, wenn er durch mechanische Einwirkungen geschädigt oder durch Erkrankungen wie Osteoarthritis abgebaut wird. Um dies zu beheben ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dynamische mechanische Druckbelastung auf mit Zellen besiedelte Hydrogels zu applizieren. Dazu werden Primärzellen durch Dissektion und enzymatische Verdauung von Knorpelschnitten gewonnen. Die isolierten Zellen werden in einem 2 % Agarose-Hydrogel eingekapselt, und die mit Zellen besiedelten Konstrukte werden mittels einer Biopsiepunch hergestellt.Die Proben werden anschließend in die Druckladevorrichtung eingelegt und in einen Mach-One-Mikromechanischen-Stimulator beladen. Anschließend wird eine dynamische Druckbelastung auf die mit Zellen besiedelten Konstrukte angewendet, um die Kollagen- und Proteoglykansynthese zu bewerten. Die Konstrukte werden nach der Inkubation radioaktiv markiert.Isotope werden durch Szintillationszählung der resultierenden Daten quantifiziert, die auf DNA normalisiert werden. Der Inhalt zeigt Veränderungen in der Synthese der extrazellulären Matrix nach mechanischer Stimulation. Obwohl diese Methode Einblicke in die Reaktion an Gegenstellen und die mechanische Stimulation ermöglichen kann.Sie kann auch auf andere Systeme wie Stammzellen, anderes Bindegewebe oder mechanorezeptive Zellen angewendet werden. Die hier verwendeten Mittelhand-Fingerknochen-Gelenke von skelettal ausgewachsenen Kühen wurden von einem örtlichen Schlachthof bezogen und in einem sterilen Präparationsbereich bearbeitet. In einer laminaren Luftströmungshaube werden die Knorpelschnitte in eine 100 Millimeter durchmessende Petrischale mit 20 Milliliter Hams F12, das 0,5 % Protease enthält, gegeben und zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert.Nach dem Inkubationsvakuum die Protease-Lösung abpipettieren und die Schnitte durch Zugabe von Hams F-12-Kulturmedium vorsichtig schwenkend spülen, anschließend das Medium abpipettieren. Diesen Waschschritt insgesamt dreimal wiederholen; nach dem dritten Waschvorgang das Kulturmedium vollständig im Vakuum abpipettieren.Gebe 20 Milliliter Hams F 12, das 0,15 % Collagenase A enthält, hinzu und inkubiere die Schalen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag pipettieren Sie die Zellsuspension durch einen 200-Maschen-Siebfilter in eine saubere Petrischale. Um den Filter zu waschen, pipettieren Sie zusätzliche fünf Milliliter Hams F 12 und sammeln die Durchflüssigkeit in derselben Schale. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine 50-Milliliter-Konischrohr.Spülen Sie die Petrischale mit 10 Milliliter Hams F 12 aus. Anschließend die Waschlösung dem kegelförmigen Reagenzglas hinzufügen. Das Reagenzglas bei Raumtemperatur sechs bis acht Minuten lang mit 600 bis 800 RCF zentrifugieren.Wenn der Lauf beendet ist, saugt man den Überstand vorsichtig ab, wobei man das Zellpellet nicht stören darf. Man resuspendiert das Pellet in 40 Milliliter Kulturmedium. Zentrifugiert das Gefäß bei 600 bis 800 RCF für sechs bis acht Minuten.Wiederholen Sie die Aspiration, die Resuspendierung und die Zentrifugation insgesamt dreimal, also noch zweimal zusätzlich, bevor die dritte Zentrifugation erfolgt. Resuspendieren Sie das Pellet durch Schütteln und entnehmen Sie einen 500-Mikroliter-Aliquot zur Zellzählung. Führen Sie während der dritten Zentrifugation die Zählung der lebensfähigen Zellen im Aliquot mittels Trypanblau-Ausschluss mit einem Hämozytometer und einem invertierten Lichtmikroskop durch.Danach, sobald die Zellzahl bestimmt wurde und der dritte Spin abgeschlossen ist, den Überstand abpipettieren und das Pellet resuspendieren. Das Pellet in einem Volumen Kulturmedium suspendieren, das der doppelten gewünschten Ansiedlungsdichte entspricht. Hier werden die Chondrozyten bei 20 mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter resuspendiert.Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die isolierten primären artikulären Chondrozyten in einem Aros-Hydrogel einzuschließen. Suspendieren Sie hierzu 0,8 Gramm Aros in 20 Milliliter steriler PBS in einem Becher. Stellen Sie den Becher auf eine Heizplatte, die auf 120 Grad Celsius eingestellt ist, sobald sich das Aros aufgelöst hat.Senken Sie die Temperatur auf 60 Grad Celsius in einem 50-Milliliter-Konikalrohr. Geben Sie gleiche Volumina der Zellsuspension und der doppelt konzentrierten, erhitzten Agro-Lösung zusammen. Hier werden beispielsweise fünf Milliliter Zellsuspension zu fünf Milliliter einer 4 %igen Agro-Suspension gegeben, um ein Endgemisch mit 2 %igem Agar-Hydrogel zu erhalten. Mischen Sie gründlich durch Pipettieren, wobei die Bildung großer Blasen vermieden werden sollte, da diese die Zellviabilität beeinträchtigen könnten.Überführen Sie anschließend vorsichtig 10 Milliliter der Chondrozyten-Agros-Mischung in eine Petrischale mit 60 Millimeter Durchmesser. Achten Sie erneut darauf, die Bildung großer Blasen zu vermeiden. Decken Sie die Schale mit dem Deckel ab.Anschießend die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Sobald die Mischung erstarrt ist, mit einer 4-Millimeter-Biopsiepunchvorrichtung so viele Chondrozyten-Agros-Hydrogelsproben wie möglich entnehmen. In der Regel ergibt sich eine Menge von 20 bis 30.Legen Sie die Proben mit einem Mikrometermaß in eine saubere Petrischale und notieren Sie Durchmesser und Höhe jeder Probe. Ideal sollte das Konstrukt etwa fünf Millimeter Höhe betragen; verwerfen Sie alle Proben aus einem Bereich, bei dem die Probenhöhe um mehr als 2 % abweicht. Überführen Sie die Proben in eine frische 60-Millimeter-Petrischale, die 10 Millimeter vollständiges Medium enthält. In diesem Teil des Protokolls werden die zellbesiedelten Konstrukte durch dynamische Kompression mechanisch stimuliert.Dies wird mithilfe einer speziell konstruierten Kompressionsvorrichtung erreicht, die den Aufbau mechanisch mit lasttragenden PLA-Elementen mit einem simulierten mikromechanischen System koppelt, das die aufgebrachte Kompressionsmenge steuert. Der schwierigste Aspekt des Verfahrens ist das Einlegen der Proben in die Kompressionsvorrichtung. Es ist wichtig, die Platten in der Vorrichtung korrekt einzustellen, um eine geeignete Anwendung dynamischer Druckbelastung sicherzustellen.Vor der Verwendung die metallischen Bestandteile der Kompressionsvorrichtung in einem Autoklaven sterilisieren. Die Kunststoffbestandteile über Nacht mit 70 %igem Ethanol und mindestens 15 Minuten lang mit UV-Licht sterilisieren. Um zu verhindern, dass die Chondrozyten-Aros-Hydrogel-Konstrukte umfallen.Platzieren Sie mit einer Pinzette 12 sterile Kunststoff-Retentionsringe in die Vertiefungen einer 24-Loch-Kulturplatte. Der Innendurchmesser der Retentionsringe sollte größer sein als der Durchmesser der Konstrukte. Arbeiten Sie hierbei vorsichtig mit der Pinzette.Überführen Sie die Chondro-Aros-Hydrogels aus der Petrischale in die 24-Loch-Platte, wobei jedes einzelne mit einem Haltering gesichert wird. Geben Sie 400 µL komplettes Medium zu jeder Probe hinzu. Bauen Sie anschließend die sterilisierte Kompressionsvorrichtung zusammen und befestigen Sie mithilfe von Sicherungsschrauben die PLA-Teile.Befestigen Sie die Kompressionsvorrichtung an der 24-Loch-Kulturplatte, um den Kontakt mit dem Hydrogel herzustellen und erneut zu sichern. Die Setzschraubenkonstruktion wird zur Erzeugung einer Deformation in diesem entlasteten Referenzzustand oder Null-Dehnungszustand verwendet. Bringen Sie die montierte Kompressionsvorrichtung in ein Mach-one-Mikromechanik-Testsystem mit der Positionierungssicherung ein.Befestigen Sie die Vorrichtung an der vertikalen Plattform und arretieren Sie sie mithilfe einer Sicherungsschraube. Entfernen Sie den Abstandshalter. Verwenden Sie die Mach-one-Software-Schnittstelle, um die Frequenz auf ein Hertz, die Amplitude auf 350 Mikrometer und die Anzahl der Zyklen auf 1.200 einzustellen.Dies bewirkt eine dynamische Druckbelastung mit einer Dehnungsamplitude von 10 % bezogen auf die ursprüngliche Höhe der Proben. Um die mechanische Stimulation zu beginnen, drücken Sie die Starttaste, den Mach-One-Aktor. Die am Kulturplattenhalter befestigte Belastungsvorrichtung verfügt über sechs Indenter, die sich auf und ab bewegen und dabei sechs Proben gleichzeitig stimulieren.Die unbehandelten Kontrollproben befinden sich ebenfalls in derselben Kulturplatte, werden jedoch nicht in die Vertiefungen der Vertiefungen eingesetzt. Wenn der Durchlauf abgeschlossen ist, ertönt ein Signalton des Mach One, und der Aktuator bewegt sich in den unbelasteten Referenzzustand. Nach Abschluss der mechanischen Stimulation ersetzen Sie den Abstandshalter.Lösen Sie die Stellschraube der Positioniernadel und nehmen Sie die Kompressionsvorrichtung und die Kulturplatte aus dem Prüfsystem neben dem Radio-Label. Pipettieren Sie jeweils fünf Mikrocurie Tritium-Prolin-Proteinkennzeichnung für die chondrozytenspezifische Kollagensynthese und S-35-Schwefel für die Proteoglykansynthese in jedes Gewässer. Inkubieren Sie die radioaktiv markierten Konstrukte 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um die radioaktiv markierten Hydrogel-Konstrukte zu gewinnen. Spülen Sie jeden Hydrogel-Konstrukt mit einer Pinzette dreimal durch Eintauchen in PBS. Um nicht eingebaute Isotope zu entfernen, legen Sie den gespülten Konstrukt in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.Fügen Sie anschließend 500 Mikroliter Papelösung den 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzu. Stellen Sie diese auf einen Heizblock und lassen Sie sie 72 Stunden lang bei 65 Grad Celsius verdauen. Nach Abschluss des Verdauungsvorgangs sollte die Probe relativ klar aussehen.Unmittelbar nach der Pap-Verdauung Aliquots von 100 Mikrolitern aus jeder Probe entnehmen, um den DNA-Gehalt mittels des Pico-Green-D-Assays zu bestimmen. Anschließend ein 100-Mikroliter-Aliquot jeder Probe entnehmen, um die inkorporierte Isotopenaktivität durch Flüssigszintillationszählung im Betastrahlungsbereich zu bestimmen. Die ermittelte Isotopenaktivität sollte dann für die Analyse auf den DNA-Gehalt normalisiert werden.Bovine Knorpelzellen-Aros-Hydrogel-Konstrukte, bestehend aus 2 % Aros mit 10 × 10⁶ Zellen pro Milliliter eingekapselter Zellen, wurden mechanisch stimuliert mit einer Amplitude von 10 % Druckdehnung bei einer Frequenz von einem Hertz für 20 bis 60 Minuten oder 1.200 bis 3.600 Zyklen. Anschließend wurden sie auf DNA-Gehalt und Synthese der extrazellulären Matrix mittels Radioisotopen-Inkorporation analysiert.Wie hier zu sehen ist, wurde die DNA- und die Synthese der extrazellulären Matrix in abhängiger Weise von der Dosis beeinflusst. Der DNA-Gehalt zeigte eine signifikante Abnahme um 35 % als Folge einer Stimulation über 20 oder 30 Minuten mit einem p-Wert von weniger als 0,01; eine Stimulation über 60 Minuten zeigte hingegen keine Wirkung. Die knorpelspezifische Kollagen- und Proteoglykansynthese wurde durch die Einlagerung von Tritium, Prolin bzw. S-35-Schwefel bestimmt.Diese zeigten signifikante Zunahmen von etwa 60 % als Reaktion auf 20 oder 30 Minuten Stimulation mit einem p-Wert von weniger als 0,01; 60 Minuten Stimulation zeigten keinen beobachtbaren Effekt. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hydrogel-Kulturen mechanisch durch dynamische Abformung stimulieren kann, und wie man dieses Protokoll für ähnliche Anwendungen anpassen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

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