Aufzucht und Injektion von

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die bakterielle Pathogenität gegenüber Insektenlarven unter Verwendung von Manduka seca als Modellorganismus zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Insektenlarven aus sterilisierten Eiern bis zur vierten Entwicklungsstufe (Instar) aufgezogen werden. Im zweiten Schritt werden die bakteriellen Proben für die Injektion vorbereitet.

Anschließend werden die Bakterien in die Larven des vierten Instars von Manduka seca injiziert. Im letzten Schritt wird der Tod der Insekten im Zeitverlauf nach der Injektion überwacht. Letztendlich wird die Zeit bis zum Tod der Insekten erfasst und zur Beurteilung der bakteriellen Virulenz herangezogen.

Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Aspekte im Bereich der Symbiose zu klären, einschließlich der Entdeckung neuartiger Insektenpathogene und der Bestimmung von Unterschieden in der Virulenz zwischen bakteriellen Arten oder Stämmen. Beginnen Sie damit, zunächst 15 Gramm Auger in 900 bis 1000 Milliliter Wasser im Autoklaven zu sterilisieren. Unmittelbar nach der Autoklavierung.

Mischen Sie die Maden mit 166 Gramm Weizenkeimdiät. Geben Sie die gemischte Insektennahrung in einem Labor-Mixer in eine Schale. Nach dem Abkühlen überführen Sie die Nahrung von der Schale auf ein Stück Aluminiumfolie.

Eng umwickeln und bei vier Grad Celsius lagern. Nach dem Eintreffen die männlichen Fliegen auf die Eier in einer Glasfilterhalterung und einer Vakuumfilteranordnung mit einem 90-Millimeter-Filterpapier geben. Anschließend 250 Milliliter einer 0,6%igen Bleichlösung für zwei bis drei Minuten unter gelegentlichem Rühren über die Eier gießen.

Schalten Sie nun das Vakuum ein, um die Bleichlösung abzusaugen, und waschen Sie die sterilisierten Eier anschließend drei bis viermal mit jeweils 250 Milliliter sterilem destilliertem Wasser. Danach legen Sie ein frisches 90 Millimeter großes Stück Filterpapier in den Deckel einer Petrischale und überführen die Eier auf das Filterpapier, damit sie im Flussgehäuse trocknen können, bis sie nicht mehr zusammenkleben. Nun geben Sie die kürzlich hergestellte Insektennahrung auf einen festen Gummistopfen in mehrere Kunststoffbehälter und übertragen jeweils etwa 40 Eier in jeden Behälter, wobei Sie die Eier von der Nahrung trennen, um eine durch Feuchtigkeit verursachte Pilzkontamination zu verhindern.

Halten Sie die Eier bei 26 Grad Celsius mit einem Licht-Dunkel-Zyklus von 16 Stunden Licht und acht Stunden Dunkelheit. Die Eier werden vor dem Schlüpfen eine gelbweiße Farbe annehmen, wenn der Schlupf abgeschlossen ist. Heben Sie mithilfe einer Pinzette jedes der Larven am langen schwarzen Horn an und überführen Sie vorsichtig jeweils etwa 25 Larven in neue Behälter mit Nahrung am Boden.

Inkubieren Sie die Larven zwei Tage lang unter denselben Bedingungen wie die Eier. Obwohl der Tod von Larven in diesem Stadium ungewöhnlich ist, können einige tote oder mit größerer Wahrscheinlichkeit entwicklungsverzögerte Larven beobachtet werden. Überführen Sie nun die Larven in einzelne Behälter mit kleinen Nahrungspartikeln, um Kannibalismus zu vermeiden, und inkubieren Sie sie erneut. Ersetzen Sie die Nahrung und entfernen Sie die Fäkalien aus den Behältern alle zwei Tage, bis die Insekten die dritte Larvalhäutung durchlaufen haben.

Die dritte Larvalhäutung ist das vierte Larvenstadium, das durch das Auftreten schwarzer, hakenartiger Crochets an jedem Prole und durch eine stärkere Ausprägung der Streifen entlang des Insektenkörpers gekennzeichnet ist. Nachdem die gewünschten zu testenden Bakterienstämme angezüchtet wurden, zentrifugieren Sie jeweils 500 Mikroliter der Bakterienstämme zwei Minuten lang in einer Mikrozentrifuge bei 17.000 × g bei Raumtemperatur. Anschließend waschen Sie die Pellets unter denselben Bedingungen mit einem Milliliter steriler PBS.

Nach dem Resuspendieren der Zellen in einem weiteren halben Milliliter steriler PBS die optische Dichte der Suspensionen messen, wobei für jede Verdünnung eine neue Pipettenspitze verwendet wird. In einer 96-Well-Mikrotiterplatte sechs serielle zehnfache Verdünnungen des ersten Bakterienstamms in steriler PBS herstellen. Anschließend jeweils 10 Mikroliter der Verdünnungen von 10 hoch minus zwei bis 10 hoch minus sechs auf die Oberfläche einer Petrischale, die das geeignete Nährmedium enthält, auftragen. Danach die Schale kippen, damit sich die Auftragepunkte zur Mitte hin ausbreiten.

Danach, nachdem Sie die Insektennahrung und die Fäzes entfernt haben, stellen Sie die Insektenbehälter etwa fünf Minuten lang auf Eis, während die Insekten abkühlen. Spülen Sie eine Spritzenkanüle dreimal in zwei Reagenzgläsern mit 70 bis 100 % Ethanol und anschließend in einem Reagenzglas mit steriler Wasser durch. Verwenden Sie dann ein Hämocytometer, um die verdünnten Zellsuspensionen unter dem Mikroskop zu quantifizieren.

Entnehmen Sie je nach gewünschtem Inokulum 10 Mikroliter aus dem entsprechenden Mikrotiter. Wischen Sie anschließend die Oberfläche des zu injizierenden Insekts mit 95 %igem Ethanol ab. Es ist am schwierigsten, das Insekt während des Eingriffs in der geeigneten Position für die Injektion zu halten, während gleichzeitig die Nadel manipuliert wird und darauf geachtet werden muss, den Darm des Insekts nicht zu verletzen.

Arbeiten Sie außerdem schnell, damit sich das Insekt nicht erwärmt und sich während der Injektion, die Sie es halten, zu winden beginnt. Injizieren Sie die 10 Mikroliter Zellsuspension in das Insekt in einem Winkel von weniger als 45 Grad hinter einem der Bauchbeine. Achten Sie darauf, den Darm nicht zu verletzen, und spritzen Sie die Substanz direkt unter die epidermale Schicht.

Nachdem jedes Insekt mit dem ersten Bakterienstamm injiziert wurde, plattieren Sie erneut die Verdünnungen von 10 hoch minus zwei bis 10 hoch minus sechs diesmal in die Mitte der Platte. Lassen Sie sie in Richtung unteren Rand der Platte fließen. Inkubieren Sie anschließend die Platten bei der geeigneten Temperatur und zählen Sie die Kolonien, um das Inokulum zu quantifizieren.

Nachdem der Verdünnungs-, Auftrags- und Injektionsprozess für jeden Bakterienstamm wiederholt wurde, injizieren Sie drei bis fünf Insekten mit steriler PBS-Pufferlösung für die negative Kontrollgruppe. Anschließend inkubieren Sie alle Insekten bei 26 Grad Celsius und einem Licht-Dunkel-Zyklus von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit. Überwachen Sie abschließend das Überleben der Insekten im Zeitverlauf nach den Injektionen; die Insekten zeigen häufig vor dem Tod einen Appetitverlust, wässrigen, gelben Durchfall, Ausscheidungen und/oder Wasserverlust während der Infektion.

Der Tod von Insekten wird als Fehlen willkürlicher Bewegungen nach Reizung charakterisiert. In diesem Test wurden die Insekten mit etwa 50 koloniebildenden Einheiten entweder eines Wildtyps oder eines abgeschwächten Mutantenstamms von Xer Haus NLA groan in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase injiziert. Die Insekten wurden etwa 72 Stunden lang beobachtet, und der Prozentsatz der injizierten Insekten, die zu jedem Zeitpunkt noch lebten, wurde erfasst.

In diesem Experiment zeigte der abgeschwächte Stamm eine deutliche Verzögerung beim Abtöten der Insekten, während der Wildtyp innerhalb von 30 Stunden nach der Injektion alle sechs Larven tötete, bevor irgendeine der mit dem Mutanten infizierten Larven starb. Die Daten unterscheiden sich statistisch signifikant nach dieser Methode. Andere Verfahren wie die RNA-Extraktion und die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion können durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob das Bakterium in der Lage ist, die Immunantwort des Insekts zu beeinflussen.