Name: Extraktion von Tissue Antigens für funktionelle Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Lernen Sie die Extraktion von Gewebenantigenen für funktionelle T-Zell-Assays. Diese Methode verwendet ein BAW-Gemisch zur Homogenisierung und ermöglicht die sichere Messung von T-Zell-Proliferation und Zytokinsekretion in vitro.

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Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) und der Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) und der betrieblichen Infrastruktur Schema des viktorianischen Regierung unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Tom Mandel Inseltransplantation Programm Inselisolierung Team für die Bereitstellung der menschlichen Geweben. Menschliche Gewebe wurden gesammelt und mit lokalen ethischen Zulassung verwendet (St. Vincent Hospital HREC-A 011/04 und St. Vincent Gesundheit HREC-A 135/08).

Ein. Vorbereiten Milzgewebe <ol><li> Hinweis-all menschlichem Material sollten als potenziell infektiös und alle Verfahren sollten in einer Klasse II Laminar Flow Cabinet durchgeführt werden behandelt werden. Verwendung steriler Schere und Pinzette Fett und Bindegewebe aus Milz Abschnitte (~ 1-2 cm groß) und schneiden Sie so viel von der äußeren Kapsel Material wie möglich. </li><li> Schneiden Sie ein kleines Stück (1-2 cm 3) von Milzgewebe und platzieren Sie jedes Stück in einem sterilen 50 ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Snap-frieren die Gewebestücke durch Eintauchen in flüssigen N 2. </li><li> Lagerung bei -80 ° C. Ein ähnliches Protokoll ist für andere Gewebe (n). </li></ol> 2. Herstellung von Human Islet für Storage <ol><li> Kultur Inseln in CMRL Medien. Sammle Inselchen in einem 10 ml konischen Boden Rohr und waschen zweimal in PBS durch Zentrifugation bei 1.500 rpm für 5 min. Abgießen, PBS und lassen Sie das restliche Puffer, indem das invertierte Rohr kurz auf einem Papiertuch. Achten Sie darauf,um die Inseln zu vertreiben. </li><li> Nach dem Abtropfen, re-cap die Röhre und Snap-freeze in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C. </li></ol> 3. Vorbereiten Extract <ol><li> Bereiten BAW-Mix (10:30:60% v / v) und bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Schlauch von -80 ° C. Bei Raumtemperatur auftauen. </li><li> Ausreichend eiskalten BAW, um das Stück von Gewebe zu decken. Für Inselchen verwenden 3-5 ml. Für Milzgewebe verwenden 10-20 ml je nach Größe des Stückes von Gewebe. </li><li> Montieren Sie den Gewebehomogenisator. Reinigen durch &quot;Homogenisieren&quot; 10-20 ml 70% Ethanol / Wasser. </li><li> Homogenisieren des Gewebes in mehrere Bursts, nach dem Aufsetzen des Homogenisators Sonde in das Rohr mit dem Gewebe und BAW Lösung. Halten Sie das Rohr in einem Eis-Eimer danach. </li><li> Reinigen Sie den Homogenisator zwischen den Proben, durch Homogenisieren 10-20 ml 70% Ethanol / Wasser und dann BAW-Puffer. Dies verhindert Kreuzkontamination von Gewebe zwischen samples.Dismantleand sauber mit 70% Ethanol / Wasser nach unsE. </li><li> Wenn ein Extrakt, der nur lösliche Material benötigt, zentrifugieren homogenisierte Gewebeextrakt bei 4.000 Upm bei RT für 10 min. Wenn ein Rohextrakt mehr erforderlich ist, bei 1000 Upm bei RT für 5 min drehen. Die am besten geeignete Methode zur Extraktion der BAW-unlösliche Proteine ​​hängt vom nachgeschaltete Analyse der Proteine. Für den Einsatz in der funktionellen immunologischen Assays würden wir vorschlagen, versuchen, die unlösliche Fraktion in 8 M Harnstoff aufzulösen, wie wir zuvor gefunden haben dies gut verträglich zu sein 6. </li><li> Überstand in ein sauberes Röhrchen und legte es auf Eis. </li><li> Bestimmung der Konzentration von Protein in der Extrakt unter Verwendung eines BCA-Assay oder ähnliches. </li></ol> 4. Gefriertrocknung Auszüge <ol><li> Je nach der Masse des Proteins erforderlich (dh, 100 ug pro Röhrchen), verdünnt das Homogenat und abzugeben entsprechend Aliquots in 5,0 ml steriler markierten, Falcon (12x75 mm) Tuben. Wir verwenden häufig 100 ug / Rohr. </li><li> Verwenden Sie eine 18-20 Gauge sterilen Injektionsnadel bis 3 Löcher in der Kappe jeder Röhre zu machen. </li><li> Frieren Rohre entweder, indem sie auf Trockeneis für ~ 10 min oder in einem -80 ° C Gefrierschrank für&gt; 1 Stunde. Lagerung bei -80 ° C bis zum auf dem Lyophilisator setzen. </li><li> Schalten Sie Gefriertrockner und ermöglichen äquilibrieren (-100 ° C). Dieser Vorgang dauert ca. 30 min. </li><li> Je nach Volumen kann Gefriertrocknung innerhalb von 3 Stunden abgeschlossen sein, aber wir routinemäßig verlassen unsere Proben über Nacht. </li><li> Nach Beendigung des Trocknungszyklus, Abschaltung Vakuumpumpe und langsam ermöglichen Druck in der Kammer. Entfernen Rack. </li><li> In einer sterilen Haube, entfernen Sie die Lochkappen aus den Rohren und durch neue ersetzen (Falcon 352.032). </li><li> Röhrchen bei -20 ° C. Proben können in Kulturmedien oder andere Puffer rekonstituiert werden, und verwendet in Funktion oder biochemischen Assays. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt die Färbung eines ProteinsGel mit Extrakt aus der Milz und Inselchen erschöpft Pankreasgewebe (beschriftet acinar) und gereinigten menschlichen Inseln (mit Inseln) geladen. Die Ergebnisse zeigen eine gute Darstellung der Proteine ​​verschiedener Molekulargewicht für jedes Gewebe. Die Kapazität Gewebeextrakten die menschliche T-Zell-Proliferation zu stimulieren, wurde getestet unter Verwendung eines CFSE basierenden Proliferationsassay 7 (Abbildung 2). Die PBMC in diesem Test verwendet wurden von einem Individuum mit Diabetes Typ 1 isoliert. Das Ausmaß der Reaktion wird als Verhältnis der Anzahl der Zellen pro CFSE dim 5000 CD4 +, CFSE hellen Zellen ohne Antigen exprimiert: der CFSE dim Zellen pro 5000 CD4 +, CFSE hellen Zellen mit Antigen aus Dreifachproben 7. Die Ergebnisse zeigen eine schwache, aber nachweisbare, Proliferation als Reaktion auf Azinuszellen (CD1 = 3,5) und eine stärkere Reaktion auf islet Extrakt (6,8). Inaktivierten Influenza-Virus (CDI = 142,6) als enthaltenpositive Kontrolle. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" /> Abbildung 1. Protein-Gel. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ergebnisse einer CFSE-basierte Proliferationsassay gegen acinar und Inselchen Extrakt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

<ol><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li>
<li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+CD4%2B+T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4%2B+T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy%2C+Pre-diabetic%2C+and+Diabetic+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li>
<li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li>
<li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+preparations+of+GAD65%2C+proinsulin%2C+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes%3A+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li>
<li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, weil wir einen Auszug aus menschlichem Gewebe, die frei von giftigen Chemikalien wie Wasch war erzeugen wollte. Insbesondere haben wir es verwendet, um Auszüge aus menschlichem Gewebe, die in Tests des menschlichen Immunsystems in vitro verwendet werden vorzubereiten. Extrakte hergestellt unter Verwendung dieses Protokolls können gleichermaßen in einem Puffer rekonstituiert werden und für viele biochemische Analysen, wie Western-Blot oder Flüssigkeitschromatographie. Dies mach...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 5 ml 12 x 75 mm sterile Polystyrolröhrchen </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Caps für Rohre Polystyrolröhrchen (oben) </td><td> BD Falcon </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml sterilen Röhrchen </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Mallinckradt Chemicals </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-ol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537.993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogenisator: PRO200 </td><td> Bio-Strategie </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 mm Sägezahngenerator </td></tr><tr><td> Lyophilizer </td><td></td><td></td><td> Virtis, Benchtop 4K </td></tr><tr><td> Sterile Nadel 18-20 Gauge </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 Medium </td><td> Sigma </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Spezifisch Reagenzien und Ausrüstung.

extraktion von tissue antigens für funktionelle assays

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Viele der Antigen-Targets der adaptiven Immunantwort, durch B-und T-Zellen erkannt wird, wurden nicht 1 definiert. Dies gilt insbesondere bei Autoimmunerkrankungen und Krebs 2. Unser Ziel ist es, die Antigene von menschlichen T-Zellen in der Autoimmunerkrankung Typ-1-Diabetes 1,3,4,5 erkannt zu untersuchen. Die menschliche T-Zell-Antworten gegen Gewebe, wo die Antigene durch T-Zellen erkannt werden nicht identifiziert analysieren wir ein Verfahren entwickelt, um Protein-Antigenen aus humanem Gewebe in einem Format, das kompatibel mit funktionellen Assays 6 ist extrahieren. Zuvor T-Zell-Antworten auf ungereinigten Gewebeextrakten konnte nicht gemessen werden, da die Extraktions-Verfahren liefern ein Lysat, daß Waschmittel, die toxisch für humane periphere mononukleare Zellen enthalten sein. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus humanen Geweben in einem Format, das nicht toxisch für humane T-Zellen. Das Gewebe wird in einem Gemisch aus Butan-1-ol, Acetonitril und homogenisiert water (BAW). Die Proteinkonzentration in der Gewebeextrakt gemessen wird und ein bekannter Masse von Protein wird in Röhrchen aliquotiert. Nach der Extraktion werden die organischen Lösungsmittel durch Lyophilisierung entfernt. Lyophilisierte Gewebeextrakten gespeichert, bis sie benötigt werden. Zur Verwendung in Tests der Immunfunktion eine Suspension von Immunzellen in geeigneten Kulturmedien, kann direkt an die lyophilisierte Extrakt zugesetzt werden. Proliferation und Zytokin-Produktion durch PBMC in Reaktion auf Extrakte hergestellt unter Verwendung dieses Verfahrens wurden leicht gemessen. Daher ermöglicht unser Verfahren die rasche Herstellung von menschlichem Gewebe-Lysaten, die als Quelle von Antigenen bei der Analyse der T-Zell-Reaktionen verwendet werden kann. Wir schlagen vor, dass diese Methode die Analyse der adaptiven Immunantwort auf Gewebe in der Transplantationsmedizin, Krebs und Autoimmunität erleichtern.

Ein einfaches Protokoll zur Herstellung von menschlichem Gewebe-Extrakten, die als Quelle von Antigenen in funktioneller T-Zell-Assays verwendet werden beschrieben. Diese Methode ermöglicht es T-Zellen-Reaktionen auf Gewebe stammenden Antigenen zu messenden<em&gt; In vitro</em&gt;.

Extraktion von Tissue Antigens für funktionelle Assays

Viele der Antigenziele der adaptiven Immunantwort, die von B- und T-Zellen erkannt werden, sind noch nicht definiert worden 1. Dies gilt insbesondere für Autoimmunerkrankungen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen Gewebeextrakt herzustellen, der mit funktionellen immunologischen Assays kompatibel ist. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Probe des betreffenden Gewebes gesammelt wird. Anschließend wird die Gewebeprobe in einer Mischung aus Butanol, Acetonitril und Wasser, oder BAW, homogenisiert.Nach der Bestimmung der Protein­konzentration wird der Extrakt portioniert und lyophilisiert, um Lösungsmittel zu entfernen. Schließlich wird der rekonstituierte Extrakt als Antigenquelle in Proliferations­assays oder Zytokin­sekretions­assays mit humanen T-Zellen verwendet. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber etablierten Verfahren wie der Detergenzlyse besteht darin, dass der Extrakt frei von toxischen Lösungsmitteln und Detergenzien ist.In diesem Protokoll müssen alle humanen Materialien als potenziell infektiös behandelt werden, und alle Verfahren sollten in einem Laminar-Fluss-Gerät der Klasse zwei durchgeführt werden. Entfernen Sie mithilfe steriler Scheren und Pinzetten Fett- und Bindegewebe von Milzabschnitten mit einer Größe von etwa ein bis zwei Zentimetern. Entfernen Sie so viel wie möglich vom äußeren Kapselmaterial.Schneiden Sie kleine Stücke von Milzgewebe ab und geben Sie jedes Stück in ein steriles 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Gefrieren Sie die Gewebestücke durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Um mit dem Verfahren zur Vorbereitung menschlicher Augenlinsen für die Kultur zur Lagerung zu beginnen.Die Augenlöcher in CMRL-Medium bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie die Augenlöcher in einem kegelförmigen 10-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang mit 1.500 U/min. Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Probe zweimal mit PBS; nach dem zweiten Waschschritt verwerfen Sie den Überstand.Entfernen Sie das PBS und lassen Sie die restliche Pufferlösung ab, indem Sie das umgedrehte Röhrchen kurz auf ein Papiertuch stellen. Achten Sie darauf, die Augen nicht zu lösen. Nach dem Abtropfen verschließen Sie das Röhrchen, gefrieren es sofort in flüssigem Stickstoff ein und lagern es bei minus 80 Grad Celsius.Um einen Gewebeextrakt herzustellen, entnehmen Sie zunächst ein Röhrchen mit dem Gewebe aus einer Temperatur von minus 80 Grad Celsius und bringen Sie es auf Raumtemperatur. Das Gewebe wird in einer Mischung aus Butanol, Acetonitril und Wasser, also BAW, homogenisiert, die zuvor hergestellt und bei vier Grad Celsius gelagert wurde. Geben Sie ausreichend eiskalte BAW hinzu, um das Gewebestück zu bedecken; für das im vorliegenden Beispiel verwendete Milzgewebe wurden 10 bis 20 Milliliter BAW verwendet.Montieren Sie den Gewebemischer. Reinigen Sie den Homogenisator, indem Sie 20 Milliliter 70 %igen Ethanol in Wasser homogenisieren. Anschließend führen Sie die Homogenisatorsonde in das Röhrchen mit dem Gewebe und der BAW-Lösung ein und homogenisieren das Gewebe in mehreren Impulsen.Stellen Sie das Röhrchen danach in einen sauberen Behälter, um eine Kreuzkontamination von Gewebeproben zu vermeiden. Reinigen Sie den Homogenisator zwischen den Proben gründlich, indem Sie 10 bis 20 Milliliter 70 %igen Ethanol in Wasser homogenisieren, gefolgt von BAW-Puffer-Zentrifugation. Der homogenisierte Gewebeextrakt bei Raumtemperatur.Wenn ein Extrakt, der nur lösliches Material enthält, benötigt wird, 10 Minuten bei 4.000 U/min zentrifugieren. Wenn ein groberer Extrakt benötigt wird, nach der Zentrifugation 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugieren, das Überstand auf ein sauberes Röhrchen überführen und auf Eis stellen. Die Proteinkonzentration im Extrakt wird anschließend mithilfe eines BCA-Assays oder eines ähnlichen Verfahrens bestimmt.Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die genaue Bestimmung der Proteinkonzentration im Extrakt, damit ein geeignetes Volumen des Extrakts lyophilisiert werden kann. Um die gewünschte Masse an Protein zu erhalten, verdünnen Sie zunächst den Homogenat entsprechend der benötigten Proteinkonzentration und geben Aliquote in beschriftete sterile Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von fünf Milliliter. In diesem Beispiel werden 100 Mikrogramm Protein pro Röhrchen veranschlagt.Unter Verwendung einer sterilen Nadel mit einer Größe von 18 bis 20 Gauge drei Löcher in den Verschluss jedes Röhrchens stechen, die Röhrchen einfrieren, indem sie etwa 10 Minuten lang auf Trockeneis gestellt werden, den Gefriertrockner einschalten und ihn etwa 30 Minuten lang auf minus 100 Grad Celsius equilibrieren lassen. Wenn der Gefriertrockner bereit ist, die Röhrchen in den Gefriertrockner stellen und die Vakuumpumpe einschalten.Abhängig vom Volumen des Extrakts kann das Gefriertrocknen innerhalb von drei Stunden abgeschlossen werden. Obwohl die Proben üblicherweise über Nacht stehen gelassen werden. Nach Beendigung des Trocknungszyklus schalten Sie die Vakuumpumpe aus und lassen langsam Druck in die Kammer ein.Entfernen Sie das Röhrchenröhrchen in einer sterilen Haube. Entfernen Sie die durchstochenen Verschlüsse von den Röhrchen und ersetzen Sie sie durch neue Verschlüsse. Lagern Sie die Röhrchen bei minus 20 Grad Celsius.Die Proben können später in Kultur, Medium oder anderen Puffern rekonstituiert und in Abhängigkeit von biochemischen Assays verwendet werden. Diese Abbildung zeigt die Färbung eines Proteingels, das mit Extrakten aus Augenfleck-abgereichertem Pankreasgewebe und gereinigten menschlichen Augenflecken beladen wurde. Diese Ergebnisse zeigen eine gute Darstellung von Proteinen mit unterschiedlichen molekularen Massen für jedes Gewebe. Die Fähigkeit von Asana- und Insel-Extrakten, die Proliferation menschlicher T-Zellen zu stimulieren, wurde mithilfe eines Proliferationsassays getestet, bei dem periphere mononukleäre Blutzellen oder PBMC mit dem fluoreszierenden Farbstoff CFSE markiert wurden. Zellen, die als Reaktion auf das Antigen proliferierten und dadurch eine Verringerung der CFSE-Intensität zeigten, wurden direkt per Durchflusszytometrie gemessen.Die in diesem Beispiel verwendeten PBMCs wurden von einer Person mit Typ-1-Diabetes isoliert. Die Stärke der C-Zellantwort wurde als Verhältnis der Anzahl CFSE-dunkler Zellen pro 5.000 CD4-positiver CFSE-heller Zellen ohne Antigen zur Anzahl CFSE-dunkler Zellen pro 5.000 CD4-positiver CFSE-heller Zellen mit Antigen aus dreifachen Proben ausgedrückt. Die Ergebnisse zeigen eine schwache, aber nachweisbare Proliferation als Reaktion auf Asana mit einem Zellteilungsindex (CDI) von 3,5.Es zeigte sich eine stärkere Reaktion auf den Auglet-Extrakt mit einem CDI von 6,8. Inaktiviertes Influenzavirus wurde als positiver Kontrollwert eingeschlossen, nachdem dieses Verfahren durchgeführt wurde. Weitere Methoden wie Ali Spot oder e Iza können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Zytokine als Reaktion auf gewebebedingte Antigene sezerniert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Small-scale Kernextrakten für funktionelle Assays von Gen-Expression Machineries

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Funktionelle Bewertung von Antikörper-sezernierenden B-Zellen mittels ELISpot-Assay

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