Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Diese Demonstration nutzt die Live-Cell-Bildgebung in zwei und drei Dimensionen, um die räumlich-zeitlichen Beziehungen von Proteinen zu verstehen, die an der DNA-Schadensantwort beteiligt sind. Transfizieren oder transduzieren Sie zunächst Ihre gewünschte Zelllinie mit Expressionskonstrukten, die geeignete fluoreszierende Marker enthalten. Hier sind mCherry und GFP. Danach erwerben Sie eine Reihe von Kontrollvideos, die die fluoreszenzmarkierten Zellen unter Normalbedingungen zeigen.

Wenden Sie dann eine geeignete Behandlung an und erfassen Sie Daten über die Wirkung der Behandlung auf den fluoreszierenden Zellprozess, und analysieren Sie die Videodaten hinsichtlich räumlich-zeitlicher Beziehungen der Proteine. Letztendlich kann die Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen zelluläre Dynamiken im Detail darstellen, wie beispielsweise die Bildung von 53 BP1-Foci als Reaktion auf DNA-schädigende Agenzien oder das Verhalten von 53 BP1 während der Mitose. Wir interessierten uns erstmals für 2D- und 3D-Abbildungen im lebenden Zustand, als wir untersuchen wollten, wie unterschiedliche Behandlungen die Mitose in bestimmten Zelllinien beeinflussen.

Dieser experimentelle Ansatz ermöglicht es uns, die Antwort auf DNA-Schäden und die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität einfacher zu untersuchen als mit herkömmlichen Methoden. Zusätzlich können Sie diese Methode nutzen, um zu erforschen, wie bestimmte Proteine in verschiedenen Signalwegen und Zelllinien miteinander interagieren. Der Hauptvorteil der Live-Cell-Bildgebung gegenüber traditionellen Techniken wie der Cytochemie besteht darin, dass sie die Untersuchung der Proteine der DNA-Schadensantwort in Echtzeit erlaubt.

Die Optimierung der richtigen Aufnahmebedingungen kann herausfordernd sein. Diese Demonstration kann genutzt werden, um die zahlreichen kleinen Schritte zu erkennen, die für den Erfolg erforderlich sind. Denken Sie daran, dass sich Hartnäckigkeit auszahlt, wenn es darum geht, die Photo-Bleaching-Effekte zu minimieren, die geeigneten Aufnahmeintervalle und die richtige Aufnahmedauer zu finden, usw.

Transfizieren oder transduzieren Sie die geeigneten Zelllinien mit den Plasmiden zur Expression der mCherry- und GFP-Fusionsproteine. Kultivieren Sie die Zellen unter Antibiotikaselektion und überprüfen Sie regelmäßig am Tag vor der Bildaufnahme die Expression der fluoreszierenden Proteine. Gewinnen Sie die Zellen mittels Trypsin.

Dann säen Sie Kulturen mit geringer Dichte auf 3,5 cm Fluoroschalen mit Glasboden. Dieses Protokoll wurde unter Verwendung des Zeiss Cell Observer SD Spinning-Disk-Konfokalmikroskops entwickelt, das mit einem Axio Observer Z1-Stativ ausgestattet ist. Überprüfen Sie zunächst, ob das CO2-Gas zur CO2-Einheit des Inkubationssystems geleitet wird. Falls das Mikroskop auf einem schwingungsisolierten Airtable steht, schalten Sie die Luftzufuhr für den Airtable ein.

Schalten Sie nun die Stromversorgung für die Mikroskopstativ-Spindelscheiben-Einheit, Kameras, Inkubationsmodule, HXP-Beleuchtungseinheit, motorisierte Probennabe und den Computer ein. Schalten Sie die Schalter für die verwendeten Laserlinien ein. Starten Sie die Axio-Vision-Software.

Die Avision-Software kann mit Fenstern und Dropdown-Menüs angepasst werden, die spezifisch für das Mikroskop und die von ihm gesteuerten Komponenten sind. Daher kann jede Benutzeroberfläche ein potenziell einzigartiges Aussehen aufweisen. Ungefähr eine Stunde vor der Bildaufnahme die Bedienelemente für den Inkubator suchen und die Heizung für die obere Kammer sowie die Objekttischplatte einschalten.

Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Schalten Sie die CO2-Steuerung ein und stellen Sie den Wert auf 5 % ein. Wählen Sie das Objektiv für die Bildgebung in dieser Studie aus. Für das Objektiv ist ein Immersionsmedium erforderlich, dessen Brechungsindex dem von Wasser ähnelt.

Wenn Sie mehrere Positionen über einen längeren Zeitraum abbilden müssen, stellen Sie sicher, dass ausreichend Immersionsmedium verwendet wird, damit das Objektiv nicht austrocknet. Stellen Sie die Kulturschale auf den Objekttisch und bringen Sie das Objektiv mit dessen Unterseite in Kontakt, entweder mithilfe der Mikroskopsteuerung oder der Software. Leiten Sie das emittierte Licht zu den Okularen und wählen Sie den geeigneten Weitfeld-Filter für das gewünschte fluoreszierende Signal aus.

Sehen Sie nun durch die Okularlinsen. Bringen Sie das Bild in den Fokus und suchen Sie mithilfe der Software oder der Mikroskopsteuerung ein geeignetes Zellfeld. Leiten Sie das emittierte Licht in der Software von den Augenstücken zur Ausgangsöffnung mit der Konfokal-Spindelscheibe um.

Schalten Sie den für diese Studie geeigneten Laser ein. Stellen Sie für jeden Kanal die Intensität des Lasers durch Einstellung des Kuo-Optik-justierbaren Filterreglers auf ein geeignetes Niveau ein. Wählen Sie anschließend den geeigneten dichroitischen Spiegel und die entsprechenden Emissionsfilter aus.

Öffnen Sie den Verschluss zur Drehtellereinheit. Wählen Sie nun das Live-Fenster, um das aktuelle Sichtfeld anzuzeigen. Öffnen Sie jetzt das Kamera-Steuerungsfenster.

Wählen Sie die zu verwendende Kamera aus und stellen Sie die Belichtungszeit auf etwa 100 Millisekunden ein. Passen Sie den Prozentsatz und den EM-Verstärkungsfaktor nach Bedarf an. Öffnen Sie außerdem die Steuerung für die konfokale Spinning-Disk-Einheit und stellen Sie die Spinning-Disk-Drehzahl ein, indem Sie die eingestellte Kamerabelichtungszeit eingeben, die zur Aufnahme eines geeigneten Bildes verwendet wurde.

Klicken Sie auf „Setzen“, um die Änderung zu bestätigen. Öffnen Sie nun das Fenster für die mehrdimensionale Aufnahme. Wählen Sie den Kanalreiter aus und laden oder wählen Sie die für die Flora Fours definierten geeigneten Kanäle.

Um die Bildregistrierung sicherzustellen, verwenden Sie einen gemeinsamen Dichroikspiegel für beide Kanäle. Stellen Sie die Software auf automatische Fokussierung ein. Wechseln Sie zum MDA-Fenster und klicken Sie auf den Reiter ZS-Stack.

Wählen Sie den ZS-Stack in der aktuellen Fokusposition aus. Stellen Sie den Bereich für einen 10-Mikrometer-Zack ein und wählen Sie die optimale Anzahl von Schritten, um eine Nyquist-Abtastung entlang der Z-Achse sicherzustellen. Klicken Sie nun auf „Start“ und analysieren Sie das resultierende Z-Stack-Bild. Wählen Sie den Reiter „Zeit“ aus.

Stellen Sie das Intervall zwischen den Bildaufnahmezeitpunkten und die Gesamtdauer der Sitzung ein. Öffnen Sie beim Mehrpunktbildgebungsverfahren mehrerer Zellen in der Petrischale das MDA-Fenster. Wählen Sie den Reiter Position und vergewissern Sie sich, dass die Einstellung vor oder nach dem Zeitpunkt pro Position angewendet wird.

Wählen Sie nun „Mark“ aus. Suchen Sie mithilfe der Live-Ansicht, bewegen Sie die Petrischale und wählen Sie geeignete Bildfelder aus. Klicken Sie im Menü für die mehrdimensionale Aufnahme auf „Start“, um das Experiment zu beginnen und ein Kontrollvideo aufzuzeichnen.

Fahren Sie fort, indem Sie die geeignete Behandlung hinzufügen, und nehmen Sie das experimentelle Video in festgelegten Zeitabständen über einen definierten Zeitraum auf. Für diese Zelllinie und zur Beobachtung des gesamten Mitosevorgangs verwendeten wir ein Intervall von siebeneinhalb Minuten über einen Zeitraum von vier bis fünf Stunden. Sie müssen die spezifischen Einstellungen für Ihre Zelllinie und den zu untersuchenden Prozess selbst festlegen.

Öffnen Sie die Velocity-Software, erstellen und benennen Sie eine neue Bibliothek und importieren Sie die experimentellen Videodateien zur Ansicht der Dateien. Versuchen Sie, die Einstellung für erweiterten Fokus zu verwenden, und passen Sie die Videos nach Bedarf an. Velocity verfügt über eine Reihe von Werkzeugen, die dabei helfen, die Qualität der aufgenommenen Bilder zu verbessern.

Wenn die Einstellungen am Mikroskop geeignet sind, spart dies später viel Zeit bei der Bearbeitung. Häufig ist es hilfreich, Ihre Bilder zu verarbeiten und Helligkeit und Kontrast anzupassen; Ihre spezifischen Anforderungen variieren je nach Experiment. Um die Zellen in 3D anzusehen, wechseln Sie zur 3D-Opazitätseinstellung.

Dies ermöglicht die Drehung der 3D-dargestellten Zellen im Raum und bietet somit mehrere Ansichten der innerhalb der Zellen interessierenden Strukturen. Filme. Standbilder können je nach Benutzerpräferenz in verschiedene Dateiformate exportiert werden. Im Vergleich zu den Kontrollen bildeten Fibroblasten, die CPT ausgesetzt waren, innerhalb von fünf bis zehn Minuten Foci und behielten diese während der gesamten Aufzeichnungsdauer bei.

Interessanterweise dissoziiert 53BP1 in menschlichen embryonalen Nierenzellen von der Chromatin zu Beginn der Mitose und bildet einen dünnen Dunstschleier um die kondensierenden Chromosomen. Während der Telophase und dem Abschluss der Mitose aggregiert 53BP1 erneut zu deutlich abgegrenzten Foci. Wir hoffen, dass dieses Video Ihnen ermöglicht, die räumlich-zeitlichen Beziehungen von Proteinen, die an der DNA-Schadensantwort sowie an anderen Signalwegen beteiligt sind, zu untersuchen.

Beispielsweise wurde in der Forschung zur Chromatindynamik diese Technik verwendet, um zu untersuchen, wie die Bindung von 53 BP1 die Bewegung der telomeren Enden der DNA beeinflusst. Nach der Erzeugung genetisch veränderter Zellen können zwei- und dreidimensionale Live-Cell-Bildgebungen innerhalb von etwa vier bis acht Stunden durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass die Mikroskopeinstellungen entsprechend angepasst werden, um eine optimale Bildgebung zu erzielen.