Name: Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung chromatinassoziierter Proteine aus Mäuseherzgewebe mittels quantitativer massenspektrometrischer Analyse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung nukleärer Proteomdynamiken bei Herzerkrankungen.

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Die Vondriska Labor ist durch Zuschüsse aus dem National Heart, Lung and Blood Institute der NIH und der Laubisch Endowment an der UCLA unterstützt. EM ist Empfänger der Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship für Physiologie an der UCLA; HC ist der Empfänger einer American Heart Association Pre-Doc-Stipendium; MP ist der Empfänger einer NIH Ruth Kirschstein Post-Doktoranden-Stipendium und SF ist der Empfänger von ein NIH K99 Award.

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<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Zwei Hauptverfahren für nukleare Isolierung wurden zuvor bewertet: 27 eine ist die Technik der Behrens Homogenisieren lyophilisierten Gewebe in einem nicht-wässrigen Lösungsmittel und das zweite, eine Modifikation der wir hier von Homogenisier Gewebe in einer wäßrigen Saccharose / Salzlösung gefolgt durch differentielle oder Dichtegradientenzentrifugation. Subfraktionierung der Kerne durch saure Extraktion von Gewebeproben ist ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung Chromatin,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Dulbeco Modified Eagle Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Protease Pellet </td><td> Roche </td><td> 04 693 159 001 </td></tr><tr><td> 100 um Sieb </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Ultracut Ultramikrotom </td><td> Reichert </td><td></td></tr><tr><td> 100CX Transmission Electron Mikroskop </td><td> JEOL USA, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Pirol </td><td> BioRad </td><td> 161-0496 </td></tr><tr><td> Histon H2A-Antikörper </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8648 </td></tr><tr><td> Nucleoporin p62 Antikörper </td><td> BD Biosciences </td><td> 610498 </td></tr><tr><td> Adenin nucleoFlut transporter Antikörper </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-9299 </td></tr><tr><td> BiP-Antikörper </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-1050 </td></tr><tr><td> Tubulin-Antikörper </td><td> Sigma </td><td> T1568 </td></tr><tr><td> Histone H3 Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td></tr><tr><td> Fibrillarin Antikörper </td><td> Cell Signaling </td><td> C12C3 </td></tr><tr><td> SNRP70 Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab51266 </td></tr><tr><td> E2F-1-Antikörpers </td><td> Thermo Fisher </td><td> MS-879 </td></tr><tr><td> Retinoblastoma Antikörper </td><td> BD Biosciences </td><td> 554136 </td></tr><tr><td> Hypoxie-induzierbaren Faktor 1-Antikörpers </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB100-469 </td></tr><tr><td> BCA-Protein-Assay </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23227 </td></tr><tr><td> Umkehrphasensäule </td><td> New Objektive </td><td> PFC7515-B14-10 </td></tr><tr><td> BioWorks Browser </td><td> Thermo Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analyse von chromatin proteome in disease

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Im Zellkern befinden die Proteome, deren Funktionen auf das engste mit der Genregulation verknüpft. Adulten Kardiomyozyten Kerne sind einzigartig wegen des hohen Anteils an zweikerniger Zellen, 1 die überwiegend heterochromatischen Zustand der DNA, und das nicht-teilenden Art der Herzmuskelzellen, die Erwachsenen Kerne macht in einem permanenten Zustand der Interphase. 2 Transkriptionelle Regulation während der Entwicklung und Krankheiten wurden auch in diesem Organ, 3-5 studiert, aber was bleibt relativ unerforscht ist die Rolle der nuklearen Proteine, die für DNA-Verpackung und Ausdruck gespielt, und wie diese Proteine ​​Veränderungen in der transkriptionellen Programme, die während Krankheit auftreten steuern. 6 In den Industrieländern Welt, Herzkrankheiten die häufigste Ursache der Sterblichkeit für Männer und Frauen. 7 Insight, wie nukleare Proteine ​​zusammen, um das Fortschreiten dieser Krankheit zu regeln ist entscheidend für die Förderung der aktuellen Behandlung optionen. Die Massenspektrometrie ist das ideale Werkzeug für die Bewältigung dieser Fragen, wie es für eine unvoreingenommene Annotation des nuklearen Proteom und relative Quantifizierung ermöglicht, wie die Fülle dieser Proteine ​​verändert sich mit Krankheit. Zwar gibt es mehrere proteomischen Studien für Säugetier nuklearen Proteinkomplexe, 8-13 bis vor kurzem gab es 14 nur eine Studie, die die kardiale nuklearen Proteom, und es als das gesamte Kern, anstatt Erkundung des Proteoms auf der Ebene der Fächer Nuklearteilbild . 15 In einem großen Teil ist dies Mangel an Arbeit wegen der Schwierigkeit der Isolierung Herz Kerne. Cardiac Kerne treten innerhalb einer starren und dichten Aktin-Myosin Vorrichtung, an die sie über mehrere Erweiterungen aus dem endoplasmatischen Retikulum verbunden sind, in dem Umfang, Myozyten Kontraktion verändert ihre Gesamtform. 16 Zusätzlich Kardiomyozyten 40% Mitochondrien Vol. 17, die necessitätes Anreicherung des Kernes von den anderen Organellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für kardiale Urananreicherung und weitere Fraktionierung in biologisch relevanten Fächern. Darüber hinaus haben wir detailliert Verfahren zur markierungsfreien quantitativen massenspektrometrischen Dissektion dieser Fraktionen-Techniken zugänglich in vivo Experimente in verschiedenen Tiermodellen und Organsysteme, wo metabolische Markierung nicht durchführbar ist.

Abbildung 4 verdeutlicht den Nutzen dieser Form der relativen Quantifizierung. Gezeigt im linken Fenster sind die einzelnen monoisotopic Peptidpeaks (überlagert von verschiedenen Mäusen), die als Angehörige der Protein HMGB1 (identifiziert über Datenbanksuche) bezeichnet wurden. Jeder Peak, im Wesentlichen eine extrahierte Ionenchromatographen für die gegebene Peptid, kommt aus einer anderen Maus. Die Gruppen repräsentieren drei verschiedene physiologische Zustände: basal, Herzhypertrophie und Herzinsuf...

Advances in Massenspektrometrie haben die Hochdurchsatz-Analyse der Proteinexpression und Modifikation in einer Vielzahl von Geweben erlaubt. Kombiniert mit subzelluläre Fraktionierung und Krankheitsmodelle, quantitative Massenspektrometrie und der Bioinformatik neue Eigenschaften in biologischen Systemen offenbaren kann. Das hierin beschriebene Verfahren analysiert Chromatin-assoziierten Proteinen in der Einstellung von Herzerkrankungen und ist ohne weiteres auch auf andere<em&gt; In vivo</em&gt; Modelle menschlicher Erkrankungen.

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

Im Zellkern befinden sich die Proteome, deren Funktionen am engsten mit der Genregulation verknüpft sind. Zellkerne von adulten mammalianen Kardiomyozyten sind einzigartig aufgrund ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, an Chromatin gebundene Proteine aus der Maus herz zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Herz homogenisiert und anschließend die Herzkernpartikel über eine Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden. Danach wird das nukleäre Plasm von der Chromatin-Fraktion getrennt.Anschließend werden Proteine aus dem Chromatin-Pellet extrahiert, um Proteine anzureichern, die locker an die DNA gebunden sind. Schließlich werden Proteine aus einem anderen Chromatin-Pellet extrahiert, um Proteine anzureichern, die fest an die DNA gebunden sind. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Merkmale des nukleären Proteoms unter verschiedenen physiologischen Bedingungen durch eine quantitative, markierungsfreie massenspektrometrische Analyse zeigen.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im kardiologischen Forschungsbereich beantworten, beispielsweise wie die Chromatin-Umgestaltung zur kardialen Hypertrophie und Insuffizienz beiträgt. Nach der Tötung einer erwachsenen Maus und Entfernung des Herzens spülen Sie dieses in eiskaltem PBS. Anschließend geben Sie es in ein Glasgefäß mit zwei Milliliter Puffer zur Zelllyse, der eine Mischung aus Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthält, und homogenisieren es.Geben Sie die Lysate durch ein 100-Mikron-Sieb und sammeln Sie das Filtrat in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Von diesem Punkt an, sofern nicht anders angegeben, halten Sie die Probe auf Eis. Zentrifugieren Sie die Probe bei 4.000 U/min fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie das Überstand enthaltende Zytosol und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius.Resuspendieren Sie das Pellet in 200 µL Puffer zur Zelllyse. Geben Sie 1 mL Saccharose-Puffer in ein neues Gefäß und schichten Sie das resuspendierte Pellet vorsichtig mit einer Transferpipette auf das Saccharose-Kissen auf. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 5.000 U/min und 4 °C. Entfernen Sie den oberflächlichen Film sowie das Saccharose-Kissen, das die Membran enthält.Waschen Sie das verbleibende Pellet, das die Kerne enthält, mit 200 Mikrolitern eiskaltem P-B-S-E-D-T-A-Puffer, lösen Sie das kernhaltige Pellet in 200 Mikrolitern Puffer zur Detergenzextraktion auf und wirbeln Sie die Probe zwei Mal je 10 Sekunden lang. Stellen Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis und zentrifugieren Sie sie anschließend bei 13.000 U/min fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand, der nukleoplasmatische Proteine enthält, und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius.Waschen Sie die Pellets mit eiskaltem PBS-EDTA und resuspendieren Sie sie in 300 Mikrolitern Tris-SDS-EDTA-Puffer. Sonizieren Sie die Probe drei bis sechs Mal für jeweils 10 Sekunden. Um die DNA aufzubrechen, zentrifugieren Sie die Probe zwischen den Sonizierungen bei 13.000 U/min für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, wobei die Probe auf Eis gehalten wird.Behalten Sie das Überstand, das das isolierte Protein enthält, und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius, um Proteine wie Histone anzureichern, die eng an DNA gebunden sind. Führen Sie eine separate Fraktionierung durch, um Chromosomen zu isolieren, ausgehend von einem isolierten erwachsenen Herzen oder Kardiomyozyten aus Ratten PARPs. Pipettieren Sie das Chromatin-Pellet in 400 Mikroliter 0,4 N Schwefelsäure und wirbeln Sie es. Um Klumpen zu entfernen, rotieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius für 30 Minuten oder über Nacht. Nach der Inkubation entfernen Sie die nukleären Rückstände durch Zentrifugation bei 16.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Überführen Sie das Überstand in ein frisches Gefäß und geben Sie 132 Mikroliter Trichloressigsäure tropfenweise zur Probe hinzu. Drehen Sie das Gefäß mehrmals um und inkubieren Sie es 30 Minuten auf Eis. Nach dem Zentrifugieren verwerfen Sie den Überstand und spülen das histonhaltige Pellet vorsichtig mit eiskaltem Aceton, anschließend zentrifugieren. Wiederholen Sie erneut die Behandlung mit Aceton, waschen Sie das Pellet und trocknen Sie es an der Luft, bevor Sie es in 100 Mikrolitern Triss-S-D-S-E-D-T-A-Puffer resuspendieren. Verwenden Sie einmolar Triss, um den pH-Wert auf acht einzustellen.Sonizieren Sie die Probe 15 Minuten lang in einem Wasserbad. Lagern Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius. Führen Sie Analysen mittels Massenspektrometrie durch, um die Reinheit zu bestimmen und die hier dargestellten Proteine zu identifizieren.Die überlagerten extrahierten Ionen-Chromatogramme für ein einzelnes Peptid, das dem HMGB1-Protein zugeordnet wurde. Jedes Chromatogramm stammt aus einer anderen Chromatinprobe und ist farblich codiert, um den physiologischen Zustand der Maus darzustellen, von der die Probe gewonnen wurde. Für jede der physiologischen Bedingungen – basal, kardiale Hypertrophie und Herzinsuffizienz – wurden drei biologische Wiederholungen analysiert, wobei jede Probe zweimal untersucht wurde, was insgesamt 18 Chromatogramme ergibt.Durch die Integration der Fläche unter der Kurve kann die relative Häufigkeit für jede Wiederholung bestimmt werden. In diesem Panel wurden die sechs Wiederholungen für jede der drei physiologischen Bedingungen gemittelt, um Gesamthäufigkeitswerte zu erhalten. Aus dieser Analyse geht deutlich hervor, dass die Häufigkeit von HGB one im Verlauf der Erkrankung, wie hier dargestellt, variiert.Das Fragmentierungsspektrum für dieses Peptid bestätigt seine Aminosäuresequenz und ermöglicht die Zuordnung zum HMGB1-Protein. Im Gegensatz dazu zeigt die Quantifizierung eines anderen Peptids aus dem Protein Histon H4, dass seine Häufigkeit sich mit der Erkrankung nicht verändert. Wir können die Reproduzierbarkeit der Veränderungen in der Peptidhäufigkeit, die wir zwischen den verschiedenen physiologischen Zuständen beobachten, mithilfe statistischer Analysen untersuchen.Zunächst wird die Häufigkeit aller in jedem Replikat identifizierten Peptide einer ANOVA unterzogen, gefolgt von einer Hauptkomponentenanalyse (PCA). Die Gruppierung sowohl technischer als auch biologischer Replikate in dieser Darstellung bestätigt, dass die durch Massenspektrometrie erfassten Änderungen der Häufigkeit zwischen den verschiedenen Krankheitszuständen konsistent und reproduzierbar sind. Basal in blau, Hypertrophie in rot, Versagen in grün. Ebenso wichtig wie die Quantifizierung und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ist die durch nukleäre Subfraktionierung ermöglichte verbesserte Abdeckung des nukleären Proteoms.Diese Abbildung zeigt, dass die alleinige Analyse des gesamten Zellkerns nicht einmal die Mehrheit der Kernproteine aufdeckt, die identifiziert werden können, wenn die einzelnen Kompartimente separat analysiert werden. Außerdem verdeutlicht die moderate Überschneidung zwischen den verschiedenen Fraktionen die biologische Relevanz, diese Kompartimente einzeln zu betrachten, um tiefere Einblicke in die Kernfunktion und Genregulation zu gewinnen. Schließlich ermöglicht die gezielte Fraktionierung von säureextrahierten oder detergentenextrahierten Chromosomen die Anreicherung wichtiger chromatinstrukturierender Proteine wie Histone und erlaubt dadurch eine fokussiertere massenspektrometrische Analyse einer Protein-Gruppe, ohne dass spezifische Antikörper für jede Variante und Isoform benötigt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass Proben, die am Massenspektrometer analysiert werden sollen, frei von Keratin-Kontamination gehalten werden müssen.Dies ist besonders wichtig in den nachfolgenden Schritten nach der Proteinisolierung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Hier präsentieren wir eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Verfahren zur genomweiten Ort Analyse von Protein-Isoformen, die in einer Histon-bindende Domäne unterscheiden. Wir wenden es ChIP-Seq-Analyse, um die Ziele des KDM5A/JARID1A/RBP2 Histon-Demethylase zu identifizieren.

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Hier beschreiben wir eine Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung Protokoll zum globalen epigenomischen Profile aus Low-Fülle Huhn embryonalen Proben zu generieren.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Hier beschreiben wir eine optimierte Hochdurchsatz-ChIP-Sequenzierung Protokoll und rechnerische Analysen Pipeline für die Bestimmung der genomweiten Chromatin Zustand Muster von gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien.

Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe

Dies ist eine Methode, um neuartige DNA-Interaktion Proteine an zielgruppenspezifischen Loci, unter Berufung auf Sequenz-spezifische Erfassung von querverbunden Chromatin für nachfolgende Proteomic Analysen zu identifizieren. Keine Vorkenntnisse über potenzielle Bindeproteine noch Zelle Änderungen sind erforderlich. Ursprünglich entwickelt für die Hefe, wurde die Technologie jetzt für Säugerzellen angepasst.

Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung funktioneller Implikationen nicht-kodierender Varianten, die durch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) anhand dreidimensionaler Chromatin-Wechselwirkungen identifiziert wurden.

Mapping Alzheimer-Krankheit Varianten zu ihren Zielgenen mit Hilfe der Berechnung der Chromatin-Konfiguration

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Chromatinpräparation aus tiefgefrorenem Gewebe und eignet sich für die Vernetzung der Chromatin-Immunpräzipitation (X-ChIP), gefolgt von einer quantitativen PCR-Analyse (X-ChIP-qPCR) oder einem Next-Generation-Sequencing-Ansatz (X-ChIP-seq).

Chromatinextraktion aus gefrorenem chimärem Lebergewebe für die Chromatin-Immunpräzipitationsanalyse

Mit quantitative PCR, zeigen wir, wie die etablierten chick CAM-Modell verwendet werden, um quantitativ zu analysieren die Metastasierung von humanen Tumorzellen zu entfernten Organen sein.

Quantitative Analyse von Krebs Metastasen mit einem Vogelembryo Modell

Erfahren Sie die Isolierung chromatinassoziierter Proteine aus Mäuseherzgewebe mittels quantitativer massenspektrometrischer Analyse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung nukleärer Proteomdynamiken bei Herzerkrankungen.

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

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