Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Diese Demonstration verwendet Zwei- und 3D-Lebendzellbildgebung, um die räumlichen und zeitlichen Beziehungen von Proteinen zu verstehen, die an der DNA-Schadensreaktion beteiligt sind. Transfizieren oder transduzieren Sie zunächst die Zelllinie Ihrer Wahl mit Expressionskonstrukten, die geeignete Fluoreszenzmarker enthalten. Hier nehmen M Cherry und GFP als nächstes eine Reihe von Kontrollvideos auf, die die fluoreszenzmarkierten Zellen unter normalen Bedingungen zeigen.

Wenden Sie dann eine geeignete Behandlung an und erfassen Sie Daten der Behandlungseffekte auf die fluoreszierenden Zellen, verarbeiten und analysieren Sie die Videodaten auf räumliche und zeitliche Beziehungen von Proteinen. Letztendlich kann die Fluoreszenzmikroskopie von lebenden Zellen die zelluläre Dynamik detailliert beschreiben, wie z. B. die Bildung von 53 BP 1-Herden als Reaktion auf DNA-schädigende Wirkstoffe oder das Verhalten von 53 BP one während der Mitose. Wir begannen uns für die Zwei- und 3D-Lifestyle-Bildgebung zu interessieren, als wir untersuchen wollten, wie sich unterschiedliche Behandlungen auf die Mitose in bestimmten Zelllinien auswirken.

Dieser experimentelle Ansatz ermöglicht es uns, die Reaktion auf DNA-Schäden und die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität einfacher zu untersuchen als herkömmliche Methoden. Darüber hinaus können Sie mit dieser Methode untersuchen, wie bestimmte Proteine in verschiedenen Signalwegen und verschiedenen Zelllinien interagieren. Der Hauptvorteil der Lifestyle-Bildgebung gegenüber herkömmlichen Techniken wie der Zytochemie besteht darin, dass sie die Untersuchung der DNA-Schadensreaktionsproteine in Echtzeit ermöglicht.

Die Optimierung der richtigen Aufnahmebedingungen kann eine Herausforderung sein. Diese Demonstration kann verwendet werden, um die vielen kleinen Schritte zu sehen, die erforderlich sind, um den Erfolg sicherzustellen. Denken Sie daran, dass sich Hartnäckigkeit auszahlt, wenn es darum geht, das Photo-Bleaching zu minimieren, die richtigen Aufnahmeintervalle und die richtige Aufnahmedauer zu finden und so weiter.

Transfizieren oder transduzieren Sie die entsprechenden Zelllinien mit den Plasmiden für die Expression von mCherry- und GFP-Fusionsproteinen. Bewahren Sie die Kulturen unter Arzneimittelauswahl auf und überprüfen Sie regelmäßig die Expression der fluoreszierenden Proteine am Tag vor der Bildaufnahme. Ernten Sie die Zellen mit Trypsin.

Säen Sie dann Kulturen mit niedriger Dichte auf 3,5 Zentimeter große Bodenplatten aus Fluorschalenglas. Dieses Protokoll wurde unter Verwendung des konfokalen Spinnerscheibenmikroskops SD von Zeiss entwickelt, das mit einem axio observer Z one stand ausgestattet ist. Überprüfen Sie zunächst, ob das CO2-Gas zum CO2-Modul des Inkubationssystems fließt. Wenn das Mikroskop von einem schwingungsdämpfenden Airtable unterstützt wird, schalten Sie die Luftzufuhr für den Airtable ein.

Schalten Sie nun das Mikroskopstativ, die Kameras für die rotierende Disc-Einheit, die Inkubationsmodule, die HXP-Beleuchtung, den motorisierten Tisch, den Argonnenlaser und den Computer ein. Schalten Sie die Schalter für die zu verwendenden Laserlinien ein. Starten Sie die Axio Vision Software.

Die Avision-Software kann mit Fenstern und Pulldown-Menüs angepasst werden, die spezifisch für das Mikroskop und die von ihm gesteuerten Komponenten sind. Auf diese Weise hat jede Benutzeroberfläche ein potenziell einzigartiges Aussehen Etwa eine Stunde vor der Bildgebung. Suchen Sie die Bedienelemente für den Inkubator und schalten Sie die Heizung für die obere Kammer und die Tischplatte ein.

Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Schalten Sie die CO2-Kontrolle ein und stellen Sie den Pegel auf 5 % einWählen Sie das Objektiv für die Bildgebung in dieser Studie aus. Für die Objektivlinse muss ein Immersionsmedium verwendet werden, das einen ähnlichen Brechungsindex wie Wasser hat.

Wenn Sie mehrere Positionen über längere Zeiträume abbilden müssen, achten Sie darauf, dass Sie genügend Immersionsmedium auftragen, damit das Zielfernrohr nicht austrocknet. Stellen Sie die Kulturschale auf den Tisch und bringen Sie die Objektivlinse mit den Bedienelementen des Mikroskops oder der Software in Kontakt mit dem Boden. Richten Sie das emittierte Licht auf die Okulare und wählen Sie das passende Weitfeldfilterset für das interessierende Fluoreszenzsignal aus.

Nun Blick durch die Okularlinsen. Fokussieren Sie das Bild und lokalisieren Sie ein geeignetes Zellfeld entweder mit der Software oder der Mikroskopsteuerung. Richten Sie das emittierte Licht von den Okularen weg auf den Anschluss mit der konfokalen Drehscheibeneinheit in der Software.

Schalten Sie den entsprechenden Laser für diese Studie ein. Passen Sie für jeden Kanal die Intensität des Lasers an, indem Sie den abstimmbaren Filter von kuo optic auf einen geeigneten Pegel einstellen. Wählen Sie als Nächstes die geeigneten dichroitischen Spiegel- und Emissionsfilter aus.

Öffnen Sie den Verschluss zur sich drehenden Scheibeneinheit. Wählen Sie nun das Live-Fenster aus, um das aktuelle Sichtfeld anzuzeigen. Öffnen Sie nun das Fenster zur Kamerasteuerung.

Wählen Sie die zu verwendende Kamera aus und stellen Sie die Belichtungszeit auf ca. 100 Millisekunden ein. Passen Sie den Prozentsatz und die EM-Verstärkung nach Bedarf an. Öffnen Sie außerdem den Regler für die konfokale Drehscheibe und passen Sie die Geschwindigkeit der sich drehenden Scheibe an, indem Sie die Belichtungszeit der Kamera eingeben, die für die Aufnahme eines geeigneten Bildes eingestellt wurde.

Klicken Sie auf Festlegen, um die Änderung zu sperren. Öffnen Sie nun das mehrdimensionale Erfassungsfenster. Wählen Sie die Registerkarte Kanal und laden Sie die entsprechenden Kanäle, die für die Flora Fours definiert sind, oder wählen Sie sie aus.

Um die Bildregistrierung zu gewährleisten, verwenden Sie einen gemeinsamen dichroitischen Spiegel für beide Kanäle. Stellen Sie die Software auf Autofokus ein. Fahren Sie mit dem MDA-Fenster fort und klicken Sie auf die Registerkarte ZS-Stapel.

Wählen Sie den ZS-Stapel an der aktuellen Fokusposition. Stellen Sie den Bereich für einen 10-Mikron-Zack ein und wählen Sie optimal für die Anzahl der Schritte, um die Nyquist-Abtastung durch Z sicherzustellen. Klicken Sie nun auf Start und analysieren Sie das resultierende Z-Stapelbild. Wählen Sie die Registerkarte Zeit aus.

Legen Sie das Intervall zwischen den Imaging-Zeitpunkten und der Gesamtdauer der Sitzung fest. Um eine Mehrpunkt-Bildgebung mehrerer Zellen in der Schale zu erhalten, öffnen Sie das MDA-Fenster. Wählen Sie die Registerkarte Position aus, und stellen Sie sicher, dass die Einstellung "Anwenden" vor oder nach dem Zeitpunkt pro Position aktiviert ist.

Wählen Sie nun Markierung aus. Suchen Sie in der Live-Ansicht, verschieben Sie die Schüssel und wählen Sie die entsprechenden Sichtfelder aus. Klicken Sie im Menü für die mehrdimensionale Erfassung auf Start, um das Experiment zu starten und ein Kontrollvideo aufzunehmen.

Fahren Sie mit der entsprechenden Behandlung fort und nehmen Sie das Versuchsvideo in festgelegten Zeitintervallen für einen definierten Zeitraum auf. Für diese Zelllinie und für die Überwachung des gesamten Prozesses der Mitose haben wir ein Intervall von siebeneinhalb Minuten verwendet, das vier bis fünf Stunden dauerte. Sie müssen die speziellen Einstellungen für Ihre Zelllinie und für das, was Sie untersuchen möchten, festlegen.

Öffnen Sie die Velocity-Software, erstellen und benennen Sie eine neue Bibliothek und importieren Sie die experimentellen Videodateien, um sie anzusehen. Versuchen Sie, die erweiterte Fokuseinstellung zu verwenden, und passen Sie die Videos nach Bedarf an. Velocity ist mit einer Reihe von Werkzeugen ausgestattet, mit denen Sie die Qualität Ihrer aufgenommenen Bilder verbessern können.

Wenn die Einstellungen am Mikroskop angemessen sind, spart es später bei der Bearbeitung viel Zeit. Oft ist es hilfreich, Ihre Bilder zu dezentralisieren und die Helligkeit und den Kontrast anzupassen, Ihre spezifischen Anforderungen variieren je nach Ihrem Experiment, um die Zellen in 3D zu betrachten. Wechseln Sie zur Einstellung 3D-Deckkraft.

Dies ermöglicht die Rotation der 3D-gerenderten Zellen im Raum und bietet so mehrere Perspektiven auf interessante Strukturen innerhalb der Zellen. Filme. Standbilder können je nach Benutzerpräferenz im Vergleich zu den Steuerelementen in eine Vielzahl von Dateitypen exportiert werden. Fibroblastenzellen, die CPT ausgesetzt waren, bildeten innerhalb von fünf bis 10 Minuten Herde und hielten diese Herde während der gesamten Dauer der Aufzeichnung aufrecht.

Interessanterweise dissoziiert in menschlichen embryonalen Nierenzellen 53 BP one zu Beginn der Mitose vom Chromatin und bildet einen dünnen Schleier um die kondensierenden Chromosomen. Wenn die Teleph auftritt und die Mitose zu Ende geht, aggregiert sich 53 BP wieder zu verschiedenen Herden. Wir hoffen, dass dieses Video es Ihnen ermöglicht, die raum-zeitlichen Beziehungen von Proteinen, die an der DNA-Schadensreaktion beteiligt sind, sowie andere Signalwege zu untersuchen.

Im Bereich der Chromatindynamik wurde diese Technik beispielsweise verwendet, um zu untersuchen, wie die Bindung von 53 BP one die Bewegung der telomeren Enden der DNA beeinflusst. Nach der Erzeugung genetisch veränderter Zellen kann in etwa vier bis acht Stunden eine Zwei- und 3D-Lebendzellbildgebung durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass die Mikroskopeinstellungen entsprechend angepasst sind, um eine optimale Bildgebung zu erzielen.