Exploring arteriellen glatten Muskelzellen KV7 Kalium Kanal Funktion mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck Myographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aktivität von KV 7-Kaliumkanälen in frisch dissoziierten glatten Muskelzellen der Mesenterialarterie zu messen und dies mit den Messungen des arteriellen Durchmessers in Beziehung zu setzen, die unter physiologischen Bedingungen aufgezeichnet wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst die mesenteriale Gefäßarkade einer Ratte chirurgisch entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Segmente der Mesenterialarterien zu präparieren und zu reinigen.

Als nächstes werden einige Segmente verwendet, um einzelne glatte Muskelzellen für elektrophysiologische Messungen der Kaliumströme von KV 7 zu isolieren. Der letzte Schritt ist die Kanülierung intakter arterieller Segmente für Druckmyomessungen der arteriellen Verengung oder Dilatation als Reaktion auf die pharmakologischen Modulatoren der Kaliumkanäle KV sieben. Letztendlich wird die Kombination aus Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druckmyographie verwendet, um zu zeigen, wie sich eine Zunahme oder Abnahme der Aktivität von KV 7-Kaliumkanälen auf die mesenteriale arterielle Verengung auswirkt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Verwendung von Klonkanälen, die in Zelllinien exprimiert werden, besteht darin, dass die Ströme von nicht kultivierten Zellen aufgezeichnet werden, die die Kanäle nativ exprimieren, und die KV-Ströme von anderen Klassen von Kaliumkanälen isoliert werden können, die in denselben Zellen aktiviert werden können. Die Druckmyographie ermöglicht es, die funktionellen Reaktionen aus demselben Gewebe zu erfassen, aus dem die isolierten Zellen stammen, und die Methode ist sowohl sensitiver als auch physiologischer als andere Präparate wie Arterienringe oder Arterienstreifen. Dr. Bareth Mani, ein Postdoktorand aus meinem Labor, wird die arteriellen Kanülen- und Druckmyographietechniken demonstrieren, und Dr. Luba Brueggeman, eine wissenschaftliche Assistenzprofessorin in meinem Labor, wird die Verfahren zur Zellisolierung und zum Patch-Plan demonstrieren.

Um diesen Eingriff zu beginnen, schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere ein 10 bis 12 Zentimeter langes Segment an beiden Enden des Dünndarms einer Ratte ab. Isolieren Sie dann den Darm zusammen mit den daran befestigten Gefäßen. Als nächstes fixieren Sie das Segment des Dünndarms.

Verteilen Sie das Mesentar über die nahe Seite der Kammer, so dass sich der primäre Ast der Arteria mesenterica superior in der Mitte befindet und die nachfolgende Reihenfolge der Äste von der Mitte ausgeht. Platzieren Sie dann die Stifte nur auf den Darmsegmenten und visualisieren Sie durch ein beleuchtetes Präpariermikroskop. Befreien Sie das Fettgewebe und das Bindegewebe, das die Arterien zweiter bis vierter Ordnung in der Nähe des Darms umgibt, vorsichtig mit einer Mikrozange und einer Schere.

Halten Sie die angrenzenden Venen, um die Reinigung des Fettgewebes und des Bindegewebes zu erleichtern und unnötige Dehnungen der Arterien zu vermeiden. Übertragen Sie nun zwei bis drei Segmente der Arteria mesenterica in eine 35 Millimeter große Gewebekulturschale, in der sich zwei Milliliter eiskalte Isolationslösung befinden. Stellen Sie die Schale anschließend auf Eis, schneiden Sie die Segmente der Mesenterialarterie mit einer PE in drei bis vier Millimeter lange Stücke, Ihre Pipette mit feuerpolierter Spitze.

Übertragen Sie die arteriellen Segmente in ein Glasfläschchen mit zwei Millilitern vorgewärmter Isolationslösung bei 37 Grad Celsius. Dann inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach 30 Minuten die 37 Grad Celsius heiße Isolationslösung vorsichtig mit einer hinteren Pipette absaugen.

Geben Sie zwei Milliliter warme Enzymlösung hinzu und inkubieren Sie es 35 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Unmittelbar nach der 35-minütigen Inkubation in der Enzymlösung stellen Sie das Fläschchen auf Eis, aspirieren Sie die Enzymlösung und fügen Sie zwei Milliliter eiskalte Isolierlösung hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal.

Wiederholen Sie dann in einem Milliliter eiskalter Isolationslösung die arteriellen Segmente vorsichtig mit der polierten hinteren Pipette 10 bis 20 Mal, um einzelne glatte Muskelzellen der Mesenterialarterie freizusetzen. Überprüfen Sie das Aussehen der Myozyten regelmäßig, indem Sie einen Tropfen der Zellsuspension auf eine 35-Millimeter-Schale geben und sie unter dem Mikroskop betrachten.

Gesunde MA-SMCs sollten ein glattes, längliches Aussehen haben. Übertragen Sie anschließend etwa 100 bis 200 Mikroliter Zellsuspension mit einer polierten pastierteren Pipette in die Aufnahmekammer und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang haften. Füllen Sie in diesem Schritt die Spitze der Patch-Pipette mit Amphotericin B, freier interner Lösung, indem Sie die Pipettenspitze hineinkippen.

Saugen Sie dann am anderen Ende mit einer 10-Milliliter-Spritze an, die über ein Stück Schlauch befestigt ist, und fügen Sie von oben Informationen Terin B mit Pipettenlösung hinzu. Verwenden Sie eine einor Microloader-Pipettenspitze, bis die Pipette etwa zur Hälfte mit Lösung gefüllt ist. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie vorsichtig auf die Pipette klopfen.

Führen Sie danach die Pipette in den Elektrodenhalter ein. Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Pipette auf die Oberfläche eines länglichen Myozyten abzusenken. Wenn der Widerstand der Pipette auf sechs bis 10 Megaohm ansteigt, üben Sie einen Sog aus, um eine Giga-Versiegelung zu erreichen.

Stellen Sie gleichzeitig die Haltespannung auf null Millivolt ein, während Sie auf die Perforation der Membran warten. Wenden Sie als Nächstes Spannungsschritte von 100 Millisekunden auf plus 10 Millivolt und dann auf minus 10 Millivolt an. Verwenden Sie den Verstärker, um die schnelle transiente Pipettenkapazität zu kompensieren, die mit dem Auftreten der Ganzzellkapazität

Transiente kleine anhaltende positive Ströme von zwei bis 10 PICO-Verstärkern, rein und Amplitude weisen auf das Vorhandensein von funktionsfähigen KV-Siebenkanälen hin. Die erfolgreiche Perforation mit Amphotericin B reduziert den Zugangswiderstand auf 35 Megaohm oder weniger. Um die Spannungsbeziehung zwischen KV und sieben Strömen aufzuzeichnen, wenden Sie fünf zweite Spannungsschritte auf Spannungen an, die von minus 84 Millivolt reichen, bei denen die Offenheitswahrscheinlichkeit von sieben KV-Kanälen minimal ist, bis zu plus 16 Millivolt, bei denen die Öffnungswahrscheinlichkeit von sieben KV-Kanälen ein Plateau erreicht. Nach fünf Sekunden bei jeder Prüfspannung gehen Sie für 10 Sekunden auf die Haltespannung bei minus vier Millivolt zurück.

Hängen Sie bei diesem Verfahren zwei vorgefertigte feine Nylonnähte auf jeder Seite locker auf. Angrenzend an die Glaskanüle wurde das präparierte Mesenterialarteriensegment vorsichtig von der Präparierkammer in die Druckmyotransplantatkammer übertragen, indem ein Ende des Segments mit einer Mikrozange gehalten wurde. Halten Sie dann durch ein beleuchtetes Präpariermikroskop ein Ende des Arteriensegments und schieben Sie es vorsichtig über die linke Glaskanüle.

Befestigen Sie das Ende mit den Nylonnähten. Spülen Sie dann die Lumenflüssigkeit vorsichtig durch das montierte Gefäß, um Blut und Ablagerungen zu entfernen. Das Ventil zur linken Spritze sollte dann so geschlossen werden, dass diese Seite eine statische Flüssigkeitssäule darstellt, gegen die von der rechten Seite aus der Druck eingestellt wird, wobei mit dem Mikromanipulator die bewegliche rechte Glaskanüle näher an das Arteriensegment herangeführt und das rechte Ende des Segments darüber gezogen wird.

Sichern Sie abschließend das Arteriensegment mit Nylonfäden und schneiden Sie die überschüssigen Nahtfäden ab. Montieren Sie nun das Druckdiagrammgerät auf dem Tisch über dem Druckmikroskop. Verbinden Sie die Drucksäule mit der rechten Seite der Diagrammkammer und legen Sie dann die Abdeckung über die Kammer.

Heben Sie die 10-Milliliter-Spritze über einen Zeitraum von 15 Minuten allmählich an und prüfen Sie, ob das Gefäß undicht ist, bis der P-1-Druckmesskopf 80 Millimeter Quecksilbersäule anzeigt. Passen Sie den Abstand zwischen den Kanülen an. Bei Bedarf sollte der Abstand so eingestellt werden, dass das unter Druck stehende Arteriensegment ungefähr gerade ist und an der Stelle, an der die Bänder gemacht werden, ein schulterartiges Muster bildet. Die Lebensfähigkeit des montierten Gefäßes wird durch die transiente Superfusion mit 60 millimolar Kaliumchlorid für 30 Sekunden überprüft. Ein lebensfähiges Gefäß verengt sich durch die Zugabe von Kaliumchlorid schnell und erweitert sich sofort nach dem Auswaschen.

Geben Sie dann die konzentrierte Prüfsubstanz direkt in die Badlösung, pipettieren Sie sie vorsichtig am Ende der Kammer hin und her, um die Prüfsubstanz in der Badlösung zu mischen, wodurch die entsprechende Endkonzentration in der 10-Milliliter-Kammer erreicht wird. Volumenänderungen des Gefäßdurchmessers nach Zugabe der Prüfsubstanz können im Live-Videobild verfolgt und auch während des Versuchs im Bildanalysefenster grafisch dargestellt werden. Diese Abbildung zeigt eine Familie von sequentiellen Stromspuren, die als Reaktion auf Spannungsschritte vor der Behandlung aufgezeichnet wurden, wie in schwarz dargestellt, und nach der Stabilisierung in Gegenwart von 100 nanomolaren Zinkperion in einem einzelnen mesenterialen Arterienmyozyten, wie in rot dargestellt, hier sind die repräsentativen Ströme für die Kontrolle und für 100 nanomolare Zinkperion.

Die grauen Balken zeigen das Zeitintervall an, in dem die gemittelten Stromamplituden gemessen wurden. Bei Stromspannungsdiagrammen werden die Schrittspannungen auf der rechten Seite durch Pfeilspitzen angezeigt. Dies ist der zeitliche Verlauf der Stromerhöhung KV 7 um 100 nanomolare Zinkperion, gemessen mit einer Dauerspannungsklemme bei minus 20 Millivolt. Gezeigt. Hier sind die gemittelten Stromspannungskurven, die von den Stromdichten KV 7 abgeleitet wurden, die zuvor während der Behandlung mit 100 nanomolaren Zinkperionen und während der Behandlung mit 10 Mikromolaren des KV Siebenkanalblockers XC 9 9 1 Zinkionen-induzierte Entspannung der mit 100 picomolaren Arginin-Vasopressin vorverengten Mesenterialarterie aufgezeichnet wurden.

Diese Abbildung zeigt den zeitlichen Verlauf der Veränderungen des Außendurchmessers des Gefäßes als Reaktion auf die Anwendung von 100 picomolarem Arginin-Vasopressin, gefolgt von der Anwendung von 100 nanomolaren Zinkionen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Arterien für die Isolierung einzelner Zellen oder für die druckmyographische Messung von arteriellen Verengungen und Dilatatorreaktionen vorbereitet. Darüber hinaus sollten Sie wissen, wie Sie KV 7-Ströme isoliert von anderen Strömen in frisch isolierten arteriellen Myozyten aufzeichnen.