Plaque-Assay für Murine Norovirus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, infektiöse neuronale Noroviruspartikel zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine zehnfache Verdünnung des Virusinokulums hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Verdünnung des Virusinokulums auf eine rohe 2 6 4 0,7-Monomerschicht zu übertragen und die Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln zu inkubieren.

Als Nächstes wird das Inokulum abgesaugt und mit einem Gemisch im Verhältnis eins zu eins aus C-Plaque-Aros und zwei XMEM überlagert; die Platten werden dann 48 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator inkubiert. Im letzten Schritt wird eine neutrale Rot-Färbungslösung zugegeben und die Platten für ein bis drei Stunden in einem Zellkultur-Inkubator inkubiert. Schließlich wird die neutrale Rot-Färbungslösung vorsichtig abgesaugt, wobei die Aros-Überlagerung nicht entfernt wird, und die Plaques werden mithilfe einer Lichtbox erfasst.

Diese Methode zur Quantifizierung infektiöser Viruspartikel kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Norovirus zu beantworten, beispielsweise die Menge an infektiösen Partikeln, die mit dem Stuhl ausgeschieden werden, oder welche Gewebe eine Infektion unterstützen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, gesunde und lebensfähige Zellen während des gesamten Assays zu erhalten. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da der Plaque-Assay für das Norovirus bei Personen ohne vorherige Erfahrung schwer verständlich sein kann.

Die erfolgreiche Durchführung dieses Assays ist eine aufeinanderfolgende Abfolge von Schritten, die eine geeignete Zellmenge, die richtige Temperatur und eine präzise Handhabung erfordern, um Plaques leicht beobachten zu können. Überprüfen Sie zunächst die Zellmonoschicht unter einem Lichtmikroskop, um die Zellmorphologie zu beurteilen. Der Großteil der Zellen sollte rund erscheinen.

Lassen Sie die Zellen nicht überwachsen, da sie in der Regel keine Plaques bilden, wenn man eine nahezu konfluente 175 cm² Zellkulturflasche mit RAW 264.7-Zellen für den Murine-Neurovirus-Plaque-Assay bearbeitet. Aspirieren Sie das Medium aus der Flasche und geben Sie 10 Milliliter frisches DMEM 10 % hinzu. Schaben Sie anschließend die Zellen vom Boden der Flasche ab und aspirieren Sie die Zellsuspension mithilfe einer 10-Milliliter-Pipette, um sie dann erneut gegen den Flaschenboden zu pressen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens dreimal, um eventuelle Zellklumpen aufzulösen.

Um einen Stammkolben anzupassen. Entnehmen Sie ein bis zwei Milliliter Zellsuspension und geben Sie diese in einen frischen Kolben mit 175 Quadratzentimetern Fläche, der 33 bis 34 Milliliter DMEM 10 enthält. Inkubieren Sie den Kolben zwei bis drei Tage lang in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und massieren Sie erneut.

Wenn das Komplement zur Ansaat der Platten für den Assay vorliegt, stellen Sie die Dichte der Zellsuspension auf eine Million lebensfähiger Zellen pro Milliliter in DMEM 10 ein und geben Sie zwei Milliliter dieser Suspension in jede Vertiefung einer 3,5 cm Durchmesser umfassenden Sechs-Loch-Platte. Decken Sie die Platte ab und schütteln Sie sie anschließend unverzüglich zehnmal von Hand, um die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen zu verteilen.

Die Platte nicht anschwellen lassen, da dies dazu führt, dass sich die Zellen in der Mitte der Vertiefung ansammeln. Anschließend die Platte für mindestens vier Stunden, idealerweise über Nacht, in einen Gewebekultur-Inkubator stellen, damit die Zellen anhaften können. Das Virusinokulum kann entweder aus mit MNV infizierten homogenisierten Gewebeproben oder aus Fäkalproben von mit MNV infizierten Mäusen gewonnen werden. Werden Gewebeproben verwendet, ein erbsengroßes Stück Gewebe in ein 2-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen mit sterilen Silikakügelchen und einem Milliliter DMEM 10 geben und homogenisieren.

Ein Magnetisierer wird eine Minute lang bei 6.000 U/min verwendet. Falls Fäkalproben verwendet werden, homogenisieren Sie nicht mehr als drei Fäkalkügelchen auf die gleiche Weise, frieren Sie die homogenisierten Proben bei minus 80 Grad Celsius ein und tauen Sie das Inokulum am Tag des Plaque-Assays auf. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 1,35 Milliliter DMEM fünf in jedes Loch einer 24-Loch-Platte abzugeben, und pipettieren Sie anschließend 0,15 Milliliter des dritten Virusinokulums in das erste Loch der Platte.

Führen Sie zehnfache serielle Verdünnungen durch, indem Sie 0,15 Milliliter der ersten 10⁻¹-Verdünnung ansaugen und in die zweite Vertiefung der Platte überführen, um eine 10⁻²-Verdünnung zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang anschließend mit der Verdünnung aus der zweiten Vertiefung, um eine 10⁻³-Verdünnung herzustellen. Beachten Sie, dass je nach Probe weitere Verdünnungen bis hin zu 10⁻⁹ erforderlich sein können.

Nachdem die serielle Verdünnung vorbereitet wurde, beschriften Sie die Platten mit 60 bis 80 % konfluenten RAW 264.7-Zellen mit den Probennamen und der verwendeten Verdünnung. Entfernen Sie dann das gesamte Medium von einer der Platten, indem Sie es abpipettieren oder herausschütteln, und geben Sie 0,5 Milliliter der verdünnten Probe in ein Well. Wiederholen Sie dies mit einem duplizierten Well und fahren Sie anschließend mit der nächstniedrigeren Verdünnung fort.

Nachdem alle drei Verdünnungen in Duplikat auf eine Platte gegeben wurden, kippen Sie die Platte vor und zurück, um sicherzustellen, dass alle Zellen bedeckt sind. Wiederholen Sie den Vorgang mit der nächsten Zellplatte. Sobald alle Platten behandelt wurden, stellen Sie die Platten auf ein Schüttelgerät, das auf etwa 18 Oszillationen pro Minute eingestellt ist, und lassen Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren; erwärmen Sie eine Flasche zuvor vorbereiteter und/oder eingeschlossener Aros im Mikrowellenofen, bis sie geschmolzen ist.

Bringen Sie die geschmolzenen Agarosen dann in ein Wasserbad mit 42 Grad Celsius, um sie auf die Temperatur einzustellen. Mischen Sie anschließend die geschmolzene Agarose im Verhältnis 1:1 mit steriler 2xMEM-Medien in einer sterilen Flasche. Stellen Sie die Flasche mit dieser Überzugslösung in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius, bis sie verwendet wird.

Nach der einstündigen Inkubation das Inokulum aus jedem Well abpipettieren und langsam zwei Milliliter der Überzuglösung in jedes Well geben, wobei die Pipettenspitze an der Wand jedes Wells angelehnt werden sollte. Um ein Lösen der Zellen zu verhindern, die Platten abdecken und den Überzug etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur gerinnen lassen. Anschließend die Platten in den Zellkultur-Inkubator für 48 Stunden überführen.

Nach der Inkubationszeit die Platten auf das Vorhandensein von Plaques überprüfen. Falls keine Plaques sichtbar sind, die Platten für weitere vier Stunden in den Inkubator zurückstellen und anschließend erneut überprüfen. Das Verfahren bei Bedarf wiederholen, wobei die Inkubationszeit 72 Stunden nicht überschreiten darf.

Bereiten Sie zunächst die Neutralrot-Färbungslösung vor. Geben Sie anschließend für dieses Protokoll zwei Milliliter der Neutralrot-Lösung in jede Vertiefung; der Aros-Stopfen muss nicht entfernt werden. Inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Nach Ablauf der Inkubationszeit die Platten auf das Vorhandensein von Plaques überprüfen, wobei die Neutralrot-Lösung in den Vertiefungen verbleibt. Falls keine Färbung erkennbar ist, die Platten maximal drei Stunden lang weiter inkubieren, zusätzlich jeweils um eine Stunde. Sobald die Plaques sichtbar sind, die Neutralrot-Lösung abpipettieren, wobei sichergestellt werden muss, dass der entstandene Pfropfen nicht gestört wird, und anschließend mit der Zählung der Plaques fortfahren.

Untersuchen Sie die Platten und ermitteln Sie die Verdünnung, bei der die Plaques deutlich voneinander getrennt sind. Stellen Sie die Platte auf eine Lichtbox und zählen Sie die Plaques, wobei Sie einen Punkt auf bereits gezählte Plaques markieren, um Doppelzählungen zu vermeiden.

Wiederholen Sie dann die Zählung in einem anderen Ansatz mit einer anderen Virusverdünnung und berechnen Sie die Virus-Titer in Plaque-bildenden Einheiten pro Milliliter. Gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll zeigt dieses repräsentative Bild eine Zellschicht vor der Infektion. Die rohen 2 6 4 0.7-Zellen wurden über Nacht kultiviert und unter einem Lichtmikroskop mit 20-facher Vergrößerung abgebildet.

Dieses Bild zeigt denselben Monolayer nach der Bildung von Plaques. Die Zellen wurden nach 48 Stunden Infektion mit einer 0,01 %igen Neutralrot-Lösung gefärbt und unter einem Lichtmikroskop mit vierfacher Vergrößerung visualisiert. Römische Ziffern eins, zwei und drei markieren drei sichtbare Plaques.

Dieses Bild zeigt eine Platte am Ende des Plaque-Assay-Protokolls mit duplizierten Wells aus drei zehnfachen Verdünnungsstufen, die mit römischen Ziffern gekennzeichnet sind. Die Nummern eins und vier entsprechen der 10 zur Potenz minus eins, zwei und fünf der 10 zur Potenz minus zwei und drei sowie sechs der 10 zur Potenz minus drei Verdünnung.

Die Virus-Titer der Probe sind unten angegeben. Während des Ablaufs dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, zwischen den Verdünnungen die Pipettenspitzen zu wechseln, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu vermeiden, die Lösungen auf die richtige Temperatur zu temperieren und zu verhindern, dass die Zellmono-Layer austrocknen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Plaque-Assay durchführt und infektiöse Partikel von mi-Neurovirus quantifiziert.

Vergessen Sie nicht, dass beim Arbeiten mit Mira Norovirus im Sicherheitswerkbank stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzkittel getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird, und dass Abfälle gemäß den Richtlinien Ihres örtlichen Biosicherheitsausschusses ordnungsgemäß entsorgt werden müssen.