Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Das übergeordnete Ziel der beschriebenen Experimente ist die optische Überwachung des Membranpotentials, der Signalintegration und der Informationsverarbeitung durch eine einzelne Nervenzelle mit einer Auflösung von unter einem Mikrometer und unter einer Millisekunde von mehreren Stellen auf einem Neuron. Dies wird erreicht, indem zunächst ein bildgebender Aufbau mit geeigneter Empfindlichkeit aufgebaut wird, der die Aufzeichnung kleiner fraktionierter Änderungen der Lichtintensität entsprechend dem transienten Membranpotential ermöglicht. Wählen Sie als Nächstes die Neuronen mit der entsprechenden Anatomie aus, um Neuronen mit langen intakten Fortsätzen in einer einzigen Fokalebene nahe der Oberfläche des Schnitts effektiv abzubilden.

Laden Sie dann die vorausgewählten Neuronen mit spannungsempfindlichen Farbstoffen, um die optische Verfolgung der Potentialänderungen der Membran zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigen die einzigartige Fähigkeit dieses Ansatzes, Informationen über die elektrische Signalintegration durch einzelne Nervenzellen zu erhalten, indem Membranpotentialsignale von Axonen, Dendriten und dendritischen Dornen überwacht werden. In der zellulären Neurophysiologie.

Neue Werkzeuge werden aufgrund der beiden seit langem bestehenden Einschränkungen der konventionellen Elektrophysiologie entwickelt: die geringe räumliche Auflösung von Elektrodenmessungen und die Unfähigkeit, von kleinen Strukturen wie Axonkollateralen oder dendritischen Dornen aufzuzeichnen. Um diese Nachteile zu überwinden, kann der Patch-Elektroden-Ansatz mit optischen Techniken kombiniert werden, die parallele Aufzeichnungen von allen Teilen eines Neuros ermöglichen. Hier beschreiben wir eine solche Technik, die mehrseitige optische Aufzeichnung von Membranpotentialtransienten mit einer einzigen Spine-Auflösung.

In diesem Experiment werden ein aufrechtes Mikroskop und drei Kameras verwendet, um eine gleichmäßige Ausleuchtung zu gewährleisten. Setzen Sie zunächst einen entsprechenden Graufilter in den Laserstrahlengang ein. Fokussieren Sie als Nächstes das Objektiv auf die Oberfläche des Standard-Fluoreszenzobjektträgers.

Während Sie das CCD-Bild des Sichtfeldes auf dem Monitorbildschirm beobachten, passen Sie die Position des Empfangsendes des Quarzlichtleiters und die Position des Ausgangsendes des Lichtleiters unter Verwendung geeigneter Aktuatoren am Epi-Fluoreszenzkondensor an, um eine zentrierte und gleichmäßige Ausleuchtung des Sichtfeldes zu erreichen. Um das Schwingungsgeräusch zu bestimmen, verwenden Sie einen Standard-Leuchtstoffträger mit einer nicht fluoreszierenden Markierung auf der Oberfläche. Zeichnen Sie die Lichtintensität mit dem Neuro-CCD im Dauerbetrieb auf.

Fokussieren Sie das Objektiv auf einen dunklen Rand der schwarzen Markierung und zeichnen Sie die Lichtintensität für etwa 100 Millisekunden bei einer Bildrate von zwei Kilohertz auf. Zeigen Sie dann den räumlichen Durchschnitt der fraktionierten Lichtintensitätskurven von ca. 20 Pixeln an, die Licht aus dem gleichmäßig beleuchteten Bereich empfangen, und von ca. 20 Pixeln entlang des Randes der schwarzen Markierung. Das übermäßige Rauschen im räumlichen Mittelwert der Pixel mit kontrastreichen Kanten spiegelt das Schwingungsrauschen im System wider.

Es ist wichtig, dass der mechanische Verschluss außerhalb des Schwingungsisolationstisches montiert ist, damit das Öffnen des Verschlusses keine Vibrationsgeräusche in die optische Aufzeichnung einführt. Dies ist ein entscheidender Schritt. Montieren Sie den Verschluss mit Kunststoffschrauben und Schwingungsisolierungsmaterial, um das akustische Schwingungsgeräusch zu reduzieren, das vom optischen Aufzeichnungssystem aufgenommen werden kann.

Um die Vibration zu isolieren, passen Sie die Vibrationsisolationstabelle an, bis das Vibrationsgeräusch der Pixel, die die scharfe Kante des Bildes abdecken, kleiner ist als das Schrotrauschen. Die Gerätekabel auf dem Tisch müssen locker sein, um eine Übertragung der mechanischen Schwingungen auf das Mikroskopfernrohr zu vermeiden. Bei diesem Verfahren werden die Gehirnschnitte mit einer Dicke von 300 bis 400 Mikrometern gemäß Standardverfahren mit einer Mauslinie, die EGFP in einzelnen interessierenden Nervenzellen exprimiert, mit einem konfokalen Spinning-Disc-System präpariert.

Visualisieren Sie die EGFP-markierten Neuronen in der Schnitte. Wählen Sie als Nächstes die Neuronen mit intakten dendritischen Axonbäumen und mit parallel und nahe der Oberfläche des Schnitts verlaufenden Prozessen für die Bildgebung des Membranpotentials aus. Füllen Sie dann eine Glaspflasterpipette von der Spitze aus mit farbstofffreier intrazellulärer Lösung bis zu zwei Dritteln des Elektrodenkegels, indem Sie etwa 15 Sekunden lang Unterdruck ausüben.

Danach wird die Elektrode mit der Lösung befüllt, die den in der intrazellulären Lösung gelösten Membran-IMP-Permeat-empfindlichen Farbstoff enthält. Patchen Sie nun ein zuvor ausgewähltes Neuron innerhalb einer Minute, nachdem Sie den Farbstoff in die Elektrode geladen haben. Üben Sie einen niedrigen Überdruck von etwa 10 Millimetern Quecksilber aus, bevor die Pipette in das Bad abgesenkt wird, und während Sie die Elektrode in der Scheibe positionieren, wird dadurch sichergestellt, dass kein Farbstoff aus der Elektrode austritt, bevor die Versiegelung hergestellt ist.

Erhöhen Sie den Quecksilbergehalt um 100 Millimeter auf hohen Druck, kurz bevor die Elektrode die Zelloberfläche berührt. Wenn Sie die Versiegelung in der gesamten Zellkonfiguration etablieren, können Sie den Farbstoff 20 bis 45 Minuten lang frei von einer somatischen Patch-Pipette in das Soma diffundieren. Überwachen Sie während der gefärbten Diffusion den physiologischen Zustand des Neurons, indem Sie die evozierten Aktionspotentiale im Stromklemmmodus aufzeichnen.

Überwachen Sie zusätzlich das Ausmaß der Färbung, indem Sie die Intensität des Ruhelichts aus dem Zellsoma mit einer Bildrate von zwei Kilohertz und bei einem Bruchteil der vollen Lichtintensität aufzeichnen, der mit Neutraldichtefiltern eingestellt wurde. Setzen Sie den Downloadvorgang fort, bis sich das Aktionspotenzial zu erweitern beginnt. Ziehen Sie am Ende der Färbung die Patch-Pipette vorsichtig vom Soma in Spannungsklemmenkonfiguration weg, um sicherzustellen, dass der Übergang von der gesamten Zelle zur Außen-Außen-Patch-Konfiguration erreicht wird.

S inkubieren Sie die Scheibe dann weitere 1,5 bis zwei Stunden bei Raumtemperatur, damit sich der spannungsempfindliche Farbstoff in den neuronalen Prozessen ausbreiten kann. Nachdem eine signifikante Menge Farbstoff aus dem Soma in die dendritischen und axonalen Fortsätze diffundiert ist, sollte die Wellenform des Aktionspotentials vollständig wiederhergestellt sein. Lokalisieren Sie im nächsten Schritt das Soma des Färbeneurons unter der Fluoreszenz niedriger Intensität.

Reduzieren Sie die Lichtintensität mit Neutraldichtefiltern auf das Minimum, das für die Visualisierung des interessierenden Objekts erforderlich ist, indem Sie einen XY-Tisch verwenden. Scannen Sie den Bereich der Schicht, die das fluoreszierende Neuron enthält, bis das fluoreszierende Soma identifiziert ist. Positionieren Sie das Soma der gefärbten Zelle in der Mitte des Mikroskopfeldes und replizieren Sie das Neuron mit einer Standard-Patch-Elektrode ohne Farbstoff unter der DIC. Visualisieren Sie dann die neuronalen Prozesse unter der Fluoreszenz niedriger Intensität bei einer Bildrate von 10 bis 40 Hertz im kontinuierlichen Aufzeichnungsmodus des CCD für die Spannungsabbildung.

Unter Verwendung einer XY-Tischposition wird der neuronale Prozess von Interesse in der Mitte des Bildgebungsbereichs dargestellt. Schützen Sie das SOMA zusätzlich vor dem Anregungslicht mit der teilweise geschlossenen Feldblende des Mikroskops, um die photodynamischen Schäden zu reduzieren. Erfassen Sie als Nächstes die optischen Signale in Bezug auf sich zurückausbreitende Aktionspotentiale in den einzelnen dendritischen Ästen.

Zeichnen Sie dann die optischen Signale auf, die sich auf Aktionspotentiale im Axon beziehen. Zeichnen Sie danach die optischen Signale auf, die sich auf rückwärts ausbreitende Aktionspotentiale in den dendritischen Dornen beziehen. Verwenden Sie die entsprechende Bildrate für eine genaue Rekonstruktion der Signalwellenform.

Gleichzeitig sollten die Aufzeichnungszeiträume und die Exposition gegenüber hochintensivem Anregungslicht so kurz wie möglich gehalten werden, um Farbstoffbleichen und photodynamische Schäden zu minimieren. Hier wird die Aufzeichnung optischer Signale gezeigt. Hier. Das obere Bild zeigt das hochauflösende konfokale Bild eines gefärbten Neurons mit seinem Axon in der Aufnahmeposition.

Während das mittlere Feld das Fluoreszenzbild des Axons mit geringer räumlicher Auflösung zeigt, das von CCD für die Membranpotentialbildgebung aufgenommen wurde, zeigt das untere Feld die Elektrodenaufnahmen des Somas und optische Aufzeichnungen des A IS und des Knotens von rvi. Die Rohdaten und verarbeiteten Signale werden angezeigt. Diese Abbildung zeigt die Aktionspotentialsignale aus dem Axon eines L-Fünf-Kortikal-Neurons, das mit der spannungssensitiven Farbstoffwirkung beladen ist.

Potentialbezogene Signale wurden mit einer Bildrate von 10 Kilohertz aufgezeichnet. Diese Ablaufverfolgungen geben an, dass die Aktion potenziell vorübergehend von drei Positionen aus ist. Erstens, die Elektrodenaufzeichnung aus dem Soma.

Zweitens, die optischen Aufzeichnungen vom Axonhügel, und drittens, die optische Aufzeichnung vom ersten Ton von vie, und hier sind die überlagerten Signale von denselben drei Orten. Diese Abbildung zeigt einen Ausbruch von vier sich zurückausbreitenden Aktionspotentialsignalen von mehreren Stellen auf dem dendritischen Dorn eines L-Fünf-Kortikal-Neurons, ausgelöst durch kurze depolarisierende Stromimpulse bei 100 Hertz. Hier sind die Aktionspotentialsignale einer einzelnen dendritischen Wirbelsäule dargestellt.

Hier ist die anatomische Rekonstruktion, die aus einem Stapel konfokaler Spinning-Disc-Bilder gewonnen wurde, und hier ist das Fluoreszenzbild derselben Region, das mit der CCD-Kamera aufgenommen wurde. Für die Bildgebung von Membranpotentialen werden im rechten Feld die Fluoreszenzintensitätsspuren angezeigt, die den rückpropagierenden Aktionspotentialen von den Positionen eins bis drei entsprechen, wie auf dem CCD-Bild dargestellt. Die untere Spur zeigt die Elektrodenaufzeichnung aus dem Soma an.

Die Vorbereitung der Voraufzeichnung dauert etwa drei Stunden, einschließlich der Wartezeit für die Ausbreitung der Würfel auf distale Fortsätze. Die Aufnahmezeit wird durch den normalen Ablauf des Präparats und durch die photodynamische Beschädigung des PO begrenzt. Das Ausmaß der photodynamischen Schädigung ist proportional zur Intensität des Anregungslichts sowie zur Dauer und Anzahl der einzelnen Aufnahmeversuche.

In einigen Experimenten ist es möglich, mehr als 50 Aufzeichnungsversuche über ein oder zwei Stunden durchzuführen. Andere Messungen erfordern eine hohe Anregung, Lichtintensitäten und längere Aufzeichnungen und sind durch photodynamische Schäden auf nur einige Aufnahmeversuche beschränkt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Spannungsbildgebung von der gesamten axonalen und endr-Struktur einzelner Neuronen in Hirnschnitten durchführt.