Name: Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung chromatinassoziierter Proteine aus Mäuseherzgewebe mittels quantitativer massenspektrometrischer Analyse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung nukleärer Proteomdynamiken bei Herzerkrankungen.

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Die Vondriska Labor ist durch Zuschüsse aus dem National Heart, Lung and Blood Institute der NIH und der Laubisch Endowment an der UCLA unterstützt. EM ist Empfänger der Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship für Physiologie an der UCLA; HC ist der Empfänger einer American Heart Association Pre-Doc-Stipendium; MP ist der Empfänger einer NIH Ruth Kirschstein Post-Doktoranden-Stipendium und SF ist der Empfänger von ein NIH K99 Award.

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<li>Paulsson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+calsarcin-1+during+pressure+overload-induced+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+chromatin+proteome+in+disease+reveals+remodeling+principles+and+identifies+high+mobility+group+protein+b2+as+a+regulator+of+hypertrophic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth.</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
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<li>Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-wide+proteomic+characterization+of+combinatorial+post-translational+modification+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns.</a> Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).</li>
<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Zwei Hauptverfahren für nukleare Isolierung wurden zuvor bewertet: 27 eine ist die Technik der Behrens Homogenisieren lyophilisierten Gewebe in einem nicht-wässrigen Lösungsmittel und das zweite, eine Modifikation der wir hier von Homogenisier Gewebe in einer wäßrigen Saccharose / Salzlösung gefolgt durch differentielle oder Dichtegradientenzentrifugation. Subfraktionierung der Kerne durch saure Extraktion von Gewebeproben ist ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung Chromatin,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Dulbeco Modified Eagle Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Protease Pellet </td><td> Roche </td><td> 04 693 159 001 </td></tr><tr><td> 100 um Sieb </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Ultracut Ultramikrotom </td><td> Reichert </td><td></td></tr><tr><td> 100CX Transmission Electron Mikroskop </td><td> JEOL USA, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Pirol </td><td> BioRad </td><td> 161-0496 </td></tr><tr><td> Histon H2A-Antikörper </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8648 </td></tr><tr><td> Nucleoporin p62 Antikörper </td><td> BD Biosciences </td><td> 610498 </td></tr><tr><td> Adenin nucleoFlut transporter Antikörper </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-9299 </td></tr><tr><td> BiP-Antikörper </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-1050 </td></tr><tr><td> Tubulin-Antikörper </td><td> Sigma </td><td> T1568 </td></tr><tr><td> Histone H3 Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td></tr><tr><td> Fibrillarin Antikörper </td><td> Cell Signaling </td><td> C12C3 </td></tr><tr><td> SNRP70 Antikörper </td><td> Abcam </td><td> ab51266 </td></tr><tr><td> E2F-1-Antikörpers </td><td> Thermo Fisher </td><td> MS-879 </td></tr><tr><td> Retinoblastoma Antikörper </td><td> BD Biosciences </td><td> 554136 </td></tr><tr><td> Hypoxie-induzierbaren Faktor 1-Antikörpers </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB100-469 </td></tr><tr><td> BCA-Protein-Assay </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23227 </td></tr><tr><td> Umkehrphasensäule </td><td> New Objektive </td><td> PFC7515-B14-10 </td></tr><tr><td> BioWorks Browser </td><td> Thermo Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analyse von chromatin proteome in disease

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Im Zellkern befinden die Proteome, deren Funktionen auf das engste mit der Genregulation verknüpft. Adulten Kardiomyozyten Kerne sind einzigartig wegen des hohen Anteils an zweikerniger Zellen, 1 die überwiegend heterochromatischen Zustand der DNA, und das nicht-teilenden Art der Herzmuskelzellen, die Erwachsenen Kerne macht in einem permanenten Zustand der Interphase. 2 Transkriptionelle Regulation während der Entwicklung und Krankheiten wurden auch in diesem Organ, 3-5 studiert, aber was bleibt relativ unerforscht ist die Rolle der nuklearen Proteine, die für DNA-Verpackung und Ausdruck gespielt, und wie diese Proteine ​​Veränderungen in der transkriptionellen Programme, die während Krankheit auftreten steuern. 6 In den Industrieländern Welt, Herzkrankheiten die häufigste Ursache der Sterblichkeit für Männer und Frauen. 7 Insight, wie nukleare Proteine ​​zusammen, um das Fortschreiten dieser Krankheit zu regeln ist entscheidend für die Förderung der aktuellen Behandlung optionen. Die Massenspektrometrie ist das ideale Werkzeug für die Bewältigung dieser Fragen, wie es für eine unvoreingenommene Annotation des nuklearen Proteom und relative Quantifizierung ermöglicht, wie die Fülle dieser Proteine ​​verändert sich mit Krankheit. Zwar gibt es mehrere proteomischen Studien für Säugetier nuklearen Proteinkomplexe, 8-13 bis vor kurzem gab es 14 nur eine Studie, die die kardiale nuklearen Proteom, und es als das gesamte Kern, anstatt Erkundung des Proteoms auf der Ebene der Fächer Nuklearteilbild . 15 In einem großen Teil ist dies Mangel an Arbeit wegen der Schwierigkeit der Isolierung Herz Kerne. Cardiac Kerne treten innerhalb einer starren und dichten Aktin-Myosin Vorrichtung, an die sie über mehrere Erweiterungen aus dem endoplasmatischen Retikulum verbunden sind, in dem Umfang, Myozyten Kontraktion verändert ihre Gesamtform. 16 Zusätzlich Kardiomyozyten 40% Mitochondrien Vol. 17, die necessitätes Anreicherung des Kernes von den anderen Organellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für kardiale Urananreicherung und weitere Fraktionierung in biologisch relevanten Fächern. Darüber hinaus haben wir detailliert Verfahren zur markierungsfreien quantitativen massenspektrometrischen Dissektion dieser Fraktionen-Techniken zugänglich in vivo Experimente in verschiedenen Tiermodellen und Organsysteme, wo metabolische Markierung nicht durchführbar ist.

Abbildung 4 verdeutlicht den Nutzen dieser Form der relativen Quantifizierung. Gezeigt im linken Fenster sind die einzelnen monoisotopic Peptidpeaks (überlagert von verschiedenen Mäusen), die als Angehörige der Protein HMGB1 (identifiziert über Datenbanksuche) bezeichnet wurden. Jeder Peak, im Wesentlichen eine extrahierte Ionenchromatographen für die gegebene Peptid, kommt aus einer anderen Maus. Die Gruppen repräsentieren drei verschiedene physiologische Zustände: basal, Herzhypertrophie und Herzinsuf...

Advances in Massenspektrometrie haben die Hochdurchsatz-Analyse der Proteinexpression und Modifikation in einer Vielzahl von Geweben erlaubt. Kombiniert mit subzelluläre Fraktionierung und Krankheitsmodelle, quantitative Massenspektrometrie und der Bioinformatik neue Eigenschaften in biologischen Systemen offenbaren kann. Das hierin beschriebene Verfahren analysiert Chromatin-assoziierten Proteinen in der Einstellung von Herzerkrankungen und ist ohne weiteres auch auf andere<em&gt; In vivo</em&gt; Modelle menschlicher Erkrankungen.

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

Im Zellkern befinden sich die Proteome, deren Funktionen am engsten mit der Genregulation verknüpft sind. Zellkerne von adulten mammalianen Kardiomyozyten sind einzigartig aufgrund ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, an Chromatin gebundene Proteine aus der Maus herz zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Herz homogenisiert und anschließend die Herzkernpartikel über eine Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden. Danach wird das nukleäre Plasm von der Chromatin-Fraktion getrennt.Anschließend werden Proteine aus dem Chromatin-Pellet extrahiert, um Proteine anzureichern, die locker an die DNA gebunden sind. Schließlich werden Proteine aus einem anderen Chromatin-Pellet extrahiert, um Proteine anzureichern, die fest an die DNA gebunden sind. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Merkmale des nukleären Proteoms unter verschiedenen physiologischen Bedingungen durch eine quantitative, markierungsfreie massenspektrometrische Analyse zeigen.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im kardiologischen Forschungsbereich beantworten, beispielsweise wie die Chromatin-Umgestaltung zur kardialen Hypertrophie und Insuffizienz beiträgt. Nach der Tötung einer erwachsenen Maus und Entfernung des Herzens spülen Sie dieses in eiskaltem PBS. Anschließend geben Sie es in ein Glasgefäß mit zwei Milliliter Puffer

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

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Hier präsentieren wir eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Verfahren zur genomweiten Ort Analyse von Protein-Isoformen, die in einer Histon-bindende Domäne unterscheiden. Wir wenden es ChIP-Seq-Analyse, um die Ziele des KDM5A/JARID1A/RBP2 Histon-Demethylase zu identifizieren.

Genomweite Analyse mittels ChIP zu Isoform-spezifische Gene-Targets zu identifizieren

Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Hier beschreiben wir eine Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung Protokoll zum globalen epigenomischen Profile aus Low-Fülle Huhn embryonalen Proben zu generieren.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Hier beschreiben wir eine optimierte Hochdurchsatz-ChIP-Sequenzierung Protokoll und rechnerische Analysen Pipeline für die Bestimmung der genomweiten Chromatin Zustand Muster von gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien.

Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe

Dies ist eine Methode, um neuartige DNA-Interaktion Proteine an zielgruppenspezifischen Loci, unter Berufung auf Sequenz-spezifische Erfassung von querverbunden Chromatin für nachfolgende Proteomic Analysen zu identifizieren. Keine Vorkenntnisse über potenzielle Bindeproteine noch Zelle Änderungen sind erforderlich. Ursprünglich entwickelt für die Hefe, wurde die Technologie jetzt für Säugerzellen angepasst.

Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung funktioneller Implikationen nicht-kodierender Varianten, die durch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) anhand dreidimensionaler Chromatin-Wechselwirkungen identifiziert wurden.

Mapping Alzheimer-Krankheit Varianten zu ihren Zielgenen mit Hilfe der Berechnung der Chromatin-Konfiguration

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Chromatinpräparation aus tiefgefrorenem Gewebe und eignet sich für die Vernetzung der Chromatin-Immunpräzipitation (X-ChIP), gefolgt von einer quantitativen PCR-Analyse (X-ChIP-qPCR) oder einem Next-Generation-Sequencing-Ansatz (X-ChIP-seq).

Chromatinextraktion aus gefrorenem chimärem Lebergewebe für die Chromatin-Immunpräzipitationsanalyse

Mit quantitative PCR, zeigen wir, wie die etablierten chick CAM-Modell verwendet werden, um quantitativ zu analysieren die Metastasierung von humanen Tumorzellen zu entfernten Organen sein.

Quantitative Analyse von Krebs Metastasen mit einem Vogelembryo Modell

Erfahren Sie die Isolierung chromatinassoziierter Proteine aus Mäuseherzgewebe mittels quantitativer massenspektrometrischer Analyse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung nukleärer Proteomdynamiken bei Herzerkrankungen.

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

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