Die Messung der Antikörper Auswirkungen auf zelluläre Funktion von isolierten Kardiomyozyten

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist der Nachweis der kardiotropen Antikörper im Plasma von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie oder anderen Herzerkrankungen mit autoimmunem Hintergrund. Dies wird durch eine anfängliche Mini-Immunabsorption von Patientenplasma auf Anti-IgG-Spherossäulen erreicht, um in einem zweiten Schritt Immunglobulin G aufzureinigen. Ventrikuläre Kardiomyozyten werden aus adulten Wistar-Ratten isoliert und bilden die zelluläre Basis für diesen Bioassay.

Als nächstes werden die Kardiomyozyten an den Deckgläsern der Kammer befestigt und mit URA 2:00 AM gefärbt, um die Beobachtung von intrazellulärem Kalziumtransient während der Kontraktionen zu ermöglichen, dann wird das IgG des Patienten getestet, um seine Wirkung auf die Kontraktilität der Kardiomyozyten zu beobachten. Die Ergebnisse zeigen, ob das IgG eines Patienten tropische Antikörper enthält, basierend auf den Veränderungen der Kontraktilität und des Calciumtransienten in den isolierten Kardiomyozyten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Standard-Immunoassays zum Nachweis von Antikörpern besteht darin, dass sie unabhängig von einem spezifischen Antigen ist und dass sie es ermöglicht, zwischen stimulierenden und blockierenden Antikörpern zu unterscheiden.

Bei der Demonstration des Verfahrens erhalten Sie bei Google technische Unterstützung durch unser Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Mini-Immunabsorptionssäulen vor, indem Sie drei Milliliter Anti-IgG-Spheros pro zwei Milliliter Patienten-EDTA-Plasma in eine leere Econopak-Säule füllen. Platzieren Sie anschließend einen Filter auf den Anti-IgG-Spheros.

Schneiden Sie die untere Spitze der Säule auf und drücken Sie auf den Filter, um eine Durchflussrate von etwa einem Tropfen pro Sekunde zu erreichen. Waschen Sie dann die Säule dreimal mit einem Plasmavolumen von 0,9 %Natriumchlorid pipettieren Sie das Plasma in der Säule, wenn das Plasma vollständig in die Anti-IgG-Spheros-Wäsche mit dem gleichen Volumen von 0,9 % Natriumchlorid eingetaucht ist. Als nächstes pipettieren Sie ein Plasmavolumen von 0,2 molaren Glycinhydrochlorid bei einem pH-Wert von 2,8 in die Säule und lassen es in das Phos eintauchen.

Geben Sie dann ein weiteres Volumen Glycinhydrochlorid in die Säule. Sammeln Sie den Durchfluss in einem 15-Milliliter-Röhrchen und stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 mit 0,5 molaren Trishydrochlorid bei p pH 8,0 ein, um die Säule zu regenerieren. Waschen Sie es mit drei Plasmavolumina Glycinhydrochlorid nach einer abschließenden Wäsche mit zwei Volumina 0,9% Natriumchlorid.

Die Säule kann für die nächste Plasmaprobe zur Verwendung auf Kardiomyozyten verwendet werden. Die gesammelte IgG-Fraktion muss gegen einen experimentellen Puffer dialysiert werden, indem die IgG-Fraktion zunächst in ein Celluloseester-Dialysemembranröhrchen mit einem Molekulargewichts-Cutoff bei 100 Kilodalton gefüllt wird. Legen Sie dann das Röhrchen in einen Liter EB und rühren Sie langsam mit einem magnetischen Rühr bei vier Grad Celsius um. Nach acht Stunden übertragen Sie das Dialyseröhrchen in drei Liter frisches EB und dialysieren es nach der Dialyse für weitere 20 Stunden bei vier Grad Celsius.

Kochen Sie die Probe 30 Minuten lang bei 57 Grad Celsius in einem Wasserbad. Um die Komplementfaktoren zu inaktivieren, bestimmen Sie die Gesamt-IgG-Konzentration und bereiten Sie Aliquote vor, die jeweils 330 Mikrogramm IgG enthalten. Bei diesem Verfahren wird ein kalziumfreier Isolationspuffer gemäß dem beigefügten Manuskript hergestellt.

Füllen Sie dann 80 Milliliter IB in das obere Reservoir eines Thermostat-Lanor-Perfusionssystems und halten Sie den Puffer auf 37 Grad Celsius und belüften Sie ihn 30 Minuten lang mit 95 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid. Lösen Sie etwa 7.000 bis 10.000 Einheiten Kollagenase Typ zwei und 174 Milligramm fettsäurefreies BSA in 20 Millilitern auf. IB mit 112,5 mikromolarem Calciumchlorid und passen Sie bei Bedarf den pH-Wert des Isolationspuffers im oberen Reservoir an.

Als nächstes betäuben Sie eine Wistar-Ratte von 175 bis 200 Gramm mit Thiopental bei 375 Mikrogramm pro Kilogramm mit 2.500 IE Heparin, das der Thiopentallösung zugesetzt wird. Nach der Thorakotomie schneiden Sie das Herz vorsichtig mit einem intakten Aortenbogen heraus und übertragen es in eiskaltes, null Komma Prozent Natriumchlorid in eiskaltem Natriumchlorid. Entnehmen Sie das Blut und das umliegende Gewebe aus dem Herzen.

Übertragen Sie es dann auf frisches 0,9%iges Natriumchlorid und legen Sie die Aorta frei. Schalten Sie den Durchflussminderer des Langor-Systems ein, um eine Abtropfgeschwindigkeit von zwei bis drei pro Sekunde zu erreichen. Befestigen Sie dann das Herz an der Kanüle.

Perfundieren Sie es bis zu drei Minuten lang mit einer Durchflussrate von einem Tropfen pro Sekunde, um das restliche Blut auszuwaschen. Danach zirkulieren Sie das IB im LOR-System. Entnehmen Sie nun 20 Milliliter Puffer aus dem oberen Behälter.

Füllen Sie das Reservoir mit der Kollagenaselösung und füllen Sie so viel Puffer auf, wie erforderlich ist, um 80 Milliliter zu erreichen. Anschließend die Aufschlusslösung weitere 27 Minuten zirkulieren lassen. Als nächstes lösen Sie das Herz von der Kanüle.

Entfernen Sie die Vorhöfe und die Aorta und hacken Sie dann die Ventrikel in kleine Stücke. Lassen Sie den Aufschlusspuffer in das untere Reservoir laufen. Reduzieren Sie das Volumen auf maximal 40 Milliliter, um die gehackten Ventrikel 10 bis 15 Minuten lang unter der kontinuierlichen Belüftung mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid weiter zu verdauen.

Anschließend filtrieren Sie die Zellsuspension durch eine Gaze mit einer Maschenweite von 200 Mikrometern in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie schließlich den Kalziumgehalt der Zellen wieder her, indem Sie die Zellsuspension zwei Minuten lang bei 40 3 G zentrifugieren. Bei Raumtemperatur resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern.

IB mit 200 Mikromolen Calciumchlorid erneut zentrifugieren und die Zellen in 10 Millilitern resuspendieren. IB mit 500 Mikromolar Calciumchlorid. Nach einer abschließenden Zentrifugation und Reanimation suspendieren Sie die Kardiomyozyten in steril filtriertem EB auf eine Dichte von 50.000 Zellen pro Milliliter.

Beschichten Sie die Deckgläser in einer Kammer mit vier Vertiefungen mit 10 Mikrogramm Laminin pro Vertiefung und warten Sie, bis sie vollständig getrocknet sind. Füllen Sie dann einen Milliliter der Kardiomyozytensuspension in jede Vertiefung. Verdünnen Sie mit einer Mikropipette mit abgeschnittener Spitze die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur anhaften, verdünnen Sie 10 Mikroliter der ein Milligramm pro Milliliter fira 2:00 AM Stammlösung in fünf Millilitern, eb, und bewahren Sie die Färbelösung im Dunkeln auf.

Entfernen Sie dann den Puffer und die nicht befestigten Zellen von den Deckgläsern und pipettieren Sie 0,5 Milliliter der Färbelösung. Inkubieren Sie die Zellen jeweils 10 Minuten lang unter mäßigem Schütteln. Anschließend entfernen Sie die Färbelösung und waschen die Zellen einmal mit einem Milliliter EB.

Geben Sie dann bei diesem Verfahren 0,5 Milliliter EB in jede Vertiefung und legen Sie das Deckglas unter ein inverses Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Myozyten-Kalzium- und Kontraktilitätsaufzeichnungssystem verbunden ist. Positionieren Sie eine speziell angefertigte Elektrode mit einem Influx und einem Influxrohr in der ersten Vertiefung und super. Verschmelzen Sie die Kardiomyozyten mit einem Milliliter pro Minute eb.

Beginnen Sie die elektrische Stimulation bei 20 Volt, einem Hertz und fünf Millisekunden Dauer pro Impuls und lassen Sie die Zellen sich etwa zwei Minuten lang an die Stimulation anpassen. Wählen Sie einen intakten stäbchenförmigen Kardiomyozyten mit deutlicher Streifenbildung und konstanter Kontraktion und positionieren Sie ihn in der Mitte des Gesichtsfeldes. Öffnen Sie dann den Kamerakanal und richten Sie die Zelle horizontal im Videobereich aus, indem Sie den Cell-Framing-Adapter drehen und den Mikroskoptisch bewegen.

Passen Sie die Begrenzung der erkennenden Steuerelemente des Videobereichs an. Schalten Sie den Fluoreszenzkanal ein und zeichnen Sie 10 bis 15 Kontraktionen auf, um die anfängliche Zellverkürzung und Kalziumtransientität zu erhalten. Schalten Sie danach den Lichtkanal des Mikroskops aus, um ein Ausbleichen des Fluoreszenzflecks zu vermeiden.

Schalten Sie den Durchfluss von EB auf den Probenbypass mit einem Dreiwegeventil um und fusionieren Sie die Kardiomyozyten mit einem Milliliter Patienten-IgG. Stoppen Sie die Pumpe, kurz bevor die Luft den erreicht, schalten Sie den Lichtkanal ein und zeichnen Sie weitere 10 bis 15 Kontraktionen auf, um die akute Zellreaktion zu erhalten. Pausieren Sie dann die Aufzeichnung und schalten Sie den Lichtkanal wieder aus, wiederholen Sie die Aufzeichnungen nach zwei und fünf Minuten und ziehen Sie die Elektrode aus der Vertiefung, wenn sie am Ende fertig sind, analysieren Sie die Zellverkürzung und die Kalziumtransiente mit der Ionenassistentensoftware unter Verwendung der Kantenlängen-Schrägstrichlänge bzw. des URA-Fensters mit zwei numerischen subtrahierten Schrägstrichen.

Berechnen Sie als Nächstes die prozentualen Änderungen für die akute, die zweiminütige und die fünfminütige Reaktion von der anfänglichen Zellverkürzung und der vorübergehenden Kalziumpeakhöhe. Hier ein repräsentatives Beispiel für die Kontrollmessung. Die Zellverkürzung und die Calciumtransientität wurden online vor der Superfusion mit IgG und unmittelbar zwei Minuten und fünf Minuten nach der Superfusion mit IgG überwacht.

Und hier ist ein Beispiel für die Messung einer IgG-Probe, die kardiodepressive Antikörper enthält. Die Zellverkürzung und die Calciumtransientität wurden online vor der Superfusion mit IgG und unmittelbar zwei Minuten und fünf Minuten nach der Superfusion mit IgG gemessen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kardio-Transport-Antikörper im Patientenplasma nachweist, indem man die Wirkung von isoliertem IgG auf die Zellverkürzung im Kalziumtransienten von isolierten adulten roten Kardiomyozyten misst.