Name: Granulozyten-abhängige Autoantikörper-induzierten Blasenbildung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Induktion von Hautblasenbildung bei Mäusen durch passiven Transfer von Kollagen-VII-spezifischen Antikörpern. Dieses Tiermodell reproduziert die Phänotypen der epidermolysis bullosa acquisita.

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Die Autoren danken für die Unterstützung durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 und BIOSS von der Medizinischen Fakultät der Universität Freiburg (CS).

Ein. Vorbereitung von pathogenen Antikörper Anmerkung: Die Reinigung und die Konzentration der Antikörper sollten am selben Tag durchgeführt werden, wie Antikörper nicht in 0,1 M Glycin pH 2,5-3 (Elutionspuffer) über Nacht (ON) gespeichert werden. Affinitätsreinigung von IgG: Verwenden Sie 25 ml des Immunsystems Kaninchenserum: <ol><li> Auftauen Kaninchenserum ON bei 4 ° C, mischen Sie es 1:1 mit 1xPBS (Laufpuffer) und zentrifugieren es bei 1260 xg für 10 min bei 20 ° C. Optional kann eine Filterung Schritt mit Filterpapier nach Zentrifugation im Falle das Serum Fettsäuren von Bedeutung sind. </li><li> Inzwischen, waschen das Protein G-Matrix gefüllte Säule mit 10 Bettvolumina (Bettvolumen = Matrix Volumen) 1XPBS (Laufpuffer). </li><li> Übernehmen Sie die verdünnt und filtriert Serum auf die Säule pipettieren und 1 Std. auf dem Schüttler bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Sammeln Sie die Flow-Through (FT) in einem 50 ml Flacon Röhre. Nicht wegwerfen es bis die Konzentrationund Titer des gereinigten IgG ist bekannt. </li><li> Waschen Sie die Matrix mit 5 Bettvolumina 1XPBS und in der Zwischenzeit bereiten 50 ml Falcon-Röhrchen zum Auffangen des eluierte IgG-Fraktion. Pipette 1 ml pH neutralisierenden Puffer: 1 M Tris pH 10 in jedem Röhrchen (sonst der Anteil von 1:20 Trispuffer bezogen auf die Menge der zu sammelnden Eluat). </li><li> Anwenden 100-150 ml Elutionspuffer: 0,1 M Glycin, pH 2,5 bis 3 auf die Säule und Sammeln 50 ml Fraktion (en). Klappen Sie den Schlauch 2-3x, messen Sie den pH-Wert und fügen neutralisierende Puffer, bis Sie den pH 7,2-7,4 erreicht haben. </li><li> Sammeln einiger Tropfen IgG Eluat und mit dem Elutionspuffer als Etalon messen die OD bei 280 nm auf. Wenn die OD &lt;0,1 Stopp sammeln. </li><li> Generieren Sie das Protein G-Matrix und speichern Sie es nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> Konzentration durch Ultrafiltration mit Amicon Röhren: <ol><li> Waschen Amicon Ultra (15 ml / 30 kDa) Ultrafiltration Rohre mit 1XPBS durch Zentrifugieren 15-20 minbei 3220 × g bei 4 ° C. Entsorgen Sie die FT von der Amicon. </li><li> Füllen Sie die Amicons mit 15 ml eluierte IgG-Fraktion und Zentrifuge für 25-30 min bei 3.220 xg und 4 ° C; Zentrifugationszeit hängt immer von der Proteingehalt des Eluats. </li><li> Entsorgen FT und wiederholen Ultrafiltration bis Sie keine eluierte Fraktion verlassen haben. </li><li> Waschen Sie die konzentrierte IgG ausgiebig, zweimal mit 1XPBS 25-30 min durch Zentrifugation. </li><li> Sammeln das &quot;klebrige&quot;, gelbliche Antikörperlösung aus dem Amicon-Filter in einem Endvolumen von 1.500-2.000 ul 1XPBS. </li><li> Measure Konzentration von IgG-Präparation mit einem Spektralphotometer oder NanoDrop: Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x Verdünnungsfaktor / 1,4 </li><li> Waschen und speichern Sie die Amicons nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 2. Injektion von Collagen VII-spezifischen IgG in Mäuse Vor der eigentlichen Versuchsdurchführung, stellen Sie sicher, dass die experimentelle proProtokoll geschrieben wird und alle Materialien werden für das Experiment vorbereitet. <ol><li> Bereiten Sie die Datenblätter für die Krankheit Scoring, ELISAs, Immunfluoreszenz (IF)-Analyse und Myeloperoxidase (MPO)-Assay 4. </li><li> Beschriften Sie die Röhrchen für Blut und Organen, cryomolds sowie Histologie Verarbeitung und Einbettkassetten. </li><li> Die Antikörper-Lösungen sollten frisch hergestellt werden oder aufgetaut aus Aktien und charakterisiert hinsichtlich ihrer Reaktivität (Titer von IF-Mikroskopie und / oder ELISA). Die sterilfiltrierte Lösung sollte Antikörpers in PBS in einer Weise, dass die erforderliche Dosis für die Injektion variiert zwischen 250-1000 ul verdünnt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie genügend IgG, das gesamte Experiment durchführen zu können. </li><li> Bereiten Sie frischen Antikoagulans: Heparin 20 U / ml und 8,7 mg / ml Ketamin / 1,3 mg / ml Xylazin Mischung für die Anästhesie. Wenn opfern die Mäuse Röhrchen mit 3,7% Formaldehyd hergestellt beschriftet. </li><li> Sterilisieren chirurgische Instrumente (Skalpell, Schere, feine Spitze und curved forcipes), und bereiten Spritzen (Insulinspritzen, 1, und 2 ml Spritzen), Nadeln, Digitalkamera und zusätzliche Speicherkarte. </li></ol> Hinweis: Führen Sie alle auf Ketamin / Xylazin oder Isofluran narkotisierten Mäusen Isofluran ist die bevorzugte Anästhesie Option für den täglichen Haut-Check, wie Mäuse schnell erholen.. Jedoch wird, wenn Bilder, 87 mg / kg Ketamin und 13 mg / kg Xylazin üblicherweise subkutan injiziert. Für Euthanasie die Ketamin / Xylazin Dosis auf 130 mg / kg Ketamin und 20 mg / kg Xylazin erhöht. <ol><li> Überprüfen Sie die bereits markierten Tiere für ihre allgemeinen Gesundheitszustand, Haut und Fell Aussehen, wiegen sie und messen ihr Ohr Dicke (immer mit dem gleichen Ohr haften). </li><li> Registrieren beobachteten Werte und Veränderungen in der klinischen Bewertung Blatt. </li><li> Sammle 20-30 ul (2-3 Tropfen) Blut aus der Schwanzvene in einer Spritze mit dem gleichen Volumen der Antikoagulans. </li><li> Desinfizieren Sie das Fell undHaut mit 80% Ethanol. </li><li> Injizieren die Antikörper-Lösung subkutan in den Rücken mit einem Insulinspritze. (Für bestimmte Anlage (z. B. die Ohren) nur kleine Volumina (10-50 ul) durchführbar sind, die injiziert werden.) </li></ol> Die Injektionen sollten wiederholt sich jeden zweiten Tag, 4 mal. Balb / c und C57BL6 Mäuse einem Körpergewicht von etwa 20 g zu starten, um die Krankheit 3-4 Tage nach der ersten Verabreichung von 400-500 bis zu 750 pg / g Körpergewicht / Einspritzung Autoantikörper entwickeln. Bei Beendigung des Experiments: <ol><li> Legen Sie die Mäuse unter tiefe Narkose durch Injektion 130 mg / kg und 20 mg / kg Ketamin / Xylazin subkutan, exsanguinate sie aus dem hinteren Hohlvene und schneiden Sie das Herz aus. </li><li> Sammle Organe / Gewebeproben wie Haut: tail, Ohr, Blut-und Speiseröhre und steckte sie in zuvor beschriftet und PBS oder 3,7% Formaldehyd gefüllten Röhrchen. </li></ol> Bei der Rückkehr in dieLabor: <ol><li> Zentrifuge das Blut bei 1.200 xg, 10 min bei RT Abtrennung des Plasmas, übertragen das Plasma in korrekt beschriftete Röhrchen und bewahren Sie sie entsprechend. </li><li> Einbetten die Haut in optimaler Cut Temperatur Medium Biopsie durch cryomolds, richtig Etikett, und lagern Sie sie bei -80 ° C. </li><li> Legen Sie die Gewebeproben für die Histologie in den markierten Einbettformen gedacht und halten sie in 3,7% Formaldehyd bis Paraffineinbettung. </li></ol> 3. Clinical Evaluation of Disease Severity Mäuse sollten täglich für Läsionen von Haut und Schleimhaut zu untersuchen und die Ergebnisse zu dokumentieren mit geeigneten Formen werden. Die Kriterien für die frühe Euthanasie ist Hautläsionen, die mehr als 20% der Körperoberfläche und einen Gewichtsverlust von 5-10% des gesamten Körpergewichts in drei aufeinander folgenden Tagen, gerechnet für eine Krankheit Punktzahl von 5 (Tabelle 1). <ol><li> Platzieren Sie die Maus auf seinem Bauch. Beginnen mit dem Kopf-Bereich, nämlich mit dem rechtenOhr und erfragen Blasen, Erosionen, Kruste auf der inneren als auch auf der äußeren Seite. Weiter auf die gleiche Weise mit dem linken Ohr. </li><li> Rechte und linke Auge werden nach Anzeichen von Hautrötung gesteuert, Alopezie, Erosionen und / oder Kruste. </li><li> Stirn und Schnauze Bereich werden durch nächsten gebürstet, weiterhin mit dem ventralen Teil der Schnauze, Lippen und der Schleimhaut des Mundes. </li><li> Untersuchen Sie das rechte Vorderbein ab der Pfote, nach oben bewegen; wechseln Sie in das linke Vorderbein. Gleiche Prozedur mit der rechten und linken Hinterbeine. </li><li> Bürste durch das Fell am Hals-und Rückenbereich mit einem gekrümmten feinen Spitze Pinzette. </li><li> Drehen der Maus auf seiner Rückseite und überprüfen ventralen Teil sowie die ventralen Seiten der Glieder auf die gleiche Weise wie zuvor. </li><li> Überprüfen Sie den Schwanz. </li><li> Machen Sie Fotos von relevanten Körperteile, wo die Mäuse entwickeln Krankheit. Augenmerk muss auf die Qualität und Quantität der Bilder bezahlt werden. </li><li> Berechnen Sie die klinische Erkrankung Partituren. </li></ol> 4. Die Analyse der Haut-und Plasmaproben <ol><li> Vorzubereiten, zu speichern und / oder verarbeiten alle gesammelten Gewebe nach dem Plan. </li><li> Cut Gefrierschnitten für IF Nachweis von Kaninchen Antikörper und Maus Komplement-System-Komponenten. </li><li> Analyse der verschiedenen Protein-und Enzymgehalt (MPO-Assay) von gefrorenem Gewebe und / oder Organ-Extrakten. </li><li> Abschnitt das Paraffin Gewebe eingebettet und Flecken mit H &amp; E, um das Ausmaß der Gewebeschädigung zu visualisieren. </li><li> Analysieren Sie die Plasma durch ELISA, Immunoblot. </li></ol>

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<li>Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+Flii+gene+increases+dermal-epidermal+blistering+in+an+autoimmune+ColVII+mouse+model+of+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 225, 401-413 (2011).</li>
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<li>Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+human+pemphigoid+autoantibodies+do+not+trigger+disease+by+the+passive+transfer+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice.</a> Immunol. Lett. , (2012).</li>
<li>Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody-induced+intestinal+inflammation+and+weight+loss+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 224, 234-244 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die passive Übertragung von Antikörpern in Versuchstieren ist ein wichtiger Ansatz für den Nachweis ihrer Pathogenität 7, -12. Tiermodelle durch dieses Verfahren erhalten wird, abgesehen davon, dass der indirekte Nachweis für Autoimmunität 13, ermöglichen die Untersuchung des efferenten Phase des pathogenen Mechanismus. Der passive Transfer-Modell von Antikörper-induzierte Granulozyten-abhängige Haut Blasenbildung Epidermolysis bullosa acquisita (EBA) wurde verwendet, um die Mechanismen der Gewebes...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> rekombinantes Antigen </td><td></td><td></td><td> Die Plasmide Codierung für die rekombinante Formen von murinem Kollagen VII sind aus der entsprechenden Autor zugeordnet. </td></tr><tr><td> Immunsystem Kaninchenserum </td><td> <a href="http://www.eurogentec.com/" target="_blank">www.eurogentec.com</a> </td><td></td><td> Wir hatten weißen Neuseeland-Kaninchen mit 200 ug Antigen, 3 mal in 2 Wochen-Intervallen immunisiert. Zu diesem Zweck haben wir die Dienste von Eurogentec SA, Belgien verwendet. </td></tr><tr><td> Protein G Agarose </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243233001 </td><td></td></tr><tr><td> Balb / c-Mäusen </td><td> Charles River Laboratories </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> OCT-Verbindung, Tissue-Tek </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td><td> Oktober, optimale Schnittleistung Temperatur </td></tr><tr><td> Cryomold Standard </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4557 </td><td> 25 mm × 20 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Cryomold Zwischen </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4566 </td><td> 15 mm × 15 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Uni-Link-Einbettkassette </td><td> R. Langenbrinck </td><td> 09-0503 </td><td> Histologie Verarbeitung und Einbettkassetten </td></tr><tr><td> Spezial-Tatowierfarbe Schwarz </td><td> H. Hauptnerund &amp; Richard Herberholz GmbH &amp; Co. KG </td><td> 71492000 </td><td> Tätowieren Paste </td></tr><tr><td> Tatowierzange TZ1 </td><td> EBECO E. Becker &amp; Co GmbH </td><td></td><td> Tätowieren Gerät </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. </td><td> 7692,1 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyd 37% </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. </td><td> 7386 </td><td></td></tr><tr><td> Ketaminhydrochlorid </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> K2753-1G </td><td></td></tr><tr><td> Xylazinhydrochlorid </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> X1251-1G </td><td></td></tr><tr><td> sterile PBS </td><td> Biochrom </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Digitalkamera </td><td> Nikon </td><td> Coolpix 5400 </td><td></td></tr><tr><td> Spritze getrieben Filtereinheit 0,45 um </td><td> Millipore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caliper </td><td> Mitutoyo 7309 </td><td> 1667338 </td><td> Farnell (Verteiler) </td></tr><tr><td> Krankheit Scoring-Blatt </td><td></td><td></td><td> B. Kapselungsed </td></tr></tbody></table>

granulozyten-abhängige autoantikörper-induzierten blasenbildung

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Autoimmune Phänomene treten bei gesunden Personen, aber wenn Selbst-Toleranz fehl, kann der Autoimmun-Reaktion kann in bestimmten Pathologie führen. Gemäß Witebsky Postulate, eines der Kriterien bei der Diagnose einer Krankheit wie Autoimmun ist die Reproduktion der Krankheit bei Versuchstieren durch die passive Übertragung von Autoantikörpern. Für Epidermolysis bullosa acquisita (EBA), eine prototypische organspezifische Autoimmunerkrankung der Haut und Schleimhäute, wurden mehrere experimentelle Modelle kurzem gegründet. Im Tiermodell in unserem vorliegenden Arbeit beschriebenen gereinigten IgG-Antikörpern gegen eine Strecke von 200 Aminosäuren (aa 757-967) von Kollagen VII werden wiederholt in Mäuse Wiedergeben der Blasenbildung Phänotyp sowie der Histo-und immunpathologischen charakteristischen Merkmale der menschlichen eingespritzt EBA 1. Ausgewachsenen verbreitete Krankheit wird meist gesehen 5-6 Tage nach der ersten Injektion und das Ausmaß der Erkrankung korreliert mit der Dosis des verabreichten collagen VII-spezifischen IgG. Die Gewebeschäden (Blasenbildung) in der experimentellen EBA wird auf die Rekrutierung und Aktivierung von Granulozyten je nach Gewebe-gebundenen Autoantikörper 2, -4. Daher ermöglicht dieses Modell für die Präparation der Granulocyten-abhängige entzündlichen Wegs in der Autoimmun Gewebeschädigung beteiligt, da das Modell reproduziert nur das T-Zell-unabhängige Phase des efferenten Autoimmunantwort. Ferner wird dessen Wert von einer Reihe von Studien, die die Blister-induzierendes Potential von Autoantikörpern in vivo und Untersuchung des Mechanismus der Blasenbildung in EBA 1,3, -6 unterstrichen. Schließlich wird dieses Modell erheblich erleichtern die Entwicklung neuer anti-inflammatorische Therapien Autoantikörper-bedingten Krankheiten. Insgesamt ist die passive Übertragung Tiermodell der EBA eine zugängliche und lehrreich Krankheit Modell und hilft Forschern dabei nicht nur EBA Pathogenese analysieren, sondern zu beantworten grundlegende biologisch und klinischwesentliche Autoimmunität Fragen.

Die passive Übertragung von Antigen-spezifischen Antikörpern führt zu einer ausgewachsenen Krankheit in Mäusen ähnelt in klinischen, histologischen und immunpathologische Ebenen der menschlichen EBA. Blasen, Krusten, Erosionen und Alopezie auf den Ohren, Schnauze, Pfoten, Beine, Rücken und um die Augen der Mäuse entwickeln. Die ersten klinischen Anzeichen der Krankheit wird höchstwahrscheinlich auf den Ohren und / oder Kopfbereich erscheinen. Ablagerung von spezifischen Kaninchen IgG und Maus Komplement C3 wird durch di...

Im Tiermodell in unserem vorliegenden Arbeit beschriebenen gereinigten IgG-Antikörpern gegen eine Strecke von 200 Aminosäuren (aa 757-967) von Kollagen VII werden wiederholt in Mäuse Wiedergeben der Blasenbildung Phänotyp sowie der Histo-und immunpathologischen charakteristischen Merkmale der menschlichen eingespritzt Epidermolysis bullosa acquisita (EBA)<sup&gt; 1</sup&gt;.

Granulozyten-abhängige Autoantikörper-induzierten Blasenbildung

Autoimmune Phänomene treten bei gesunden Individuen auf, aber wenn die Selbsttoleranz versagt, kann die autoimmune Antwort zu spezifischen Pathologien führen. Gemäß ...

Ich bin Cassian RO aus der Abteilung für Dermatologie an der Universität Freiburg in Deutschland. Die Forschung unseres Labors konzentriert sich auf die Pathogenese autoimmuner Hauterkrankungen. Eine der autoimmune Krankheiten, die uns interessiert, ist die Epidermolysis bullosa acquisita (EBAA), eine organspezifische Autoimmunerkrankung mit einem gut definierten Antigen-Autoantikörper-System, für die zudem komplementäre ex vivo- und Tiermodelle verfügbar sind.Die Blasenbildung bei der EBA kann durch die Übertragung von Antikörpern gegen Typ VII-Kollagen auf Mäuse reproduziert werden. In diesem Videobeitrag stellen wir daher die Induktion und Analyse von Hautbläschenbildung bei Mäusen mittels passiver Übertragung kollagen VII-spezifischer Antikörper vor. Hallo, ich bin King OBA vom CAS-Team aus der Abteilung für Dermatologie am Universitätsklinikum Freiberg.In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie das experimentelle Mausmodell der EBA durch passiven Transfer von pathogenen Autoantikörpern induziert wird. Wir verwenden dieses Verfahren bei der Untersuchung möglicher Krankheitsmechanismen bei autoimmunen Hauterkrankungen oder bei der Suche nach pathogenen Epitopen. Bei der Erstellung des Modells des passiven Transfers für die EBA müssen einige zusätzliche Schritte durchgeführt werden, bevor Autoantikörper in Wildtyp-Mäuse injiziert werden.Als ersten Schritt werden weiße Kaninchen subkutan mit dem gereinigten rekombinanten Antigen geimpft. Gesamt-IgG aus Kaninchenserum wird mittels Affinitäts-Säulenchromatographie isoliert und anschließend in Wildtyp-Mäuse injiziert. Die Injektionen werden viermal alle zwei Tage subkutan verabreicht, und Blutproben werden im Abstand von zwei Tagen entnommen.Die Mäuse werden täglich auf ihren allgemeinen Zustand sowie auf Anzeichen von kutanen Läsionen untersucht. Während des Experiments werden klinische Scores zur Beurteilung der Krankheitsaktivität für jedes einzelne Tier erhoben, und zwei Wochen nach der ersten Injektion werden die Tiere getötet, wobei Serumproben sowie Hautbiopsien entnommen und weiter analysiert werden. Nach der Inkubationszeit wird eine Säule in ein vertikales Halterungsgefäß gestellt, das untere Ende geöffnet, leicht angeklopft und der Durchlauf gesammelt.In 50-Milli-Falcon-Röhrchen sammeln Sie den Durchfluss, bis Sie mittels Immunfluoreszenzanalyse die Bestätigung erhalten, dass es sich um ein spezifischen Antikörper-freies Konzentrat handelt. Verdünntes IgG wird durch Ultrafiltration in speziellen Amicon-Röhrchen bei 3.220 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius konzentriert. Die Konzentrierung erfolgt, indem das Eluat durch einen Filter fließen lässt, der Durchfluss verworfen, das Röhrchen erneut befüllt und der Vorgang wiederholt wird, bis kein Eluat mehr vorhanden ist. Im letzten Schritt wird mit 1× PBS gewaschen, das gelblich-trübe, viskose, konzentrierte IgG gesammelt, dessen Konzentration gemessen und in ordnungsgemäß beschrifteten Röhrchen aufbewahrt.Bevor mit der eigentlichen Injektion der Autoantikörper begonnen wird, überprüfen Sie deren Spezifität und Titer mittels indirekter Immunfluoreszenz. Inkubieren Sie Kryoschnitte normaler, gesunder Haut mit seriellen Verdünnungen der konzentrierten IGT-Präparation und visualisieren Sie deren Ablagerung mithilfe eines einfach markierten, geeigneten sekundären Antikörpers, indem Sie Bilder aufnehmen, bevor Sie die Tierhaltung betreten. Stellen Sie sicher, dass das Tierversuchsprotokoll verfasst ist und alle Materialien vorbereitet sind.Datensätze zur klinischen Bewertung der Krankheitsaktivität, beschriftete Röhrchen für Blut- und Gewebeproben. Antikörperlösung so verdünnt, dass das geeignete Injektionsvolumen vorliegt. Frisches Antikoagulans und anästhesierte sterilisierte chirurgische Instrumente sowie Spritzen.Ein Messschieber und eine Digitalkamera sollten ebenfalls auf der Checkliste enthalten sein. Nachdem die Arbeitsfläche gereinigt und die Isoflurananlage vorbereitet wurde, sollte die Spritze zur Blutentnahme mit Heparin vorbehandelt und eine Insulinspritze mit Antikörperlösung befüllt werden. Nehmen Sie die Maus aus dem Käfig, überprüfen Sie ihre Identifikationsnummer und wiegen Sie sie. Tragen Sie alle gemessenen und beobachteten Daten in das persönliche Daten- und klinische Bewertungsblatt der Mäuse ein. Wenn sich die Maus bereits unter Narkose befindet, messen Sie die Dicke des Ohres und überprüfen Sie anschließend das Aussehen der Haut und des Fells des Tieres. Achten Sie besonders auf den Kopf-, Rücken-, Bauch- und Extremitätenbereich.Nehmen Sie Blut aus der Schwanzvene durch einen kleinen Schnitt im oberen Drittel, desinfizieren Sie das Fell und injizieren Sie die IgG-Lösung durch Anheben der Haut am Rücken vorsichtig subkutan. Wenn Sie ins Labor zurückkehren, zentrifugieren Sie das Blut 10 Minuten bei 1.200 ×g bei Raumtemperatur, um das Serum zu gewinnen. Überführen Sie die Probe in entsprechend beschriftete Röhrchen und lagern Sie diese gemäß dem Plan.Untersuchen Sie die Mäuse täglich auf Anzeichen von Erkrankungen, sobald sie beginnen, eine Erythema-alopecia und Hautläsionen zu entwickeln. Bewerten Sie zusätzlich zur Gewichtsmessung die Krankheitsaktivität. Spritzen Sie subkutan ein Ketamin-Cila-Gemisch, um die Maus in Narkose zu versetzen.Messen Sie die Dicke des Ohres und führen Sie anschließend die allgemeine körperliche Untersuchung durch. Verwenden Sie gebogene feinspitzige Pinzetten, um entgegen der Wuchsrichtung durch das Fell zu streichen, um möglicherweise betroffene Stellen freizulegen. Arbeiten Sie sich dabei um das Gesicht herum.Augenschnauze in Richtung des äußeren und inneren Teils des Ohrs bewegen und dann auch die andere Seite des Kopfes überprüfen. Fortsetzung mit der Schleimhaut der Mundhöhle, dem ventralen Teil der Schnauze und dem Bauchbereich. Der dorso-laterale, dorsale und Nackenbereich sowie die Vorder- und Handgliedmaßen.Quantifizieren Sie das Ausmaß der Läsionen im Protokoll, die Befunde in der Form basierend auf der bedeckten Hautfläche, dem Prozentsatz bestimmter Körperteile und -regionen im Vergleich zur gesamten Hautoberfläche der Maus. Eine klinische Krankheitswertung wird basierend auf der gesamten betroffenen Haut- und Schleimhautoberfläche berechnet. Nehmen Sie abschließend Bilder relevanter Körperteile und erkrankter Bereiche auf.Am Ende des Experiments die Tiere unter tiefer Narkose euthanasieren und Blut sowie Gewebeproben sammeln. Die Ohren, der Schwanz und die Speiseröhre sind in diesem experimentellen Ansatz am häufigsten betroffen. Die biopsierten Läsionshautproben in kleinere Streifen schneiden.Geben Sie sie in Histologie-Kassetten für die Aufarbeitung und Einbettung und lagern Sie sie bis zur Einbettung in Paraffin in 3,7 % Formaldehyd. Anschließend werden die Proben für die H- und E-Färbung zur immunfluoreszenzanalytischen Untersuchung aufgearbeitet. Die Perlschnäbelchen werden in Medium mit optimaler Schneidetemperatur eingebettet und im Anschluss im Kryostaten sechs Mikrometer dicke Schnitte angefertigt.Führen Sie eine direkte Immunfluoreszenzanalyse durch, um die im Gewebe gebundenen spezifischen Kaninchen-Antikörper und Maus-Komplementkomponenten sichtbar zu machen, und führen Sie zusätzlich einen ELISA-Test mit rekombinantem Antigen beschichteten Mikrotiterplatten und seriellen Verdünnungen des Mauserums durch, um die Konzentration zirkulierender Autoantikörper zu messen. Die passive Übertragung von Kollagen-sieben-spezifischen Antikörpern führt bei Mäusen zu einer voll ausgeprägten Erkrankung, die klinisch, histologisch und immunopathologisch dem menschlichen EBA ähnelt. Beim Menschen treten Blasen, Krusten, Erosionen und Alopezie an den Ohren, um die Augen, an Rüssel, Pfoten, Beinen und am Rücken der Mäuse auf. Die Krankheitsaktivität, die im Verlauf des Experiments eine zunehmende Tendenz zeigt, wird anhand des betroffenen Haut- und Schleimhautareals berechnet. Dargestellt sind repräsentative Ergebnisse des Nachweises spezifischer Kaninchen-IgG und murinen Komplementfaktors C3 mittels indirekter Immunfluoreszenz an der dermoepidermalen Junction in Kryoschnitten der peralen Haut.Weder IgG noch Komplement C3 wurden in den Kontrollen nachgewiesen. Die anschließende histologische Analyse von Läsionshaut zeigt subepidermale Blasen und entzündliche Infiltrate. Die Bildung subepidermaler Blasen ist jedoch in der Kontrolle nicht zu beobachten, wenn sie durchgeführt wird.Wie hier gezeigt, wird das verwendete Modell der Autoantikörper-induzierten subepidermalen Blasenbildung die Untersuchung der von Autoantikörpern ausgelösten, ROY-abhängigen entzündlichen Signalwege, die zu Gewebeschäden führen, erheblich voranbringen. Aufgrund des robusten Designs und des einfachen Protokolls eignet es sich zudem zur Entwicklung und Prüfung neuer entzündungshemmender Therapien bei autoantikörpervermittelten Erkrankungen.

granulocyte-dependent-autoantibody-induced-skin-blistering

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dermatitis herpetiformis (DH) ist eine chronische entzündliche Erkrankung durch eine Autoimmunreaktion zwischen IgA und epidermalen Transglutaminase (ETG) gekennzeichnet. DH entwickelt sich in einem sehr kleinen Teil der gluten-sensitive und / oder Zöliakie-Patienten. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass DH kann auch in einem Rhesusaffen-Host mit Symptomen der idiopatic Dermatitis zu entwickeln.

Die Anerkennung der Epidermal Transglutaminase von IgA und Tissue Transglutaminase 2 Antikörper in einem seltenen Fall von Rhesus Dermatitis

Indirekte Immunfluoreszenz (IIF)-Assays wurden traditionell für den Nachweis von antinukleären Antikörpern (ANA) in Humanserum verwendet. Das Vorhandensein dieser Antikörper können bei der Diagnose von rheumatischen systemischen Autoimmunerkrankungen (SARD) unterstützen. Dieses Protokoll zeigt, wie die IIF-Technik effektiv durchzuführen, um diese Autoantikörper genau zu erfassen.

Anti-Atom-Antikörper Screening mit HEp-2-Zellen

Der Transfer von bm12-Lymphozyten in einen C57BL/6-Empfänger ist ein etabliertes Modell des systemischen Lupus erythematodes. Hier beschreiben wir, wie man mit diesem Modell eine Krankheit auslösen kann und wie man T-follikuläre Helferzellen, Keimzentrum-B-Zellen und Plasmazellen mittels Durchflusszytometrie charakterisiert.

Das BM12 Inducible Modell des systemischen Lupus erythematodes (SLE) in C57BL / 6-Mäuse

Hier bieten wir eine Demonstration des Modells Saug Blister kutanen erinnern. Das Modell ermöglicht einen einfachen Zugang zu menschlichen in-Vivo adaptive Immunantworten, zum Beispiel im Rahmen der Entwicklung von Impfstoffen zu studieren.

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Dieses Protokoll beschreibt die Generation der gemischten murinen Knochenmark Chimären mit spontanen autoimmune germinal Zentren, in denen, die autoreaktive Lymphozyten Photoactivatable grün fluoreszierendes Protein (PA-GFP) Reporter tragen. Dies bietet die Möglichkeit, zelluläre Lage in Geweben mit nachgeschalteten molekulare und funktionelle Analysen zu verknüpfen.

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Der basophile Aktivierungstest ist ein ergänzender in-vitro-diagnostischer Test zur Bewertung von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen basierend auf dem Nachweis einer basophilen Aktivierung in Gegenwart eines spezifischen Stimulus durch die Messung von Aktivierungsmarkern durch Durchflusszytometrie.

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Die Studie zeigt die Rolle der Haut bei der Modulation der Immunantwort bei Mäusen durch epikutane (EC) Immunisierung. Die EC-Immunisierung mit einem Proteinantigen kann in Kombination mit erregerassoziierten molekularen Mustern Immunantworten bei Kontaktüberempfindlichkeit unterdrücken oder die hautinduzierte Suppression rückgängig machen. Die EC-Immunisierung ist vielversprechend und bietet einen wirksamen, nadelfreien Ansatz für die Immuntherapie.

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Hautläsionen sind häufige und wichtige Merkmale bei vielen rheumatischen Erkrankungen, und die Biopsie mit pathologischer Analyse spielt eine entscheidende Rolle bei der Diagnose. Dieser Artikel gibt einen detaillierten Überblick über das standardisierte Verfahren der Hautbiopsie und beleuchtet am Beispiel des diskoiden Lupus erythematodes die wesentliche Rolle der Dermatopathologie bei der Diagnostik rheumatischer Erkrankungen.

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