Name: Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Erfahren Sie die optische Aufnahme von Membranpotentialen in Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen mit submikrometrischer räumlicher und submillisekundiger zeitlicher Auflösung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung elektrischer Signalintegration in Hirnschnitten.

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Wir sind dankbar, dass unsere Mitarbeiter Knut Holthoff, Arthur Konnerth und Marco Canepari, die in der Anfangsphase der Entwicklung dieser Technik sowie Leslie M. Loew für die freundliche Bereitstellung Farbstoffe teilgenommen. Unterstützt durch NSF IOS-0817969, NIH Zuschüsse NS068407 und M136043 und Kavli Institute for Neuroscience an der Yale University.

Ein. Aufstellbedingungen Schritt 1.1. Imaging Setup Der Schlüssel zur Aufzeichnung Spannung Farbstoff Signale entsprechende Setup-Design. Wir verwenden eine aufrechte Mikroskop (BX51WI Olympus oder Zeiss AxioExaminer) mit drei Kameras ausgestattet. Das Setup wird für die Beleuchtung von einzelnen Neuronen in Hirnschnitten von Anregungslicht in Auflicht-Fluoreszenz, Weitfeldmikroskopie-Modus entweder mit Nikon 60X/1.0 NA oder Zeiss 63X/1.0 NA Wasser Eintauchen Ziele entwickelt. Unsere Mikroskope sind eine Schwingungsisolierung Tisch verschraubt und mit motorisierten beweglichen Stufen. Jedes Mikroskop ist mit drei Kamera-Anschlüssen ausgestattet. Eine Kamera Port verfügt über eine Standard-hohe räumliche Auflösung CCD-Kamera für die Infrarot DIC Video-Mikroskopie (IR-1000, Dage MTI, USA). Die zweite Kamera Port verfügt über eine schnelle Datenerfassung Kamera (bis zu 20 kHz Bildrate) mit relativ geringer räumlicher Auflösung (80 x 80 Pixel), sondern herausragende Dynamik (14 Bit) und außergewöhnlich niedrigen lesenRauschen (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). Die dritte Kamera Port verfügt über eine CCD-Kamera mit hoher Ortsauflösung (pixelfly, 1392x1024 Pixel, PCO AG, Deutschland) auf einem Spinning-Disc konfokalen Scanner (CSU-10, Yokogawa, Japan) verwendet werden, um z-Stacks konfokaler Bilder für sammeln montiert detaillierte morphologische Rekonstruktion des gefärbte Zelle. Ein frequenzverdoppelter diodengepumpten Nd: YVO4 Dauerstrichlaser (400 mW) Emission bei 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, China) ist die Quelle des Anregungslichts. Das 2 mm Durchmesser Laserstrahls gated durch einen Verschluss (LS6; Vincent Associates) mit einem Lichtleiter, der mit dem Mikroskop über einen Single-Port Epifluoreszenz Kondensator (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Deutschland) entwickelt, um die hintere Öffnung des überfüllen gerichtet Ziel und sorgen für eine nahezu gleichmäßige Beleuchtung der Objektebene. Das Laserlicht wird an Stelle eines herkömmlichen Xenon-Bogenlampe, die Empfindlichkeit der V m-Bildgebung durch Maximierung verwendet: (1) unter Verwendung eines monochromatischen exEntgegenhaltung Licht am roten Flügel des Absorptionsspektrums zu V m Empfindlichkeit des Farbstoffes 9, 10 und (2) Erhöhung der Intensität des Anregungslichtes hinter der Ebene, die durch eine Bogenlampe erreicht werden kann maximieren. Das Anregungslicht war der Vorbereitung durch einen dichroitischen Spiegel mit einer zentralen Wellenlänge von 560 nm und die aufgezeichneten Fluoreszenzlicht wurde durch ein 610 nm-Sperrfilter (a Schott RG610) geleitet reflektiert. Die kombinierte Wirkung einer Erhöhung der Lichtintensität und der Verwendung von nahezu optimalen monochromatischen Anregungswellenlängen eine dramatische Verbesserung der Empfindlichkeit von Spannung Bildgebung durch einen Faktor von ungefähr 50 gegenüber vorherigen Messungen 6. Schritt 1,2. Stellen Sie für eine gleichmäßige Ausleuchtung Verwenden Sie ein Fluoreszenz-Dia-Standard (Grünanregung / rote Emission). Setzen geeigneter Neutralfilter im Laserstrahlengang so dass die CCD nicht gesättigt ist. Konzentrieren Sie sich das Ziel auf der Oberflächeder Schieber. Die Position des empfangenden Ende des Quarz-Lichtleiter vor dem Laser Trägerrakete Ziel, und die Position des Ausgangsendes des Lichtleiters an dem Mikroskop unter Verwendung geeigneter Stellglieder auf der Epi-Fluoreszenz Kondensator zu erreichen zentrierte und gleichmäßige Ausleuchtung des Sichtfeldes. Schritt 1,3. Bestimmen Vibrationsgeräusche Legen Sie eine kleine schwarze Tinte Markierung auf der Oberfläche der Fluoreszenz Folie. Rekord Lichtintensität mit NeuroCCD im kontinuierlichen Aufnahmemodus. Konzentrieren Sie sich das Ziel auf einem dunklen Rand der schwarzen Tinte Marke. Aufzeichnung der Lichtintensität für etwa 100 ms bei 2 kHz Bildrate. Anzeigen des räumlichen Durchschnitt der fraktionierten Lichtintensität Spuren (AF / F) von ~ 20 Pixel Empfangen von Licht von dem gleichförmig beleuchteten Bereich und von ~ 20 Pixel entlang der Kante der Tintenmarkierung. Der Überschuss Rauschen in Aufnahmen von Pixel mit hohem Kontrast Kanten spiegelt die Vibrationsgeräusche indas System. Schritt 1,4. Schwingungsisolierung Es ist zwingend erforderlich, um Schwingungen mittels eines vibrationsfreien Isolierungstafel auf ein Niveau unterhalb der Schrotrauschen auf Lichtintensitäten vergleichbar experimentellen Aufnahmebedingungen reduzieren. Einstellen der Schwingungsisolierung Tabelle, bis die Vibrationsgeräusche in der Lichtintensität von Pixeln für den scharfen Rand des Bildes ist vernachlässigbar. Keines der Geräte mit beweglichen Teilen (mechanische Shutter, Lüfter) kann auf dem Tisch montiert werden. Die Kabel von der Ausrüstung auf dem Tisch befestigt zu anderen Bauteilen, die nicht vom Vibrationen isoliert sind, müssen so lose sein, dass sie nicht übertragen mechanische Schwingungen auf das Mikroskop. 2. Die Auswahl eines geeigneten Neuron für V m-Imaging Schritt 2.1. Auswahl von Neuronen Machen Hirnschnitten nach Standardverfahren. Verwenden Sie eine Maus exprimiert, EGFP in einzelnen Nervenzellen interest. Mit einer drehenden Scheibe konfokale System, visualisieren EGFP markierten Neuronen in der Schicht. Wählen Neuronen für V m-Bildgebung mit intakten dendritische / axonalen Bäumen und mit Prozessen, die parallel und nahe an der Oberfläche der Scheibe. Dies kann nicht in Wildtyp-Mäusen erreicht werden, da Axonen und Dendriten dünne, zum größten Teil nicht sichtbar sind DIC Mikroskopie Modus. 3. Lädt Neuronen mit Spannung Farbstoff Schritt 3.1. Füllen des Patchpipette Füllen Glas Patch-Pipetten von der Spitze mit wasserlöslichen freien intrazellulären Lösung durch Anlegen von negativem Druck für etwa 15 s bis zu 2/3 der Elektrode verjüngt. Der Farbstoff freie Lösung in der Spitze ist notwendig, um den Austritt von Farbstoff auf der Scheibe, die die Hintergrund-Fluoreszenz erhöht und reduziert Signal-Rausch-Verhältnis zu verhindern. Back-füllen die Elektrode mit der Lösung, die die Membran durchdringen kann spannungsempfindlichen Farbstoff gelöst JPW3028der intrazellulären Lösung (0,8 mM). JPW3028, das erfolgreichste Spannungssonde für intrazelluläre Anwendung ist ein zweifach positiv geladene Analogon des ANEP Serie lipophiler Styrylfarbstoffen, die noch ausreichend wasserlöslich, um für die Mikroinjektion verwendet werden. Die Di-Ethyl analogen dieses Farbstoffs hat praktisch identische Eigenschaften (einschließlich spannungsgesteuerten Empfindlichkeit) und ist im Handel als JPW1114 (siehe Tabelle 1). Wir bereiten 20 mM Stammlösung in destilliertem H 2 O. 50 ul Aliquots der Stammlösung werden eingefroren bei -20 ° C. Für die endgültige Farbstoffkonzentration von 0,8 mM, wurde mit 2 ul der Stammlösung in 50 ul intrazellulären Lösung auf dem Tag des Experiments gelöst. Die Aktie Farbstofflösung ist stabil und kann bei Raumtemperatur für mehrere Monate aufbewahrt werden. So halten wir ein 50 ul Aliquot bei Raumtemperatur, bis es aufgebraucht ist. Schritt 3,2. Stellen Sie eine Giga-Dichtung schnell <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Patch eine vorher eingestellte Neuron und erlauben die freie Diffusion des Farbstoffes aus einer somatischen Patchpipette dem Soma in der whole-cell-Konfiguration für 20-45 min. Es ist wesentlich, um eine Dichtung so schnell wie möglich zu erhalten, so dass die Menge an Farbstoff-freie Lösung in der Spitze klein gehalten werden kann. Starten Sie durch Üben schnell Patchen ohne Farbstoff in der Elektrode. Anschließend Praxis Patching und Beladung Neuronen mit dem Farbstoff, mit dem Ziel unter Verwendung einer minimalen Menge an Farbstoff-freie Lösung in der Spitze ohne Kontamination der umgebenden Gewebes. Mit der Praxis ist es möglich, eine Dichtung innerhalb von 1-2 min herzustellen. Schritt 3,3. Überwachung des Standes der Färbung Während Farbstoffdiffusion in der whole-cell-Konfiguration, Überwachung des physiologischen Zustands des Neurons durch Aufzeichnen evozierten Aktionspotentialen im Strom-Clamp-Modus. Außerdem überwachen die Menge der Färbung durch Aufzeichnen des ruhenden Lichtintensität (RLI) vom Zellsoma bei einer Bildrate von 2 k<html> Hz und bei einem Bruchteil des vollen Lichtintensität mit Graufilter (wir verwenden 0,04% der Laserlichtintensität von einem Laser 400 mW) eingestellt. Weiterhin den Farbstoff Ladeprozesses, bis der Aktionspotential startet zu verbreitern, in der Regel nach 20 bis 40 Minuten, je nach Größe der Elektrode und Widerstand. Die Verbreiterung des Spike ist völlig reversibel und höchstwahrscheinlich auf kapazitive Last Wirkung der gesättigten Konzentration des Farbstoffes in der somatischen Membran. Die Wellenform der Dorn vollständig wiederhergestellt, nachdem die Farbstoffkonzentration während des Neurons äquilibriert. Schritt 3.4. Entfernen Sie den Farbstoff Elektrode Am Ende der Färbung Zeitraum vorsichtig das Patch-Pipette entfernt vom Soma in Spannungsklammer Konfiguration sichergestellt wird, dass der Übergang von ganzen Zellen, um Outside-Out-Patch-Konfiguration in dem Verfahren erreicht wird. Schritt 3.5. Warten Farbstoffdiffusion ent &quot;&gt; inkubieren Slice für einen zusätzlichen 1,5-2 Stunden bei Raumtemperatur, um die Spannungs-sensitiven Farbstoffs in neuronalen Prozessen zu verbreiten können. Nach einer deutlichen Menge an Farbstoff diffundiert vom Soma in dendritische und axonalen Prozesse, die Wellenform Der AP ist komplett restauriert. 4. Optical Recording Schritt 4.1. Wählen Sie ein zelluläres Kompartiment für die Bildgebung Suchen Sie die soma des gefärbten Neurons unter Schwachlicht Fluoreszenz und re-patch das Neuron mit einem Standard (kein Farbstoff) Patch-Elektrode unter DIC. Visualisieren neuronalen Prozesse unter Schwachlicht bei einer Bildrate von 10 bis 40 Hz in der kontinuierlichen Aufnahmemodus des CCD für spannungsgesteuerten Bildgebung. Reduzieren Sie die Lichtintensität mit Neutralfilter auf das erforderliche Minimum, um das Objekt von Interesse zu visualisieren. Wir nutzen 0,01% der 400 mW Laser-Intensität während der Positionierung des gefärbten Neurons. Mit einem XY-Tisch, positionieren Sie den neuronalen Prozess der Zinsen in ter Mitte der Bildfläche. Schutz der Soma vom Anregungslicht mit dem teilweise geschlossenen Feldblende Iris des Mikroskops. Abschirmung der Soma aus hoher Intensität Anregungslicht wird deutlich verringern die photodynamische Schäden während der Aufnahme. Schritt 4,2 Rekord optische Signale in Bezug auf Membranpotential Transienten Notieren optischer Signale in Bezug auf backpropagated APs in einzelnen dendritischen Verzweigungen. Notieren optischer Signale in Bezug auf APs im Axon. Notieren optischer Signale in Bezug auf backpropagating APs in dendritischen Dornen. Verwenden Bildraten angemessen genaue Rekonstruktion des Signalverlaufs und halten die Aufzeichnungsperioden und Einwirkung hoher Intensität Anregungslicht so kurz wie möglich zu Farbbleichung und photodynamische Schaden zu minimieren. Zum Beispiel prüft der Sequenz von Bildung und Ausbreitung von einzelnen Aktionspotentiale im Axon erfordert Aufzeichnen Perioden von 5-10 msec. Das Anregungslicht intensiviertty während der Aufnahme ist ein Kompromiss zwischen der Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf der einen Seite und dem Grad der Farbbleichung und photodynamische Schäden auf der anderen Seite. Wir verwenden 100% der Intensität des 400 mW Laser Aufnahme von langen Abschnitten der Axone, wenn ein Bereich von 300 um im Durchmesser beleuchtet wird. Wenn das Anregungslicht zu einer 30 um Durchmesser Bereich für dendritische Wirbelsäule Bildgebung fokussiert wird, verwenden wir 10-25% der Laserlichtintensität. Die erforderliche Dauer der Aufnahme ist eine wichtige Determinante des optimalen Anregungslichtintensität, kürzere Erfassungszeiträumen ermöglichen höhere Lichtintensitäten. Die optimale Beleuchtungsstärke wird am besten empirisch für jede Präparation und Messung Einstellungen bestimmt. 5. Data Analysis Schritt 5.1. Korrigieren Sie die Rohdaten für bekannte Fehler Die Analyse und Darstellung von Daten wurden unter Verwendung des NeuroPlex Programm (RedShirtImaging) in IDL (ITT Visual Information Solut schriftliche durchgeführtIonen, Boulder, Colorado) und benutzerdefinierte Visual Basic-Routinen. Unter den Bedingungen einer niedrigen Lichtpegeln, wird die Hintergrundfluoreszenz eine wesentliche Determinante des &amp;Dgr; F / F Signalgröße. Die Rohdaten wurden zuerst für diesen Effekt durch Subtraktion der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität Hintergrund aus einem ungefärbten Bereich auf der Scheibe bestimmt korrigiert. Anschließend wurde das Signal Alignment-Software verwendet, um für zeitlicher Jitter in AP Initiation als auch für mögliche kleine Bewegungen der Zubereitung während der Mittelung zu korrigieren. In der Zeitdomäne wurden AP Signale durch Kreuzkorrelation des elektrisch aufgezeichnet APs in jedem Versuch mit dem Referenzsignal am Anfang Mittelung (1B) erworben ausgerichtet. Im räumlichen Bereich wurden Bilder in zwei Dimensionen offline durch Kreuzkorrelation Bild ausgerichtet sind, um für mögliche kleine seitliche Bewegungen der Herstellung zu kompensieren. Die korrekte Fokussierung des Bildes in der z-Dimension wurde vor jedem einzelnen Studie verifiziert; smal<html> l Anpassungen waren oft notwendig. Die räumlich und zeitlich ausgerichteten Signale wurden gemittelt, wie in 1B gezeigt. Langsame Änderungen in der Lichtintensität durch Bleichen des Farbstoffs wurden durch Unterteilen der Daten von einem entsprechenden Dual Exponentialfunktion der Aufzeichnungsgeräte Versuche ohne Stimulierung (1B) abgeleitet korrigiert. Die Wellenform des Signals AP wurde aus einem Satz von Datenpunkten unter Verwendung kubischer Spline-Interpolation, eine stückweise stetige Kurve, die durch jeden Datenpunkt rekonstruiert. Um zu bestätigen, dass die Spannung-empfindlichen Farbstoff Signal Membranpotential spuren ohne wesentliche Verzerrung am Millisekundenbereich wurde die elektrische AP Signal vom Soma zur optischen AP Signal von der benachbarten Axonhügel wie in 3B gezeigt, verglichen. Die beiden Signale sehr eng überlagern, so dass für das Schrotrauschen in optischen Aufzeichnungsmedien. les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Datenanalyse (Animation). (A) Oben: hochauflösende konfokale Abbildung eines gefärbten Neurons mit Axon in Aufnahmeposition. Recording Elektrode Soma und extrazellulären Stimulationselektrode neben basalen Dendriten schematisch dargestellt angebracht. Aktionspotentiale durch extrazelluläre, synaptische Stimulation hervorgerufen. Unten: geringe räumliche Auflösung Fluoreszenzbild des Axons durch CCD verwendet für V m Bildgebung (B) Elektrode Aufnahmen von soma (schwarze Spuren), optische Aufnahmen von AIS (rote Kurven) und von Knoten Ranvier (grün Spuren) erhalten. . Top Spuren: Rohdaten aus 9 Studien zeigen zeitlicher Jitter in AP Initiation. Zweite Reihe von Spuren: zeitlich ausgerichteten Signale. Dritte Reihe von Spuren: gemittelte Signal. Vierte Reihe von Spuren: bleach Korrektur. Bottom Spuren: kubische Spline-Interpolation mit einem Pass zeitliche Glättung.

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Dejan Zecevic erklärt, dass er ein Miteigentümer RedShirtImaging LLC., Ein Unternehmen im High-Speed-, Low Noise CCD-Kameras in Spannungs-empfindlichen Farbstoff Aufnahme verwendet spezialisiert ist. Alle anderen Autoren berichten keine finanziellen Interessen oder potenzielle Interessenkonflikte im Zusammenhang mit der aktuellen Studie.

Dieser Artikel beschreibt ein Spannungs-empfindlichen Farbstoff-Aufnahme Verfahren zur Überwachung der elektrischen Aktivität einzelner Neuronen mit sub-Mikrometer-und Sub-Millisekunden-raumzeitliche Auflösung. Laseranregung bei nahezu optimale Wellenlänge (bezüglich Signalgröße) verbessert die Empfindlichkeit der Aufnahme um einen Faktor von ~ 50 gegenüber früheren Ansätzen. Die aktuelle Empfindlichkeit ermöglicht die Überwachung elektrischer Signale aus allen Teilen der einzelnen Neuronen, einschließlich Dendriten, Ax...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name der Komponente </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Setup-Komponenten </td></tr><tr><td> Aufrechte Mikroskope </td><td> Olympus Inc. </td><td> BX51WI </td><td> Mit drei Kamera-Anschlüsse </td></tr><tr><td> Motorisierte bewegliche Bühne </td><td> Siskiyou </td><td> MXOPi.2 </td><td></td></tr><tr><td> Epi-Fluoreszenz-Kondensator für Olympus BX51 </td><td> TILL Photonics </td><td> 0000-560-11659 </td><td></td></tr><tr><td> Aufrechte Mikroskope </td><td> Carl Zeiss, LLC </td><td> AxioExaminer D1 </td><td> Mit drei Kamera-Anschlüsse </td></tr><tr><td> Motorisierte Top-Platte </td><td> Scientifica Begrenzte </td><td> MMBP </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Epi-Fluoreszenz-Kondensator für Zeiss AxioExaminer </td><td> TILL Photonics </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Acquisition Kamera </td><td> RedShirtImaging LLC </td><td> NeuroCCD-SM </td><td> Hohe Geschwindigkeit, niedrige Ausleserauschen </td></tr><tr><td> CCD für IR-DIC </td><td> Dage-MTI </td><td> IR-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning-Disc Konfokale Scanner </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-10 </td><td></td></tr><tr><td> Hohe räumliche Auflösung CCD auf Konfokale Scanner </td><td> PCO AG </td><td> Pixelfly </td><td> 1392x1024 Pixel </td></tr><tr><td> DPSS CW Laser (532 nm) </td><td> CNI Optoelektronik Tech. Co., Ltd </td><td> MLL-III-532 400mW </td><td> Anregungslichtquelle </td></tr><tr><td> Multi-Mode Fiber Launcher </td><td> Siskiyou </td><td> SM-CFT </td><td></td></tr><tr><td> Light Guide </td><td> TILL Photonics </td><td> 0000-515-11524 </td><td></td></tr><tr><td> Verschluss </td><td> Vincent Associates </td><td> LS6 </td><td></td></tr><tr><td> Vibration Isolation Tabelle </td><td> Minus k Technologie </td><td> MK26 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td> Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) </td><td> Life Technologies </td><td> D-6923 </td><td> Spannung Farbstoff </td></tr><tr><td> Crym-EGFP Mauslinie </td><td> GENSAT (MMRRC) </td><td> STOCK Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd </td><td> Dünn Ausdruck EGFP in Layer 5 kortikalen Neuronen </td></tr></tbody></table>

voltage-sensitive dye aufnahme von axonen, dendriten und dendritischen spines einzelner neuronen in hirnschnitten

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Das Verständnis der biophysikalischen Eigenschaften und funktionelle Organisation der einzelnen Neuronen und wie sie Informationen verarbeiten ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis, wie das Gehirn funktioniert. Die primäre Funktion einer beliebigen Nervenzelle ist, um elektrische Signale, in der Regel von verschiedenen Quellen verarbeiten. Elektrische Eigenschaften neuronaler Prozesse sind außerordentlich komplex, dynamisch und in der allgemeinen Fall unmöglich, in Abwesenheit von detaillierte Messungen vorauszusagen. Um eine solche Messung würde man erhalten, idealerweise gerne in der Lage zu überwachen, an mehreren Standorten, unterschwelligen Ereignisse, wie sie von den Websites der Herkunft auf die neuronale Prozesse und summieren an bestimmten Orten zu Aktionspotential Einleitung beeinflussen reisen. Dieses Ziel wurde in keiner Neuronen aufgrund technischer Einschränkungen von Messungen, die Elektroden beschäftigen erreicht worden. Um diesen Nachteil zu überwinden, ist es höchst wünschenswert, um den Patch-Elektrode Ansatz mit bildgebenden Verfahren, die umfangreiche parallel recordin ermöglichen ergänzengs von allen Teilen eines Neurons. Hier beschreiben wir eine solche Technik - optische Aufzeichnung des Membranpotentials Transienten mit organischen spannungsabhängigen Farbstoffen (V m-imaging) - gekennzeichnet durch Sub-Millisekunden-und Sub-Mikrometer-Auflösung. Unsere Methode basiert auf bahnbrechenden Arbeiten zur Spannungs-sensitive molekulare Sonden 2 basiert. Viele Aspekte der anfänglichen Technologie wurden kontinuierlich über mehrere Jahrzehnte 3, 5, 11 verbessert. Zusätzlich früheren Arbeiten zwei wesentliche Merkmale von V m-imaging dokumentiert. Erstens sind Fluoreszenzsignale linear proportional zu Membranpotentials über den gesamten physiologischen Bereich (-100 mV bis +100 mV, 10, 14, 16). Zweitens, Be-Neuronen mit der Spannung-empfindlichen Farbstoff welche hier (JPW 3028) nicht nachweisbare pharmakologische Wirkungen. Die aufgezeichneten Verbreiterung der Spitze während der Farbstoff Laden ist vollständig reversibel 4, 7. Zusätzlich zeigt experimentelle Hinweise, dass es möglich ist, zu erhalteneine beträchtliche Anzahl (bis zu hundert) von Aufnahmen vor nachweisbare phototoxische Effekte 4, 6, 12, 13. Derzeit nutzen wir die hervorragende Helligkeit und Stabilität einer Laserlichtquelle bei nahezu optimale Wellenlänge, um die Empfindlichkeit des V m-Bildgebungstechnik zu maximieren. Die aktuelle Sensitivität ermöglicht mehreren Standorten optische Aufnahmen von V m Transienten aus allen Teilen eines Neurons, einschließlich Axonen und Axon Sicherheiten, Terminal dendritischen Zweigen, und einzelne dendritische Dornen. Die erfassten Informationen zu Signals Wechselwirkungen kann quantitativ als auch direkt visualisiert in Form eines Films analysiert werden.

Erfolgreiche Konfokalmikroskopie ermöglichen sollten eindeutige Identifizierung von intakten neuronalen Prozesse, die nahe der Oberfläche der Scheibe sind und sich in einer Ebene des Fokus. Die Auswahl von Nervenzellen, die geeignet sind für Spannung Bildgebung vor Spannungs-empfindlichen Farbstoff Belastung ist kritisch. Ein Beispiel von konfokalen Bildern von L5 pyramidalen Neuronen exprimieren EGFP in einer kortikalen slice (Crym transgenen Maus-Linie) ist in Abbildung 2 gezeigt. Axone einzelner Neur...

Ein bildgebendes Verfahren zur Überwachung des Membranpotentials Änderungen mit sub-Mikrometer-räumlichen und Sub-Millisekunden zeitlicher Auflösung beschrieben. Die Technik, auf Laseranregung von Spannungs-sensitiven Farbstoffen, ermöglicht Messungen von Signalen in Axonen und Axon Kollateralen, Terminal dendritische Äste, und einzelne dendritischen Dornen.

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Das Verständnis der biophysikalischen Eigenschaften und der funktionellen Organisation einzelner Neuronen sowie der Art und Weise, wie sie Informationen verarbeiten, ist grundlegend für das Verständnis ...

Das übergeordnete Ziel der beschriebenen Experimente besteht darin, die Integration von Membranpotentialsignalen und die Informationsverarbeitung durch eine einzelne Nervenzelle optisch mit submikrometer- und submillisekunden-Auflösung an mehreren Stellen eines Neurons zu überwachen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Bildgebungsaufbau mit ausreichender Empfindlichkeit aufgebaut wird, um die Aufzeichnung kleiner relativer Änderungen der Lichtintensität zu ermöglichen, die dem transienten Membranpotential entsprechen. Anschließend werden Neurone mit geeigneter Anatomie ausgewählt, um eine effektive Bildgebung von Neuronen mit langen, intakten Fortsätzen in einer einzigen Fokusebene nahe der Schnittfläche zu gewährleisten.Dann laden Sie die vorab ausgewählten Neuronen mit spannungsabhängigen Farbstoffen, um optisch die Änderungen des Membranpotentials verfolgen zu können. Die Ergebnisse zeigen die einzigartige Fähigkeit dieses Ansatzes, Informationen über die Integration elektrischer Signale durch einzelne Nervenzellen zu gewinnen, indem Membranpotentialsignale von Axonen, Dendriten und dendritischen Dornen überwacht werden. In der zellulären Neurophysiologie.Neue Werkzeuge werde

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieser Bericht zeigt eine Technik zur mechanischen Isolation von einzelnen Neuronen lebensfähig halten befestigt präsynaptischen boutons. Vibrodissociated Neuronen haben die Vorteile der schnellen Produktion, ausgezeichnete pharmakologische Kontrolle und verbesserten Raum-Klemme, ohne Einfluss von benachbarten Zellen. Diese Methode kann für die Bildgebung der synaptischen Elementen und Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet werden.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Patch-Clamp-Aufzeichnung von der dendritischen Membranoberfläche. Dies hilft dabei, die elektrischen Eigenschaften von Dendriten und den zugrundeliegenden spannungsgesteuerten Ionenkanälen in dopaminergen Neuronen direkt zu untersuchen.

Patch-Clamp-Aufzeichnungen vom Dendriten eines dopaminergen Neurons in einem Hirnschnitt

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Beobachtung von Veränderungen der neuronalen Aktivität in einer Gehirnscheibe, die mit einem spannungsempfindlichen Farbstoff gefärbt wurde. Der Farbstoff spiegelt Veränderungen des Membranpotentials des Neurons wider, indem er seine Fluoreszenzintensität verändert. Durch die Anwendung elektrischer Stimuli und fortschrittlicher bildgebender Verfahren ermöglicht dieses Verfahren die visuelle Verfolgung von Echtzeitänderungen des neuronalen Membranpotentials...

Optische Aufzeichnung der neuronalen Aktivität in Hirnschnitten, die mit einem spannungsempfindlichen Farbstoff gefärbt wurden

Dieses Video beschreibt eine Methode zur gleichzeitigen Abbildung und Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von transgenen Gehirnschnitten, die neuronenspezifische fluoreszierende Proteine enthalten. Das Verfahren besteht darin, den Hirnschnitt in einer Perfusionskammer mit belüfteter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit zu halten, fluoreszenzmarkierte Zellen mit einer Lichtquelle anzuregen und die elektrischen Signale mit einer Mehrkanalsonde und einer Patch-Klemme aufzuzeichnen.

Gleichzeitige optische und elektrophysiologische Überwachung von neuronalen Zellen in Hirnschnitten

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Untersuchung der synaptischen Effizienz im lateralen entorhinalen Kortex (LEC) durch optogenetische Stimulation der medialen präfrontalen Kortex (mPFC) Axone und Aufzeichnung der Reaktionen von Pyramidenneuronen im LEC. Diese Methode kombiniert Patch-Clamp-Aufzeichnungen mit synaptischer Aktivierung durch Lichtstimulation, um die synaptische Plastizität zu untersuchen.

Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung synaptischer Ereignisse in Hirnschnitten von Ratten

In diesem Papier beschreiben wir eine nützliche Methode, um Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Neuronen akut isolierten Hirnschnitten studieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Arzneimittels, gefüllte Mikropipette zur lokalen Anwendung von Medikamenten, um unter Verwendung von Standard aufgezeichnet Neuronen Patch-Clamp-Techniken.

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Hier wird ein Verfahren zur selektiven Aktivierung eines neuronalen Proteins mit einem kurzen Lichtimpuls vorgestellt, indem eine photoreaktive unnatürliche Aminosäure genetisch in ein neuronales Zielprotein kodiert wird, das in Neuronen in Kultur oder in vivo exprimiert wird.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Wir führen eine reproduzierbare und stabile optische Aufzeichnungsmethode für Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff ein. Der Artikel beschreibt spannungsempfindliche Farbstofffärbung und Aufzeichnung optischer Signale mit herkömmlichen Hippocampus-Scheibenpräparaten.

Weitfeld-Einzelphotonen optische Aufnahme in Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff

Ex-vivo-Gehirnschnitte können verwendet werden, um die Auswirkungen von flüchtigen Anästhetika auf evozierte Reaktionen auf afferente Inputs zu untersuchen. Optogenetik wird eingesetzt, um thalamokortikale und kortikokkortikale Afferenzen für nicht-primären Neokortex unabhängig zu aktivieren, und synaptische und Netzwerkantworten werden mit Isofluran moduliert.

Optogenetische Aktivierung afferenter Signalwege in Hirnschnitten und Modulation von Reaktionen durch flüchtige Anästhetika

Erfahren Sie die optische Aufnahme von Membranpotentialen in Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen mit submikrometrischer räumlicher und submillisekundiger zeitlicher Auflösung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung elektrischer Signalintegration in Hirnschnitten.

Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

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