Name: Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-27T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Erfahren Sie die dynamische mechanische Kompression von Chondrozyten in Agarose-Hydrogelen zur Untersuchung von Kollagen- und Proteoglykansynthese. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in den Stoffwechsel von Knorpelzellen unter mechanischer Belastung.

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Ein. Isolation of Primary Chondrozyten Ernte 10-15 volle Dicke Knorpel Scheiben von den Gelenkflächen des tierischen Gelenken (zB das Mittelhandknochen-Phalangealgelenk von ausgewachsenem Skelett Kühen von einem lokalen Schlachthof gewonnen). <ol><li> Ort Knorpel Scheiben in einer 100 mm Petrischale und Inkubieren in 20 ml 0,5% Protease in Ham-F-12 (w / v) für 2 Stunden bei 37 ° C. Spülen Sie drei Mal in Ham-F-12 Kulturmedien und inkubieren mit 20 ml 0,15% Collagenase A in Hams F-12 Kulturmedien über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Filtern der Zellsuspension durch ein 200 mesh-Sieb-Filter in einen sauberen Teller. Waschen Sie den Filter mit 5 ml Ham F-12 und zu dem Gericht. Übertragen der Zellsuspension in ein 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Petrischale mit 10 ml Ham F-12 und zu dem konischen Rohr. </li><li> Zentrifugieren bei 600-800 rcf für 6-8 min bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand, wodurch nicht th störene Zellpellet und in 40 ml Ham-F-12 Kulturmedium erneut zu suspendieren. </li><li> Zentrifugieren bei 600-800 rcf für 6-8 min. </li><li> Wiederholen Schritte 1.4 und 1.5 noch zweimal mit insgesamt 3 mal. Vor dem Zentrifugieren zum dritten Mal, das Pellet über Agitation und erhalten eine 500 ul Aliquot zur Zellzählung. </li><li> Zählen lebensfähigen Zellen unter Verwendung des Trypan-Blau-Ausschluss-Methode 9 mit einem Hämozytometer und eines invertierten Lichtmikroskops. </li><li> Überstand und resuspendieren des Pellets in einem Volumen von Ham-F-12 Medium, um den gewünschten Einsaatdichte verdoppeln (z. B. 20 x 10 6 Zellen / ml für eine Endkonzentration von 10 x 10 6 Zellen / ml nach der Verkapselung). </li></ol> 2. Chondrozyten-Agarose Hydrogel Encapsulation <ol><li> Wärme 0,8 g autoklavierten Typ VII Agarose in 20 ml sterilem 1x PBS (pH 7,4) auf einer Heizplatte bei 120 ° C bis zur Auflösung. Einmal gelöst, die Hitze auf 60 ° C höhere Temperaturen als will beeinträchtigen die Lebensfähigkeit der Zellen. </li><li> In einem 50 ml konischen Röhrchen wird gründlich gemischt gleichen Volumina der Zellsuspension mit der doppelten gewünschten Konzentration aus Agarose (z. B. 4% Agarose Suspension für eine abschließende 2% Agarose Hydrogel). Vermeiden Sie die Erstellung von großen Blasen, wie sie die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen können und bauen Lebensdauer. </li><li> Sorgfältig Aliquot von 10 ml der Chondrozyten-Agarose Mischung in eine 60 mm Petrischale Durchmesser, unter Vermeidung der Bildung großer Blasen. </li><li> Lassen Sie stehen für 30 min bei Raumtemperatur bis geliert. </li><li> Zu erhalten, wie viele Chondrozyten-Agarose Hydrogel Proben nach Bedarf (typischerweise 20-30) mit einem 4 mm Biopsiestanze. </li><li> Messung und Aufzeichnung der physikalischen Abmessungen (Durchmesser und Höhe) von repräsentativen Proben mit einem Mikrometer. Konstrukte sollte etwa 5 mm betragen in der Höhe, verwerfen Proben aus einem Bereich, wo der Probenhöhe Varianz größer als 2% erhalten. </li><li> Übertragen Proben zu einem neuen 60 mm Petrischale und Ergänzungmit 10 ml komplettem Medium (z. B. 20% fötalem Rinderserum in Ham-F-12 Kulturmedium mit 20 mM HEPES, 100 ug / ml Ascorbinsäure und 2x Antibiotika / Antimykotika). </li></ol> 3. Mechanische Stimulation und Radiomarkierung von Chondrozyten-Agarose Hydrogele <ol><li> Autoklaven werden die metallischen Komponenten des Kompressions-rig. Sterilisieren Sie die Kunststoffteile mit 70% Ethanol (über Nacht) und UV-Licht (mindestens 15 min). </li><li> Konstrukte Umfallen, mit Pinzette Platz 12 sterile Plastik Halteringe (mit einem Innendurchmesser größer als der Durchmesser Konstrukt) (n = 6, Proben und Kontrollen) innerhalb der Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte zu halten. </li><li> Mit einer Pinzette, transferieren es vorsichtig die Chondrozyten-Agarose Hydrogele aus der Petrischale auf den 24-Well-Platte, die Sicherung jedes in einem Haltering. </li><li> Übertragen 400 ul komplette Medien (zB 20% FBS in Ham-F-12 Kulturmedium mit 20 mM HEPES, 100 ug / ml Ascorbinsäure und2x Antibiotika / Antimykotika) zu jedem Probenbehälter. </li><li> Montieren Sie die sterilisiert Kompression rig (Abbildung 1) und befestigen Sie die Platten mit Stellschrauben. Bringen Sie die Kompression rig auf die 24-well Platte. </li><li> Lösen und wieder sichern die Stellschrauben Platte-Hydrogel-Kontaktlinsen (spannungslosen Zustand) zu etablieren. </li><li> Legen Sie die zusammengebauten Kompression rig in eine Mach-1 Mikromechanische Testing System. Sichere rig auf die vertikale Stufe über Fixierstift und einrasten mit Stellschraube. Entfernen Sie den Abstand jig. </li><li> Anwenden dynamischen Druckbelastung an gewünschten Amplitude (z. B. 10% Dehnung Amplitude auf der ursprünglichen Höhe der Proben basierend), Frequenz (zB 1 Hz) und Dauer oder Anzahl der Zyklen (zB Zeitintervallen bis zu 60 min). </li><li> Nach Abschluss der mechanischen Stimulation, ersetzen Sie den Abstand jig, lösen Sie die Fixierstift Stellschraube und entfernen Sie die Kompression rig und Kultur Platte aus dem Mach-1 Mikromechanische Testing System. </li&gt; <li> Radiomarkierung Zell-Hydrogel-Konstrukte durch Ergänzung der Medien mit 5 uCi gewünschte Isotop (zB [3 H]-Prolin-Protein-Label für Chondrozyten-spezifische Kollagen-Synthese und [35 S]-Schwefel für Proteoglykan-Synthese). </li><li> Inkubieren der radiomarkierten Konstrukten für 24 h bei 37 ° C, 5% CO 2 10. </li><li> Ernten Sie die radioaktiv markierten Hydrogel Konstrukten und spülen 3 mal in 1x PBS (pH 7,4) auf eine nicht rechtsfähige Isotop entfernen. Ausgewählte Proben unter Verwendung von Papain (40 ug / ml in 20 mM Ammoniumacetat, 1 mM ethyldiaminetetraacetic Säure und 2 mM Dithiothreitol bei 65 ° C für 72 h). </li><li> Assay Digest für DNA-Gehalt mit dem PicoGreen Farbstoff Assay 11 und eingebauten Isotops Aktivität, normiert auf DNA-Gehalt von β-Flüssig-Szintillationszählung 12,13 unmittelbar folgenden Papainverdau. </li></ol> Hinweis: Der Kauf und die Entsorgung von radioaktiven Materialien (Abfälle Isotope und Artikeldie möglicherweise in Kontakt radioaktiver Stoffe gekommen sind) müssen den einschlägigen institutionellen (und / oder staatlichen) Vorschriften und Verfahren für die sichere Handhabung und Entsorgung von radioaktiven Substanzen. 4. Repräsentative Ergebnisse Bovine Gelenkchondrozytenprobe-Agarose Hydrogele Konstrukte (2% Agarose mit 10 x 10 6 Zellen / ml eingekapselten Zellen) wurden mechanisch mit einer Amplitude von 10% Stauchung bei einer Frequenz von 1 Hz für 20 bis 60 min (oder 1.200 bis 3.600 Zyklen angeregt ) und im Hinblick auf DNA-Gehalt und extrazellulären Matrix-Synthese durch Einbau Radioisotop. Und extrazellulären Matrix-DNA-Synthese wurde in einer Dosis-abhängigen Weise beeinflusst. DNA-Gehalt zeigte eine signifikante Abnahme von 35% als Ergebnis von 20 oder 30 min der Stimulation (p &lt;0,01), während 60 min Stimulation zeigte keinen Effekt (Abb. 2). Knorpel-spezifische Kollagen und Proteoglykan-Synthese (bestimmt durch [3 H]-Prolin und[35 S]-Schwefel Einarbeitung jeweils) zeigten signifikante Anstiege von etwa 60% in Reaktion auf 20 bis 30 min der Stimulation (p &lt;0,01), 60 min mit der Stimulation aufweist keinen beobachtbaren Effekt (Abb. 3). <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> . Abbildung 1 Schematische Darstellung des custom-built dynamische Kompression rig zur Stimulierung Chondrozyten-Agarose Konstrukte. Links: Assembled rig. Rechts: Explosionszeichnung zeigt Einzelkomponenten. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Veränderungen in der DNA-Gehalt der Chondrozyten-Agarose Hydrogele mechanisch unter einer 10% Stauchung Amplitude bei 1 Hz für 20 bis 60 min (Mittelwert ± SEM, n = 6/Gruppe) stimuliert. Abbildung 3. Veränderungen der extrazellulären Matrixsynthese (Kollagen und Proteoglykane) der Chondrozyten-Agarose Hydrogele mechanisch unter 10% Stauchung Amplitude bei 1 Hz für 20 bis 60 min (Mittelwert ± SEM, n = 6/Gruppe) stimuliert.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

<html> Das beschriebene Verfahren für das Auftragen kontrollierter mechanische Reize auf Zellen seeded Agarose Hydrogele ermöglicht die direkte Untersuchung der Auswirkungen von dynamischen Druckkräfte auf Chondrozytenmetabolismus. Die Verwendung des kundenspezifischen Prüfstand in Verbindung mit den Halteringen versehen seitliche Beschränkung für die Konstrukte, um mögliche Probleme der Probe Kippen zu vermeiden. Die Verwendung von dead-gewichtete Belastung Platten durch Mengen Crews gesichert gewährleistet den direkten...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagens oder Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Ham-F-12 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SH3001002 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase A </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> C0130 </td><td></td></tr><tr><td> Protease </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> F1051 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbat </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A4034 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotika / Antimykotika </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop Canada Ltd </td><td> HEP001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> 93595 </td><td></td></tr><tr><td> Reichert Hell-Line Hämazytometer </td><td> Hausser Scientific </td><td> 1490 </td><td></td></tr><tr><td> Quant-iT PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> Papain aus Papaya Latex </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> P3125 </td><td></td></tr><tr><td> Ammoniumacetat </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A1542 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyldiaminetetraacetic Säure </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Dithiothreitol </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> 43819 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, Typ VII </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A9045 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Mesh-Screen (200) Filter </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> S4145 </td><td></td></tr><tr><td> Mach-1 Mikromechanische Tester </td><td> Biomomentum Inc. </td><td> V500cs </td><td></td></tr><tr><td> Compression Loading Jig </td><td> Custom-built </td><td></td><td> Ein Produkt ähnlich könnte Biomomentum Inc. geliefert werden </td></tr><tr><td> Falcon 24 Well Zellkulturplatten </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> B353047 </td><td></td></tr><tr><td> β-Flüssigkeits-Szintillationszähler </td><td> Beckman Coulter </td><td> LS6500 </td><td></td></tr><tr><td> [3H] Proline </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NET323005MC </td><td></td></tr><tr><td> [35S] Sulfur </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEX041005MC </td><td></td></tr></tbody></table>

mechanische stimulation der chondrozyten-agarose hydrogele

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Gelenkknorpel leidet unter einer begrenzten Kapazität, wenn Reparatur durch mechanische Insult oder abgebaute durch Krankheiten, wie Osteoarthritis beschädigt. Um diesem Mangel abzuhelfen, haben mehrere medizinische Eingriffe entwickelt. Eine solche Methode ist, um den beschädigten Bereich mit Tissue-Engineering Knorpel wieder auftauchen, aber die gezüchteten Gewebe in der Regel fehlen die biochemischen Eigenschaften und Haltbarkeit von nativen Knorpel Frage der langfristigen Überlebensfähigkeit. Dies beschränkt die Anwendung von Knorpelgewebe Engineering zur Reparatur von kleinen fokalen Fehlern, die sich auf das umgebende Gewebe, um die implantierte Material zu schützen. Um die Eigenschaften des entwickelten Gewebe zu verbessern, ist eine mechanische Stimulation eine beliebte Methode verwendet, um die Synthese von Knorpel extrazellulären Matrix sowie die resultierenden mechanischen Eigenschaften des gezüchteten Gewebe zu verbessern. Mechanische Stimulation gilt Kräfte auf das Gewebe konstruiert analog zu den erfahrensten in vivo. Diesbasiert auf der Prämisse, dass die mechanischen Umgebung, teilweise, reguliert die Entwicklung und Wartung von nativem Gewebe 1,2 basiert. Die am häufigsten angewandte Form der mechanischen Stimulation im Knorpel Tissue engineering ist Dynamikkompression bei physiologischem Stämme von etwa 5-20% bei einer Frequenz von 1 Hz 1,3. Mehrere Studien haben die Auswirkungen der dynamischen Kompression untersucht und haben gezeigt, dass es einen positiven Effekt auf Chondrozytenmetabolismus und Biosynthese haben, letztendlich auch die funktionellen Eigenschaften des entwickelten Gewebe 4-8. In diesem Papier zeigen wir die Methode zur mechanischen Stimulierung Chondrozyten-Agarose Hydrogel Konstrukten unter dynamischer Kompression und Analyse der Veränderungen in der Biosynthese durch biochemische und radioaktiven Assays. Dieses Verfahren kann auch ohne weiteres modifiziert werden, um alle möglicherweise induzierte Veränderungen in zelluläre Reaktion als Folge der mechanischen Reizen zu beurteilen.

Die Biosynthese von knorpeligen extrazellulären Matrix durch Chondrocyten können durch Einwirkung mechanischer Reize beeinflußt werden. Diese Methode beschreibt die Technik der Anwendung dynamisch Druckspannungen zu Chondrozyten in 3D-Konstrukte und die Auswertung der induzierten Veränderungen in Chondrozytenmetabolismus verkapselt.

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Gelenkknorpel weist eine begrenzte Reparationsfähigkeit auf, wenn er durch mechanische Einwirkungen geschädigt oder durch Erkrankungen wie Osteoarthritis abgebaut wird. Um dies zu beheben ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dynamische mechanische Druckbelastung auf mit Zellen besiedelte Hydrogels zu applizieren. Dazu werden Primärzellen durch Dissektion und enzymatische Verdauung von Knorpelschnitten gewonnen. Die isolierten Zellen werden in einem 2 % Agarose-Hydrogel eingekapselt, und die mit Zellen besiedelten Konstrukte werden mittels einer Biopsiepunch hergestellt.Die Proben werden anschließend in die Druckladevorrichtung eingelegt und in einen Mach-One-Mikromechanischen-Stimulator beladen. Anschließend wird eine dynamische Druckbelastung auf die mit Zellen besiedelten Konstrukte angewendet, um die Kollagen- und Proteoglykansynthese zu bewerten. Die Konstrukte werden nach der Inkubation radioaktiv markiert.Isotope werden durch Szintillationszählung der resultierenden Daten quantifiziert, die auf DNA normalisiert werden. Der Inhalt zeigt Veränderungen in der Synthese der extrazellulären Matrix nach mechanischer Stimulation. Obwohl diese Methode Einblicke in die Reaktion an Gegenstellen und die mechanische Stimulation ermöglichen kann.Sie kann auch auf andere Systeme wie Stammzellen, anderes Bindegewebe oder mechanorezeptive Zellen angewendet w

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein 3D-System zur Kultivierung menschlichen Chondrozyten in ein hohes Maß an Gelenkflüssigkeit beschrieben. Synovialflüssigkeit spiegelt den natürlichen Mikroumgebung für Gelenkknorpel, und kann leicht erreicht werden und gespeichert werden. Dieses System kann daher für die Untersuchung Knorpelregeneration und zum Screening von Therapeutika zur Behandlung von Arthritis verwendet werden.

Ein 3D-System für Züchtung menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit

Wir haben eine neuartige mechanische Belastung Bioreaktor uniaxialen oder biaxialen mechanischen Belastung zu einer Knorpel Biokomposit können vor der Transplantation in eine Anwendung Gelenkknorpeldefekt.

Entwurf eines Biaxiale Mechanische Belastung Bioreaktor für Tissue Engineering

Ein bioprinter wurde verwendet, um strukturierte Hydrogele auf einem Opfer-Form zu erstellen. Das Poloxamer Form wurde mit einem zweiten Hydrogel verfüllt und dann eluiert, so dass Hohlräume, die mit einem dritten Hydrogel gefüllt wurden. Diese Methode verwendet schnelle Elution und gute Bedruckbarkeit von Poloxamers zu komplexen Architekturen aus Biopolymeren zu generieren.

Drucken Thermoresponsive Reverse-Formen für die Erstellung von Gemusterte Zweikomponenten-Hydrogele für 3D Zellkultur

Die Knorpelreparatur stellt eine ungelöste medizinische Herausforderung dar und zellbasierte Ansätze zur Entwicklung von menschlichem Gelenkknorpel sind eine vielversprechende Lösung. Hier beschreiben wir dreidimensionale (3D) biomimetische Hydrogele als ideales Werkzeug für die Expansion und Reifung menschlicher Gelenkchondrozyten.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Injizierbare tissue engineering Gerüst aus Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Mikroteilchen (PNIPAAm-g-CS) -haltigen Alginat besteht, wurde hergestellt. Die Haftfestigkeit, Quelleigenschaften und Biokompatibilität in vitro sind in dieser Studie untersucht. Die Charakterisierungstechniken hier entwickelt, können auf andere thermogelierende Systeme anwendbar sein.

Synthese von thermogelierenden Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Composites mit Alginate Mikroteilchen für Tissue Engineering

Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Herstellung und Charakterisierung einer pneumatisch betätigten mikrofluidischen Vorrichtung für die Chondrozytenkompression.

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Die Knochentherapie über endochondrale Ossifikation durch Implantation von künstlichem Knorpelgewebe aus mesenchymalen Stammzellen hat das Potenzial, die Nachteile konventioneller Therapien zu umgehen. Hyaluronsäure-Hydrogele sind wirksam bei der Skalierung gleichmäßig differenzierter Knorpeltransplantate sowie bei der Schaffung von integriertem Knochen mit Vaskularisierung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo.

Integrierte Knochenbildung durch in vivo ennochondrale Ossifikation mit mesenchymalen Stammzellen

Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von chondrozytären Sphäroiden, indem Zellen unter Verwendung der Schwerkraft unter Bedingungen mit geringer Adhäsion zu Sphäroiden aggregiert werden, gefolgt von der Kultivierung der resultierenden Sphäroide in Mini-Bioreaktoren.

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Ein neues in vitro-System für die gleichzeitige Laden vier Sehnen in der Kultur beschrieben wird.

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Erfahren Sie die dynamische mechanische Kompression von Chondrozyten in Agarose-Hydrogelen zur Untersuchung von Kollagen- und Proteoglykansynthese. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in den Stoffwechsel von Knorpelzellen unter mechanischer Belastung.

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

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