Exploring arteriellen glatten Muskelzellen KV7 Kalium Kanal Funktion mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck Myographie

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität von KV-sieben-Kaliumkanälen in frisch dissoziierten glatten Muskelzellen der Mesenterialarterie zu messen und diese mit Durchmesser-Messungen der Arterie unter physiologischen Bedingungen in Beziehung zu setzen. Dies wird erreicht, indem zunächst die mesenteriale Gefäßbogenstruktur von einer Ratte chirurgisch entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, Segmente der Mesenterialarterien zu isolieren und zu reinigen.

Anschließend werden einige Segmentabschnitte verwendet, um einzelne glatte Muskelzellen zur Durchführung von Patch-Clamp-elektrophysiologischen Messungen der KV-sieben-Kaliumströme zu isolieren. Der letzte Schritt besteht in der Kanülierung intakter arterieller Segmentabschnitte zur Druck-Myographie, um die arterielle Konstriktion oder Dilatation als Reaktion auf pharmakologische Modulatoren der KV-sieben-Kaliumkanäle zu messen. Letztendlich wird die Kombination aus Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck-Myographie genutzt, um aufzuzeigen, wie eine Zunahme oder Abnahme der Aktivität der KV-sieben-Kaliumkanäle die Konstriktion mesenterischer Arterien beeinflusst.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Verwendung von Klonkanälen, die in Zelllinien exprimiert werden, liegt darin, dass die Ströme aus nicht kultivierten Zellen aufgezeichnet werden, die die Kanäle nativ exprimieren, und dass die KV-Ströme von anderen Klassen von Kaliumkanälen, die möglicherweise in denselben Zellen aktiviert werden, isoliert werden können. Die Druck-Myographie ermöglicht es, funktionelle Antworten aus demselben Gewebe zu erfassen, aus dem die isolierten Zellen stammen, und die Methode ist sowohl empfindlicher als auch physiologischer als andere Präparationen wie arterielle Ringe oder arterielle Streifen. Dr. Bareth Mani, ein Postdoktorand aus meinem Labor, wird die arterielle Kanülierung und die Druck-Myographie-Techniken demonstrieren, und Dr. Luba Brueggeman, eine wissenschaftliche Assistentin in meinem Labor, wird die Zellisolation und die Patch-Plan-Verfahren demonstrieren.

Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie eine chirurgische Schere, um an beiden Enden des Dünndarms einer Ratte ein Segment von 10 bis 12 Zentimeter Länge abzuschneiden. Danach isolieren Sie den Darm zusammen mit der zugehörigen Gefäßversorgung. Befestigen Sie anschließend das Dünndarmsegment.

Verteilen Sie das Mesenterium über die nahe Seite der Kammer, sodass der Hauptast der Arteria mesenterica superior in der Mitte liegt und die nachfolgenden Verzweigungen sternförmig von diesem Zentrum ausgehen. Stecken Sie die Nadeln dann ausschließlich in die Darmabschnitte, wobei Sie mithilfe eines beleuchteten Stereomikroskops arbeiten. Entfernen Sie vorsichtig das Fettgewebe und das Bindegewebe in der Umgebung der Arterien zweiter bis vierter Ordnung nahe dem Darm mit feinen Pinzetten und einer Schere.

Halten Sie die benachbarten Venen fest, um die Entfernung des Fettgewebes und des Bindegewebes zu erleichtern und eine unnötige Dehnung der Arterien zu vermeiden. Überführen Sie nun zwei bis drei Segmente der Mesenterialarterie in eine 35-Millimeter-Zellkulturschale, die zwei Milliliter eiskalte Isolationslösung enthält. Stellen Sie die Schale danach auf Eis und schneiden Sie die Segmente der Mesenterialarterie mit einer Pipette mit angeschliffener Spitze in drei bis vier Millimeter lange Stücke.

Überführen Sie die arteriellen Segmente in ein Glasfläschchen, das zwei Milliliter vorgewärmte Isolationslösung bei 37 Grad Celsius enthält. Anschließend inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach 30 Minuten saugen Sie die Isolationslösung bei 37 Grad Celsius vorsichtig mit einer Hintertippipette ab.

Geben Sie zwei Milliliter warme Enzymlösung hinzu und inkubieren Sie 35 Minuten bei 37 Grad Celsius. Unmittelbar nach der 35-minütigen Inkubation in der Enzymlösung stellen Sie das Gefäß auf Eis, saugen die Enzymlösung ab und geben zwei Milliliter eiskalte Isolationslösung hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal.

Dann die arteriellen Abschnitte in einem Milliliter eiskalter Isolationslösung vorsichtig 10 bis 20 Mal mit der polierten Hintertippipette durchpipettieren, um einzelne glatte Muskelzellen der Mesenterialarterie freizusetzen. Überprüfen Sie regelmäßig das Erscheinungsbild der Myozyten, indem Sie einen Tropfen der Zellsuspension auf eine 35-Millimeter-Schale geben und sie unter dem Mikroskop betrachten.

Gesunde MA-SMCs sollten ein glattes, langgestrecktes Erscheinungsbild aufweisen. Übertragen Sie anschließend mithilfe einer polierten Pasteur-Pipette etwa 100 bis 200 Mikroliter Zellsuspension in die Messkammer und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang anhaften. Füllen Sie in diesem Schritt die Spitze der Patch-Pipette mit Amphotericin B, indem Sie die Pipettenspitze in die freie Innere Lösung eintauchen.

Anschließend an dem anderen Ende Unterdruck erzeugen, indem man eine 10-Milliliter-Spritze verwendet, die über ein Stück Schlauch verbunden ist, und gleichzeitig über die Spitze Pipettierungslösung in das Reservoir geben, bis die Pipette etwa zur Hälfte mit Lösung gefüllt ist. Dabei einen Eppendorf-Mikroladepipettenspitze verwenden. Eventuelle Luftblasen entfernen, indem man vorsichtig auf die Pipette klopft.

Danach setzen Sie die Pipette in den Elektrodenhalter ein. Senken Sie mithilfe eines Mikromanipulators die Pipette auf die Oberfläche eines langgestreckten Myozyten ab. Wenn der Widerstand der Pipette auf sechs bis zehn Megaohm ansteigt, erzeugen Sie ein Vakuum, um eine Giga-Dichtung zu erreichen.

Gleichzeitig die Haltespannung auf null Millivolt einstellen, während auf die Membranperforation gewartet wird. Anschließend 100 Millisekunden dauernde Spannungsschritte auf plus 10 Millivolt und danach auf minus 10 Millivolt anlegen. Den Verstärker verwenden, um den schnellen Pipettenkapazitätsüberschwingvorgang zu kompensieren, der gleichzeitig mit dem Auftreten der Gesamtzellkapazität auftritt.

Transiente kleine anhaltende positive Ströme im Bereich von zwei bis 10 Picoampere, die sowohl Reinheit als auch Amplitude aufweisen, weisen auf das Vorhandensein funktioneller KV7-Kanäle hin. Eine erfolgreiche Perforation mit Amphotericin B verringert den Zugangswiderstand auf 35 Megaohm oder weniger. Um die Strom-Spannungs-Beziehung der KV7-Kanäle aufzuzeichnen, wenden Sie fünfsekündige Spannungsschritte auf Spannungen an, die von minus 84 Millivolt – bei der die Öffnungswahrscheinlichkeit der KV7-Kanäle minimal ist – bis zu plus 16 Millivolt reichen, bei der die Öffnungswahrscheinlichkeit der KV7-Kanäle ein Plateau erreicht. Nach fünf Sekunden bei jeder Testspannung kehren Sie für 10 Sekunden zur Haltespannung von minus 4 Millivolt zurück.

Befestigen Sie in diesem Verfahren auf jeder Seite lose zwei vorgefertigte feine Nylonfäden. Überführen Sie das präparierte Mesenterialarteriensegment vorsichtig neben der Glaskanüle aus der Präparationskammer in die Druck-Myographenkammer, indem Sie ein Ende des Segments mit einer Mikrozange halten. Halten Sie danach ein Ende des Arteriensegments fest und schieben Sie es unter Sichtkontrolle durch ein beleuchtetes Präparationsmikroskop vorsichtig über die linke Glaskanüle.

Befestigen Sie das Ende mit den Nylon-Nähten. Spülen Sie dann vorsichtig die Luminausflüssigkeit durch das montierte Gefäß, um Blut und Ablagerungen zu entfernen. Anschließend sollte das Ventil zur linken Spritze geschlossen werden, sodass diese Seite eine statische Flüssigkeitssäule bildet, gegen die der Druck von der rechten Seite aus justiert wird. Positionieren Sie mit dem Mikromanipulator die bewegliche rechte Glas-Kanüle näher an das Arteriensegment heran und ziehen Sie das rechte Ende des Segments darüber.

Schließen Sie das Arteriensegment abschließend mit Nylon-Nähten und schneiden Sie die überschüssigen Fäden ab. Bringen Sie nun die Druckgraphikeinheit auf dem Objekttisch über dem Druckmikroskop an. Verbinden Sie die Druckspalte mit der rechten Seite der Graphikkammer und setzen Sie anschließend die Abdeckung auf die Kammer.

Erhöhen Sie die 10-Milliliter-Spritze allmählich über einen Zeitraum von 15 Minuten und prüfen Sie, ob Leckagen im Gefäß auftreten, bis der Druckmesswert des P1-Druckwandlers 80 Millimeter Quecksilber beträgt. Stellen Sie den Abstand zwischen der Kanüle gegebenenfalls so ein, dass das unter Druck stehende Arteriensegment annähernd gerade verläuft und dort, wo die Ligaturen angelegt sind, ein schulterartiges Muster bildet. Überprüfen Sie die Vitalität des präparierten Gefäßes durch vorübergehende Überleitungsperfusion mit 60 Millimolar Kaliumchlorid für 30 Sekunden. Ein vitales Gefäß zieht sich rasch nach Zugabe von Kaliumchlorid zusammen und weitet sich unmittelbar nach dessen Ausspülung wieder.

Fügen Sie als Nächstes die konzentrierte Testsubstanz direkt in die Badeinlösung hinzu, indem Sie sie vorsichtig mit der Pipette am Ende der Kammer mehrfach auf- und abpipettieren, um die Testsubstanz in der Badeinlösung zu vermischen und so die entsprechende Endkonzentration in der 10-Milliliter-Kammer zu erreichen. Volumenänderungen im Gefäßdurchmesser nach Zugabe der Testsubstanz können im Live-Videobild verfolgt und während des Experiments auch im Fenster der Bildanalyse dargestellt werden. Diese Abbildung zeigt eine Reihe von sequenziellen Stromspuren, die vor der Behandlung (schwarz dargestellt) und nach der Stabilisierung in Gegenwart von 100 Nanomolar Zinkperion in einer einzelnen Mesenterikarterie-Myozyte (rot dargestellt) als Reaktion auf Spannungsschritte aufgezeichnet wurden. Hier sind die repräsentativen Ströme für die Kontrolle und für 100 Nanomolar Zinkperion dargestellt.

Die grauen Balken zeigen das Zeitintervall an, in dem die gemittelten Stromamplituden gemessen wurden. Bei Strom-Spannungs-Diagrammen sind die Schrittspannungen rechts durch Pfeilspitzen gekennzeichnet. Dargestellt ist der zeitliche Verlauf der KV-sieben-Stromverstärkung durch 100 Nanomolar Zinkionen, gemessen mittels kontinuierlichem Spannungs-Clamp bei minus 20 Millivolt. Hier sind die gemittelten Strom-Spannungs-Kurven dargestellt, die aus den KV-sieben-Stromdichten abgeleitet wurden, aufgezeichnet vor und während der Behandlung mit 100 Nanomolar Zinkionen sowie während der Behandlung mit 10 Mikromolar des KV-sieben-Kanalblockers XC 991. Zinkioneninduzierte Relaxation der mesenterialen Arterie, vorher mit 100 Pikomolar Arginin-Vasopressin präkonstriktiert.

Diese Abbildung zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderungen des Außendurchmessers des Gefäßes als Reaktion auf die Applikation von 100 Pikomolar Arginin-Vasopressin, gefolgt von der Applikation von 100 Nanomolar Zinkionen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Arterien zur Isolierung einzelner Zellen oder zur druckmyographischen Messung arterieller Konstriktion und Dilatationsreaktionen vorbereitet. Außerdem sollten Sie wissen, wie man KV-sieben-Ströme isoliert von anderen Strömen in frisch isolierten arteriellen Myozyten aufzeichnet.