Name: Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Erfahren Sie Live-Cell-Imaging in 2D und 3D zur Untersuchung von DNA-Reparaturproteinen wie 53BP1. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse räumlich-zeitlicher Proteinbeziehungen bei DNA-Schäden und während der Mitose.

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Unterstützte teilweise durch R01NS064593 und R21ES016636 (KV). Mikroskopie wurde an der VCU durchgeführt - Department für Neurobiologie und Anatomie Microscopy Facility, unterstützt, zum Teil mit Mitteln aus NIH-NINDS zentralen Kern Gewährung 5P30NS047463. Das Spinning Disc konfokalen Mikroskop wurde mit einem NIH-NCRR award (1S10RR027957) erworben.

A. Cell Preparation <ol><li> Normale menschliche Fibroblasten (GM02270) wurden aus Coriell Zelle Repository, Camden, New Jersey, erhalten und verewigte mit hTERT 6. Die Zellen wurden gezüchtet und in CellStar expandiert 6-cm-Schalen in Medien (4 ml) bestehend aus MEM mit 20% fötalem Rinderserum (GIBCO), non-essential/essential Aminosäuren, Vitamine, Natriumpyruvat, und Penicillin / Streptomycin (HyClone ergänzt ). </li><li> Menschliche embryonale Nieren-293 (HEK293) Zellen wurden von American Type Culture Collection erhalten und gezüchtet und in CellStar 6-cm-Schalen erweitert. Die Zellen wurden in Medien (4 ml) bestehend aus DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, nicht-essentielle Aminosäuren, L-Glutamin und Penicillin / Streptomycin gehalten. </li><li> 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene Plasmid 19.836) und H2B-GFP (PCLNR-H2BG; Addgene Plasmid 17.735) Fusionsgen Konstrukte auch exprimieren Puromycin oder G418-Resistenz-Gene wurden jeweils transduziert (fibroblaM.) oder transfizierten (HEK293) mit SuperFect (Qiagene) in Zellen und gepflegt unter Drogen Auswahl. Wartung der Fluoreszenz wurde periodisch überprüft. </li><li> 24-48 Std. vor Bildaufnahme, wurden Zellen in eine Einzelzell-Suspension trypsiniert und ausgesät in einer niedrigen Dichte auf 3,5-cm FluroDish Glasbodenplatten. </li></ol> B. Mikroskop Setup und Image Acquisition Dieses Protokoll wurde entwickelt, mit dem Zeiss Cell Observer SD Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop mit einem AxioObserver Z1 Stand, ein Dual-Channel-Yokagawa CSU-X1A 5000 Spinning-Disk-Einheit, 2 Photometrics QuantEM 512SC emCCD Kameras, ein HXP 120C Faser-basierten Illuminator, 4 ausgestattet Laser (a Lasos 100mW mehrzeiligen Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm Diode, 40 mW 561 nm Diode und 30 mW 635 nm Diode), AOTF ein Pecon XL multiS1 Stufe Inkubationssystem, Zeiss Inkubation Module (O 2-Modul S, CO 2-Modul S, TempModul S, Heating Unit XL S) und einer Vor mozed XY Bühne mit einer NanoScanZ Piezo Z-Einsatz. Um sphärische Aberrationen zu minimieren, während Bildgebung lebende Zellen in einem wässrigen Medium, einem C-Apochromat 63x/1.20 Wasser / Corr Objektivlinse und Zeiss Immersol W Immersionsflüssigkeit (mit einem Brechungsindex n = 1,334) gelagert wurden verwendet. Für 2-Kanal konfokale Abbildung, eine RQFT 405/488/568/647 dichroitischen Spiegel und BP525/50 (grün) und BP629/62 (rot) Emissionsfilter wurden verwendet. Die System-Software verwendet wurde, war Zeiss Axiovision (Version 4.8.2.0) mit AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Physiologie, MosaiX, Mark &amp; ​​Find, Dual-Kamera, Inside 4D, Autofokus und 3-D Dekonvolution Module. <ol><li> Sicherzustellen, dass CO 2-Gas mit dem CO 2-Modul der Inkubation System läuft. Wenn das Mikroskop durch einen Anti-Vibrations Lufttisch unterstützt wird, auf der Luftzufuhr (oder N 2-Gas) für das Lufttisch einzuschalten. </li><li> Schalten Sie die Stromversorgung für das Stativ, Spinning-Disk-Einheit, Kameras, Inkubation Module, HXP Illuminator, motorisierten Bühne, ArgonLaser und Computer. </li><li> Nach 1 min Aufheizzeit, drehen Sie den Zündschlüssel für den Argon-Laser auf &quot;On&quot;. </li><li> Auf dem Zeiss Laser Bedienfeld auf den Schalter für die Laser-Linien genutzt werden kann. </li><li> Schalten Sie den Schalter für die Lasos Argon-Laser-Controller von &quot;Standby&quot; auf &quot;Laser run&quot; und stellen Sie die Licht-Controller auf das optimale Niveau (dh knapp unterhalb der Stelle, wo die grüne Anzeige leuchtet rot). </li><li> Starten Sie die Software AxioVision. Hinweis: die Benutzeroberfläche für AxioVision kann mit Fenstern und Pull-Down-Menüs, die spezifisch für die jeweilige Mikroskop und Komponenten, die es steuert sich den Kundenwünschen angepasst werden. Als solche hat jedes System eine potenziell einzigartige Schnittstelle. Daher sind allgemeine Anweisungen für die Software-Manipulation in den nachfolgenden Schritten vorgesehen, anstatt Richtungen für spezifische Software-Fenster, Tabs und / oder Pull-down-Menüs. </li><li> Ungefähr 1 Stunde vor der Bildgebung in der Software, Finden die Bedienelemente für den Inkubator undEinschalten der Heizung für die obere Kammer und der Tischplatte. Stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Schalten Sie den CO 2-Steuerung und den Pegel bei 5%. </li><li> Wählen der Objektivlinse zum Abbilden. In dieser Studie wurde ein 63x/1.20 NA C-Apochromat Wasser / Corr Objektivs verwendet. Hinweis: Für dieses Objektiv, ein Immersionsmedium mit einem ähnlichen Brechungsindex Wasser (Zeiss Immersol W Immersionsflüssigkeit) benötigt. </li><li> Wenn mehrere getrennte Positionen über einen langen Zeitraum hinweg abgetastet werden, sicher sein, um eine ausreichende Menge an Immersionsmedium anwenden, um sicherzustellen, dass sie von einer Position zu einer anderen durchgeführt wird. </li><li> Setzen Sie die Schüssel auf der Bühne und bringen das Objektiv bis in Kontakt mit dem Boden. </li><li> Verwenden Sie entweder das Mikroskop Kontrollen oder die Software, leiten das emittierte Licht zu den Okularen und wählen Sie die entsprechende Weitfeld Filter für das Fluoreszenz-Signal von Interesse (für diese Studie, &quot;Red&quot;-Filter für 53BP1 und einem &quot;GFP&quot;-Filter gesetzt für H2B gesetzt ). &lt;/ Li&gt; <li> Blick durch die Augenlinsen, das Bild scharf, und suchen Sie einen geeigneten Bereich der Zellen. </li><li> Verwenden Sie entweder die Software oder das Mikroskop Kontrollen richten das emittierte Licht von der Okulare in den Hafen mit dem konfokalen Spinning Disc Einheit. </li><li> In der Software auf den entsprechenden Laser (für diese Studie, die 561 nm Laser für 53BP1 und der 488 nm-Linie des Argon-Laser für H2B) drehen. </li><li> Für jeden Kanal, um die Intensität des Lasers durch Einstellen der akustooptische abstimmbare Filter (AOTF)-Steuerung auf einen geeigneten Pegel. </li><li> Wählen Sie den entsprechenden dichroitischen Spiegel (RQFT 405/488/568/647) und Emissionsfilter (BP 629/62 für 53BP1 und BP 525/50 für die H2B). Öffnen Sie den Rollladen in die sich drehende Scheibe Einheit. </li><li> Wählen Sie die &quot;Live&quot;-Fenster, um das aktuelle Sichtfeld angezeigt. </li><li> In der Software, öffnen Sie die &quot;Kamera&quot;-Steuerung, wählen Sie die Kamera verwendet werden (wenn ein Dual-Kamera-System) und die Belichtung der Zeit auf etwa 100 ms. Passen Sie die% und EM zu gewinnen, wie ang. Essary Hinweis: Die 53BP1-mCherry Konstrukt erscheint etwas dunkler. Wir fanden es hilfreich, die EM gewinnen zu erhöhen. </li><li> In der Software, öffnen Sie die Steuerung für die konfokale Spinning Disc-Einheit und stellen Sie den drehenden Scheibe Geschwindigkeit durch Eingabe der Kamera-Belichtungszeit, die auf ein geeignetes Bild (zB ~ 100 ms) zu erfassen war. Klicken Sie auf &quot;Set&quot; in der Änderung zu sperren. </li><li> Öffnen Sie &quot;multi-dimensionale Erfassung&quot;. Wählen Sie den Kanal Registerkarte und laden / Auswahl geeigneter Kanäle. Für diese Studie verwenden wir Kanäle für dsRed (561 nm Laser-Anregung und BP 629/62 Filter für Emission) und GFP (488 nm Laserlinie für die Anregung und BP525/50 Filter für Emission) definiert. </li><li> Um Bildregistrierung zu gewährleisten, wurde eine gemeinsame dichroitischen Spiegel (RQFT 405/488/568/647) für beide Kanäle verwendet. Stellen Sie die Software auf &quot;Autofokus&quot;. Hinweis: Gehen Sie zu Extras → Einstellungen Editor, um die MDA-Einstellungen anpassen. Stellen Sie sicher, dass eine angemessene Laserleistung eingestellt wird (&quot;Adequate Laserleistung&quot; bezieht sich auf eine Einstellung, die es Ihnen ermöglichtdie entsprechende Fluorophor erregt bei gleichzeitiger Minimierung Fotobleichen). </li><li> Im MDA-Fenster, wählen Sie die z-Stapel Registerkarte. Wählen Sie &quot;Z-Stapel an der aktuellen Fokus Position&quot;. Stellen Sie den Bereich für ~ 10 um Z-Stapel und wählen Sie &quot;optimal&quot; für die Anzahl der Schritte zur Nyquist bis Z. Hinweis zu gewährleisten: Die genaue Größe des z-Stack wird von der Höhe Ihrer Zellen ab. Entsprechend anpassen. </li><li> 23. Klicken Sie auf &quot;Start&quot; und analysieren die resultierende z-Stapel-Aufnahme zu gewährleisten, die Einstellungen entsprechend für das, was Sie untersuchen (z. B. in dieser Studie war es wichtig, zur Abbildung des gesamten Kern). </li><li> Wählen Sie die &quot;T&quot; (Zeit)-Registerkarte. Für unser Experiment mit Camptothecin, setzen wir das Intervall zwischen Bildgebung Zeitpunkten bis 5 min und die gesamte Dauer der Sitzung für 1 h bei einer Kontrolle (unbehandelte Zellen) Video. Hinweis: zu minimieren Fotobleichen der Zellen, das Experiment sollten so konfiguriert sein, dass der AOTF Zuschnitte den Laser zwischen Bildgebung Zeitpunkten. </li><li> Foder Multi-Punkt-Darstellung von mehreren Zellen in der Schale, im MDA-Fenster, wählen Sie die Registerkarte Position. Stellen Sie sicher, &quot;Apply&quot;-Einstellung vor / nach dem Zeitpunkt &quot;pro Position&quot; aktiviert ist. Wählen Sie &quot;Mark_Find&quot;. Mit der &quot;Live&quot;-Ansicht, bewegen Sie den Teller um und wählen Sie die entsprechenden Sichtfelder. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start&quot; in der multi-dimensionalen-Akquisition Menü, um das Experiment zu beginnen und aufzuzeichnen eine Steuerung Video (von unbehandelten Zellen). </li><li> Nach der Kontrolle Video, fügt die entsprechende Behandlung (in diesem Fall 10 uM Camptothecin). Wir nahmen die experimentelle (drug-behandelten Zellen) Video bei 5-10 min Intervalle für 2-4 Std. Hinweis: Eine wichtige Frage zu prüfen, ist die Geschwindigkeit, mit der ein bestimmter Effekt tritt nach der Behandlung. Wie im Video zu sehen, beginnen 53BP1 Herde von ~ 5 min nach Zugabe von CPT. Obwohl ein relativ einfacher Vorgang, indem Arzneimittels für die Spiegel manuell und wieder Kalibrierung des Mikroskops braucht Zeit. Dabei müssen diese angegeben werden bei der Gestaltung Experimente. </li><li> Für die Überwachung mitosis setzen wir den Abstand zu 7,5 min und aufgezeichnet für 4-5 h (die spezifischen Einstellungen hängen von der verwendeten Zelllinie und der Länge seiner Zellzyklus). Anpassungen müssen vorgenommen werden, um Fotobleichen bei längeren Aufnahmen zu verhindern. </li></ol> C. Bildverarbeitung und-analyse Dieses Protokoll wurde entwickelt, mit Volocity Software (PerkinElmer). Die Software verwendet werden, um diese Daten (AxioVision) erwerben hat auch die Fähigkeit, Bilder zu verarbeiten und zu analysieren. Benutzer werden aufgefordert, die Software zur Verfügung, um sie zu nutzen, und wenden Sie sich entsprechende Literatur im Hinblick auf ihre Anwendung. <ol><li> Öffnen Volocity Software. Erstellen und benennen Sie eine neue Bibliothek, und importieren Sie Ihre Video-Dateien. </li><li> Zum Öffnen der Dateien haben wir in der Regel finden es sehr hilfreich, um die &quot;Extended Focus&quot;-Einstellung verwenden. Dies überlagert die Z-Stapel Scheiben und, für dieses Protokoll, ermöglicht es uns, 53BP1 Foci in verschiedenen Bereichen des Kerns zu visualisieren. </li><li> Passen Sie Videos wie nötig. Volocity wird mit einer Reihe von Tools, um die Qualität der aufgenommenen Bilder zu verbessern ausgestattet. Durch die Sicherstellung der Einstellungen am Mikroskop angemessen waren, kann viel Zeit bei der Bearbeitung später gespeichert werden. Oft ist es hilfreich, Ihre Bilder deconvolve, und passen Sie die Helligkeit / Kontrast. Ihre spezifische Bearbeitung Bedürfnisse werden auf der Grundlage des Experiments variieren. </li><li> Fügen Sie einen relativen Zeitstempel und Maßstab. </li><li> Um Zellen in 3-D zu sehen, die &quot;3-D Deckkraft&quot; Einstellung. Dies erlaubt eine Drehung der 3-D gerendert Zellen im Raum, wodurch mehrere Perspektiven von Strukturen von Interesse in den Zellen. Hinweis: Es ist hilfreich, um Zellen in unterschiedlichen Ebenen visualisieren zu bestimmen, wo Strukturen von Interesse anzeigen. Zum Beispiel wird in dem &quot;Extended Focus&quot;-Einstellung ist es schwierig zu erkennen, dass die 53BP1 bedeutet in der Tat von der DNA dissoziiert während der Mitose. Dies ist jedoch ohne weiteres ersichtlich in 3-D. </li><li> Filme und Standbilder können in einer Vielzahl von Dateitypen auf Benutzer Präferenz exportiert werden. </l<html> i&gt; </ol> D. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für 53BP1 Foci-Bildung in Abhängigkeit von CPT wird in Abbildung 1 gezeigt. Cells CPT Form Brennpunkte innerhalb von 5-10 min ausgesetzt, und pflegen diese Schwerpunkte während der gesamten Dauer der Aufnahme. Wie in 2, 53BP1 dissoziiert von Chromatin zu Beginn der Mitose gezeigt, Bilden einer dünnen Dunst um den kondensierenden Chromosomen. Als Telophase auftritt und Mitose zu einem Ende kommt, 53BP1 wieder Aggregate in verschiedene Schwerpunkte. Während die HEK293-Zellen wurden nicht CPT ausgesetzt, sie dennoch gebildet reichlich, spontane 53BP1 Reparatur Brennpunkte durch endogene DNA-Schäden erzeugt. Diese Beobachtung erlaubt uns zu dem Schluss, dass 53BP1 nicht bilden Schwerpunkte in der frühen Mitose, im Einklang mit einem früheren Bericht zeigt einen ähnlichen Effekt nach der Exposition von Zellen gegenüber ionisierender Strahlung und radiomimetische Drogen 5. Abbildung 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Camptothecin (10 uM) und bewirkt DSBs 53BP1 Foci-Bildung in Fibroblasten Rad innerhalb von 30 min der Zugabe des Arzneimittels an das Medium. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Abbildung 2. 53BP1 nicht bilden Schwerpunkte während der Mitose bis telophase/G1 in HEK293 Zellen.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Aufrechterhaltung der genomischen Integrität ist entscheidend für das Überleben der Zelle. Die Nichtbeachtung der Genom führt zu vorzeitigem Altern, Karzinogenese oder Tod 8 erhalten. Es gibt intensive Interesse an anspruchsvollen, wie die DDR-Funktionen, die sich aus ihrer Bedeutung sowohl Grundlagen-und klinischen Forschung. Viele Techniken wurden im Laufe der Jahre entwickelt, um bei der Untersuchung, wie Zellen erkennen und zu reparieren DNA-Schädigung zu unterstützen. Traditionelle Methoden wie Immunzyto...

<table border="1"><tbody><tr><td> Produkt </td><td> Firma </td></tr><tr><td> CellStar Kulturschalen </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish Glasboden Gerichten </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> MEM-Medien </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminosäuren </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitamine </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Plasmid 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> PCLNR-H2BG; Plasmid 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss Cell Observer SD Imaging Systems </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (Release 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Oil </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity Software (Version 6,0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

zwei-und dreidimensionale live cell imaging der dna-reparatur-proteine

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Doppelstrangbrüche (DSB) sind die meisten schädlichen DNA-Läsionen eine Zelle begegnen kann. Wenn links unrepariert, um DSBs Hafen ein großes Potenzial zu generieren Mutationen und chromosomalen Aberrationen 1. Um dieses Trauma Katalysieren genomische Instabilität zu verhindern, ist es von entscheidender Bedeutung, damit Zellen DSBs detektieren, die DNA-Schäden Reaktion (DDR) zu aktivieren, und die Reparatur der DNA. Wenn angeregt, arbeitet der DDR zur genomischen Integrität durch das Auslösen des Zellzyklus zu ermöglichen für die Reparatur stattfinden oder zwingen die Zelle zur Apoptose bewahren. Die vorherrschenden Mechanismen der DSB-Reparatur entstehen durch homologe end-joining (NHEJ) und homologe Rekombination Reparatur (HRR) (bewertet in 2). Es gibt viele Proteine, deren Tätigkeiten müssen genau orchestriert werden für die DDR, um richtig funktionieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren für 2 - und 3-dimensionale (D) Visualisierung von einem dieser Proteine, 53BP1. Das p53-bindendes Protein 1 (53BP1) lokalisiert BereichenDSBs durch Bindung an modifizierten Histonen 3,4 bilden Schwerpunkte innerhalb von 5-15 Minuten 5. Die Histon-Modifikationen und Rekrutierung von 53BP1 und andere DDR Proteine ​​DSB Seiten werden geglaubt, um die strukturelle Neuordnung der Chromatin um Bereiche des Schadens erleichtern und dazu beitragen, DNA-Reparatur 6. Über die direkte Beteiligung der Reparatur wurden zusätzliche Rollen für 53BP1 worden in der DDR beschrieben, wie die Regulierung eines Intra-S Kontrollpunkt, einen G2 / M Kontrollpunkt, und Aktivieren stromabwärts DDR Proteine ​​7-9. Vor kurzem wurde entdeckt, dass 53BP1 bildet keine Foci in Reaktion auf DNA-Schäden während der Mitose induziert, anstatt abzuwarten, bevor Zellen G1 Lokalisierung zu der Nähe DSBs 6 einzugeben. DDR Proteine ​​wie 53BP1 haben sich mit mitotischen Strukturen (wie Kinetochoren) während der Progression durch Mitose 10 zuzuordnen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von 2 - und 3-D Live Cell Imaging zu visualisierendie Bildung von 53BP1 Foci in Reaktion auf das DNA-schädigende Mittel Camptothecin (CPT) sowie das Verhalten 53BP1 während der Mitose. Camptothecin ist ein Topoisomerase-I-Inhibitor, der in erster Linie verursacht DSBs während der DNA-Replikation. Um dies zu erreichen, haben wir eine bisher beschriebenen 53BP1-mCherry fluoreszierende Fusionsprotein zu konstruieren, bestehend aus einem 53BP1 Proteindomäne können DSBs 11 binden. Darüber hinaus haben wir ein Histon H2B-GFP fluoreszierende Fusionsprotein zu konstruieren können Chromatin Dynamik während des Zellzyklus, insbesondere aber zu überwachen während der Mitose 12. Live Cell Imaging in mehreren Dimensionen ist ein hervorragendes Werkzeug, um unser Verständnis der Funktion der DDR Proteine ​​in eukaryotischen Zellen zu vertiefen.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung eines DNA Doppelstrangbruch Signalprotein als Reaktion auf DNA-Schäden sowie seine Lokalisierung während der Mitose aktiviert.

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Doppelstrangbrüche (DSBs) sind die schädlichsten DNA-Läsionen, mit denen eine Zelle konfrontiert werden kann. Bleiben DSBs unrepariert, bergen sie ein großes Potenzial zur Erzeugung von ...

Diese Demonstration nutzt die Live-Cell-Bildgebung in zwei und drei Dimensionen, um die räumlich-zeitlichen Beziehungen von Proteinen zu verstehen, die an der DNA-Schadensantwort beteiligt sind. Transfizieren oder transduzieren Sie zunächst Ihre gewünschte Zelllinie mit Expressionskonstrukten, die geeignete fluoreszierende Marker enthalten. Hier sind mCherry und GFP. Danach erwerben Sie eine Reihe von Kontrollvideos, die die fluoreszenzmarkierten Zellen unter Normalbedingungen zeigen.Wenden Sie dann eine geeignete Behandlung an und erfassen Sie Daten über die Wirkung der Behandlung auf den fluoreszierenden Zellprozess, und analysieren Sie die Videodaten hinsichtlich räumlich-zeitlicher Beziehungen der Proteine. Letztendlich kann die Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen zelluläre Dynamiken im Detail darstellen, wie beispielsweise die Bildung von 53 BP1-Foci als Reaktion auf DNA-schädigende Agenzien oder das Verhalten von 53 BP1 während der Mitose. Wir interessierten uns erstmals für 2D- und 3D-Abbildungen im lebenden Zustand, als wir untersuchen wollten, wie unterschiedliche Behandlungen die Mitose in bestimmten Zelllinien beeinflussen.Dieser experimentelle Ansatz ermöglicht es uns, die Antwort auf DNA-Schäden und die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität einfacher zu untersuchen als mit herkömmlichen Methoden. Zusätzlich können Sie diese Methode nutzen, um zu erforschen, wie bestimmte Proteine in verschiedenen Signalwegen und Zelllinien miteinander interagieren. Der Hauptvorteil der Live-Cell-Bildgebung gegenüber traditionellen Techniken wie der Cytochemie besteht darin, dass sie die Untersuchung der Proteine der DNA-Schadensantwort in Echtzeit erlaubt.Die Optimierung der richtigen Aufnahmebedingungen kann herausfordernd sein. Diese Demonstration kann genutzt werden, um die zahlreichen kleinen Schritte zu erkennen, die für den Erfolg erforderlich sind. Denken Sie daran, dass sich Hartnäckigkeit auszahlt, wenn es darum geht, die Photo-Bleaching-Effekte zu minimieren, die geeigneten Aufnahmeintervalle und die richtige Aufnahmedauer zu finden, usw.Transfizieren oder transduzieren Sie die geeigneten Zelllinien mit den Plasmiden zur Expression der mCherry- und GFP-Fusionsproteine. Kultivieren Sie die Zellen unter Antibiotikaselektion und überprüfen Sie regelmäßig am Tag vor der Bildaufnahme die Expression der fluoreszierenden Proteine. Gewinnen Sie die Zellen mittels Trypsin. Dann säen Sie Kulturen mit geringer Dichte auf 3,5 cm Fluoroschalen mit Glasboden. Dieses Protokoll wurde unter Verwendung des Zeiss Cell Observer SD Spinning-Disk-Konfokalmikroskops entwickelt, das mit einem Axio Observer Z1-Stativ ausgestattet ist. Überprüfen Sie zunächst, ob das CO2-Gas zur CO2-Einheit des Inkubationssystems geleitet wird. Falls das Mikroskop auf einem schwingungsisolierten Airtable steht, schalten Sie die Luftzufuhr für den Airtable ein.Schalten Sie nun die Stromversorgung für die Mikroskopstativ-Spindelscheiben-Einheit, Kameras, Inkubationsmodule, HXP-Beleuchtungseinheit, motorisierte Probennabe und den Computer ein. Schalten Sie die Schalter für die verwendeten Laserlinien ein. Starten Sie die Axio-Vision-Software.Die Avision-Software kann mit Fenstern und Dropdown-Menüs angepasst werden, die spezifisch für das Mikroskop und die von ihm gesteuerten Komponenten sind. Daher kann jede Benutzeroberfläche ein potenziell einzigartiges Aussehen aufweisen. Ungefähr eine Stunde vor der Bildaufnahme die Bedienelemente für den Inkubator suchen und die Heizung für die obere Kammer sowie die Objekttischplatte einschalten.Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Schalten Sie die CO2-Steuerung ein und stellen Sie den Wert auf 5 % ein. Wählen Sie das Objektiv für die Bildgebung in dieser Studie aus. Für das Objektiv ist ein Immersionsmedium erforderlich, dessen Brechungsindex dem von Wasser ähnelt.Wenn Sie mehrere Positionen über einen längeren Zeitraum abbilden müssen, stellen Sie sicher, dass ausreichend Immersionsmedium verwendet wird, damit das Objektiv nicht austrocknet. Stellen Sie die Kulturschale auf den Objekttisch und bringen Sie das Objektiv mit dessen Unterseite in Kontakt, entweder mithilfe der Mikroskopsteuerung oder der Software. Leiten Sie das emittierte Licht zu den Okularen und wählen Sie den geeigneten Weitfeld-Filter für das gewünschte fluoreszierende Signal aus.Sehen Sie nun durch die Okularlinsen. Bringen Sie das Bild in den Fokus und suchen Sie mithilfe der Software oder der Mikroskopsteuerung ein geeignetes Zellfeld. Leiten Sie das emittierte Licht in der Software von den Augenstücken zur Ausgangsöffnung mit der Konfokal-Spindelscheibe um.Schalten Sie den für diese Studie geeigneten Laser ein. Stellen Sie für jeden Kanal die Intensität des Lasers durch Einstellung des Kuo-Optik-justierbaren Filterreglers auf ein geeignetes Niveau ein. Wählen Sie anschließend den geeigneten dichroitischen Spiegel und die entsprechenden Emissionsfilter aus.Öffnen Sie den Verschluss zur Drehtellereinheit. Wählen Sie nun das Live-Fenster, um das aktuelle Sichtfeld anzuzeigen. Öffnen Sie jetzt das Kamera-Steuerungsfenster.Wählen Sie die zu verwendende Kamera aus und stellen Sie die Belichtungszeit auf etwa 100 Millisekunden ein. Passen Sie den Prozentsatz und den EM-Verstärkungsfaktor nach Bedarf an. Öffnen Sie außerdem die Steuerung für die konfokale Spinning-Disk-Einheit und stellen Sie die Spinning-Disk-Drehzahl ein, indem Sie die eingestellte Kamerabelichtungszeit eingeben, die zur Aufnahme eines geeigneten Bildes verwendet wurde.Klicken Sie auf „Setzen“, um die Änderung zu bestätigen. Öffnen Sie nun das Fenster für die mehrdimensionale Aufnahme. Wählen Sie den Kanalreiter aus und laden oder wählen Sie die für die Flora Fours definierten geeigneten Kanäle.Um die Bildregistrierung sicherzustellen, verwenden Sie einen gemeinsamen Dichroikspiegel für beide Kanäle. Stellen Sie die Software auf automatische Fokussierung ein. Wechseln Sie zum MDA-Fenster und klicken Sie auf den Reiter ZS-Stack.Wählen Sie den ZS-Stack in der aktuellen Fokusposition aus. Stellen Sie den Bereich für einen 10-Mikrometer-Zack ein und wählen Sie die optimale Anzahl von Schritten, um eine Nyquist-Abtastung entlang der Z-Achse sicherzustellen. Klicken Sie nun auf „Start“ und analysieren Sie das resultierende Z-Stack-Bild. Wählen Sie den Reiter „Zeit“ aus.Stellen Sie das Intervall zwischen den Bildaufnahmezeitpunkten und die Gesamtdauer der Sitzung ein. Öffnen Sie beim Mehrpunktbildgebungsverfahren mehrerer Zellen in der Petrischale das MDA-Fenster. Wählen Sie den Reiter Position und vergewissern Sie sich, dass die Einstellung vor oder nach dem Zeitpunkt pro Position angewendet wird.Wählen Sie nun „Mark“ aus. Suchen Sie mithilfe der Live-Ansicht, bewegen Sie die Petrischale und wählen Sie geeignete Bildfelder aus. Klicken Sie im Menü für die mehrdimensionale Aufnahme auf „Start“, um das Experiment zu beginnen und ein Kontrollvideo aufzuzeichnen.Fahren Sie fort, indem Sie die geeignete Behandlung hinzufügen, und nehmen Sie das experimentelle Video in festgelegten Zeitabständen über einen definierten Zeitraum auf. Für diese Zelllinie und zur Beobachtung des gesamten Mitosevorgangs verwendeten wir ein Intervall von siebeneinhalb Minuten über einen Zeitraum von vier bis fünf Stunden. Sie müssen die spezifischen Einstellungen für Ihre Zelllinie und den zu untersuchenden Prozess selbst festlegen.Öffnen Sie die Velocity-Software, erstellen und benennen Sie eine neue Bibliothek und importieren Sie die experimentellen Videodateien zur Ansicht der Dateien. Versuchen Sie, die Einstellung für erweiterten Fokus zu verwenden, und passen Sie die Videos nach Bedarf an. Velocity verfügt über eine Reihe von Werkzeugen, die dabei helfen, die Qualität der aufgenommenen Bilder zu verbessern.Wenn die Einstellungen am Mikroskop geeignet sind, spart dies später viel Zeit bei der Bearbeitung. Häufig ist es hilfreich, Ihre Bilder zu verarbeiten und Helligkeit und Kontrast anzupassen; Ihre spezifischen Anforderungen variieren je nach Experiment. Um die Zellen in 3D anzusehen, wechseln Sie zur 3D-Opazitätseinstellung.Dies ermöglicht die Drehung der 3D-dargestellten Zellen im Raum und bietet somit mehrere Ansichten der innerhalb der Zellen interessierenden Strukturen. Filme. Standbilder können je nach Benutzerpräferenz in verschiedene Dateiformate exportiert werden. Im Vergleich zu den Kontrollen bildeten Fibroblasten, die CPT ausgesetzt waren, innerhalb von fünf bis zehn Minuten Foci und behielten diese während der gesamten Aufzeichnungsdauer bei.Interessanterweise dissoziiert 53BP1 in menschlichen embryonalen Nierenzellen von der Chromatin zu Beginn der Mitose und bildet einen dünnen Dunstschleier um die kondensierenden Chromosomen. Während der Telophase und dem Abschluss der Mitose aggregiert 53BP1 erneut zu deutlich abgegrenzten Foci. Wir hoffen, dass dieses Video Ihnen ermöglicht, die räumlich-zeitlichen Beziehungen von Proteinen, die an der DNA-Schadensantwort sowie an anderen Signalwegen beteiligt sind, zu untersuchen.Beispielsweise wurde in der Forschung zur Chromatindynamik diese Technik verwendet, um zu untersuchen, wie die Bindung von 53 BP1 die Bewegung der telomeren Enden der DNA beeinflusst. Nach der Erzeugung genetisch veränderter Zellen können zwei- und dreidimensionale Live-Cell-Bildgebungen innerhalb von etwa vier bis acht Stunden durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass die Mikroskopeinstellungen entsprechend angepasst werden, um eine optimale Bildgebung zu erzielen.

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmethode, um die Lokalisation der DNA-Reparaturproteine γH2AX und 53BP1 an den Stellen von Doppelstrang-DNA-Brüchen in bestrahlten Zellkernen sichtbar zu machen.

Immunfluoreszenz-basierte Visualisierung von DNA-Reparaturprotein-Interaktionen

Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

Hier wird gezeigt, wie der in situ Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden kann, um die direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 in Suspensionszellkulturen, die genotoxischen Stress ausgesetzt sind, zu detektieren und zu visualisieren.

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

Laser Microirradiation ist ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur in lebenden Zellen. Ein methodischer Ansatz für die Nutzung der UVA Laser induzieren verschiedene DNA-Läsionen wird angezeigt. Wir haben eine Methode zur lokalen Microirradiation optimiert, die den normalen Zellzyklus unterhält; so fahren Sie bestrahlte Zellen durch Mitose.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschreiben, wie Laser Microirradiation verwenden, um verschiedene Arten von DNA-Schäden, einschließlich der relativ einfachen Strangbrüche und komplexen Schäden an DNA-Schäden Signal- und Reparatur Faktor Montage an Schaden Standorten in-vivo Studie zu induzieren .

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie und Laser Mikro-Bestrahlung Angebot Werkzeuge für die Induktion von DNA-Schäden und die Reaktion der DNA-Reparatur-Proteine in ausgewählten Bereichen der Sub-atomaren Überwachung. Diese Technik hat deutlich erweiterte unsere Kenntnisse der Schaden-Erkennung, Signalisierung und Rekrutierung. Diese Handschrift zeigt diese Technologien, um Einzel- und Doppelzimmer Strang Pause Reparatur zu prüfen.

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Dieser Artikel stellt wesentliche Schritte der Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation vor. Diese Protokolle werden häufig verwendet, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren.

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Dieses Protokoll stellt ein neues Reporter-Gensystem und den Versuchsaufbau zum Nachweis der Transkription bei DNA-Doppelstrangbrüchen mit Einzelmolekülsensitivität vor.

Live-Cell-Bildgebung der Transkriptionsaktivität an DNA-Doppelstrangbrüchen

Erfahren Sie Live-Cell-Imaging in 2D und 3D zur Untersuchung von DNA-Reparaturproteinen wie 53BP1. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse räumlich-zeitlicher Proteinbeziehungen bei DNA-Schäden und während der Mitose.

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

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