Synthese von Phase-shift Nanoemulsionen mit enger Größenverteilung für Acoustic Droplet Vaporisation und Bubble-enhanced Ultraschall-vermittelte Ablation

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wirkung von Blasen zu beobachten, die durch die akustische Verdampfung lipidgekapselter Nanoemulsionen bei der ultraschallvermittelten Ablation entstehen. Dies wird erreicht, indem zunächst lipidgekapselte Nanoemulsionen gleichmäßig in Albumin-beladene Polyacrylamid-Hydrogelen dispergiert werden. Im zweiten Schritt sendet ein fokussierter Wandler kurze, hochamplituden Pulse in das Hydrogel, wodurch die Nanoemulsionen lokal im Fokus verdampfen. Anschließend werden die resultierenden Blasen kontinuierlich mit Ultraschall angeregt, und die von den Blasen abgestrahlte akustische Energie wird rasch vom Hydrogel absorbiert, was die Geschwindigkeit der ultraschallvermittelten Erwärmung beschleunigt.

Die Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein von Blasen die Zeit und Energie, die erforderlich sind, um das Hydrogel über die Schwellentemperatur für die Denaturierung von Proteinen zu erhitzen, erheblich reduziert, was zu einer schnelleren und effizienteren, ultraschallvermittelten Ablation führt. Die Größe der Phasenwechsel-Nanoemulsion ist ein entscheidender Faktor für die Druckschwelle. Für die akustische Vaporisation haben wir ein Protokoll zur Herstellung stabiler Phasenwechsel-Nanoemulsionen mit schmalen Größenverteilungen und gut definierten Vaporisationsschwellen entwickelt sowie ein In-vitro-System zur Bewertung des Einflusses auf die ultraschallvermittelte Ablation.

Während ein In-vitro-System beschrieben wird, sind die Oberflächen von Nanoemulsionen darauf ausgelegt, extravaskuläres Gewebe und solide Tumore mit Partikeln zu erreichen, die akustisch verdampft werden können. Die gebildeten Blasen können dann für diagnostische oder therapeutische Anwendungen in der Krebsbehandlung genutzt werden. Um mit der Vorbereitung einer Phasenwechsel-Nanoemulsion oder PSNE zu beginnen, mischen Sie zunächst die Lipide zusammen und lösen Sie 11 Milligramm DPPC und 1,7 Milligramm DSPE auf.

Peg 2000 in Chloroform in einem Glas-Rundkolben. Stellen Sie den Rundkolben in ein Wasserbad mit 50 Grad Celsius im Abzug und verwenden Sie einen Argon-Gasstrom, um das organische Lösungsmittel zu verdampfen. Um einen trockenen Lipidfilm zu bilden, stellen Sie den Kolben in einen Exsikkator und lassen Sie ihn über Nacht unter Vakuum, um den Lipidfilm am folgenden Morgen zu trocknen.

Rehydratisieren Sie den Lipidfilm mit 5,5 Millilitern PBS. Erhitzen Sie die Lösung in einem Wasserbad bei 45 Grad Celsius, bis sich der Lipidfilm zum Abtasten aufgelöst hat. Überführen Sie die Lipidlösung periodisch in ein 7-Milliliter-Gefäß und sonifizieren Sie sie dann zwei Minuten lang mit einem Sonden-Sonifikator bei 20 % Amplitude.

Teilen Sie die Lösung auf zwei Vials mit jeweils 2,5 Milliliter auf. Die verbleibenden 0,5 Milliliter werden verworfen. Geben Sie 2,5 Milliliter PBS zu jedem Vial hinzu und stellen Sie anschließend beide Vials in ein Eiswasserbad mit null Grad Celsius.

Fügen Sie 50 Mikroliter Doca-Fluorpentan oder DDFP zu jeder Probe hinzu. Sohn der DDFP-Lipidmischung. In einem Eiswasserbad befindet sich der kritischste Teil dieses Verfahrens.

Das Eiswasserbad dient dazu, die Verdunstung der flüssigen Phase pro Fluorkohlenwasserstoff zu verhindern. Sonizieren Sie während dieses Vorgangs jedes Gefäß im Eiswasserbad mit folgenden Einstellungen: 25 % Amplitude im gepulsten Modus und insgesamt 60 Sekunden. Nach der Sonifikation überführen Sie die PSNE-Lösung in 20 Milliliter- Szintillationsgefäße mit jeweils fünf Milliliter PBS pro Gefäß, sodass sich ein Endvolumen von 10 Milliliter pro Gefäß ergibt.

Bauen Sie den Extruder gemäß den Herstelleranweisungen zusammen, um den Extruder vorzubereiten. Geben Sie 10 Milliliter deionisiertes Wasser in die obere Probenöffnung. Verschließen Sie die Öffnung und ziehen Sie das Entlüftungsventil fest an.

Öffnen Sie langsam die Stickstoffgasleitung, um den Druck zu erhöhen und die Probe durch die Membranen zu pressen. Sammeln Sie die Probe aus der Auslassleitung und extrudieren Sie das PSNE 16-mal durch einen 100-Nanometer- oder 200-Nanometer-Filter, um eine enge Größenverteilung zu erhalten. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie ein Polyacrylamidhydrogel herstellen, das PSNE enthält.

Zunächst stellen Sie eine 24 %ige Rinderserumalbumin- oder BSA-Lösung her, indem Sie 2,4 Gramm BSA-Pulver in 10 Milliliter entionisiertem Wasser auflösen. Danach bereiten Sie eine 10 %ige Ammoniumpersulfat- oder APS-Lösung zu, indem Sie ein Gramm APS-Pulver in 10 Milliliter entionisiertem Wasser verdünnen. Mischen Sie diese Reagenzien in einer Kunststoffform in der folgenden Reihenfolge: 2,1 Milliliter Acrylamidlösung, 1,2 Milliliter Tris-Puffer, 0,1 Milliliter 10 %ige APS-Lösung, 4,5 Milliliter 24 %ige BSA-Lösung und 3,6 Milliliter entionisiertes Wasser. Erwärmen Sie die Lösung in einem Wasserbad auf 40 Grad Celsius und setzen Sie sie anschließend eine Stunde lang unter Vakuum, um die Flüssigkeit zu entgasen.

Dies ist erforderlich, um nach einer Stunde die Bildung unerwünschter Blasen im Hydrogel zu vermeiden. Entfernen Sie die Probe aus dem Vakuum, geben Sie 480 Mikroliter PSNE-Suspension hinzu und mischen Sie gründlich durch vorsichtiges Schwenken der Kunststoffkammer. Geben Sie in einer chemischen Abzugshaube 12 Mikroliter Tetraethylendiamin oder T-E-M-E-D hinzu, um das Acrylamid zu polymerisieren, und stellen Sie die Kammer zwei Stunden lang in ein Wasserbad mit 12 Grad Celsius.

Die Polymerisation ist exotherm, daher ist ein Kühlbad erforderlich, um die Verdampfung von PSE während der Polymerisation zu vermeiden. Sobald das Acrylamid polymerisiert ist, positionieren Sie einen fokussierten Leistungswandler und eine Bildgebungsprobe in einem Acryltank, der mit deionisiertem Wasser aus DGAs gefüllt ist, sodass die Bildgebungsebene mit dem Fokalvolumen des Wandlers übereinstimmt. Als Nächstes positionieren Sie das mit PSNE beladene Polyacrylamidhydrogel im Fokus des Leistungswandlers, verdampfen das PSNE innerhalb des Hydrogels mit kurzen akustischen Impulsen und schließen dies mit einer 15 Sekunden dauernden Dauerschallbelastung für eine blasenverstärkte Ablation ab.

Da das BSA denaturiert ist, wird das Hydrogel trüb, bedingt durch die Absorption von Ultraschall und Wärmeentwicklung innerhalb der monitorisierten Vaporisation und Blasenbildung mit einem diagnostischen Ultraschallgerät. In diesem Beispielbild zeigt der Pfeil den Fokusbereich an, in dem eine Blasenwolke durch die Vaporisation von PSNE entstanden ist. Wiederholen Sie die akustische Exposition an einer neuen Stelle im Hydrogel, ohne das PSNE erneut aufzubringen, und vergleichen Sie Zeit und Volumen der Ablation.

Dieses Protokoll führt zu lipidbeschichteten perfluorkohlenstoffhaltigen Tröpfchen mit einer engen Größenverteilung. Die mit dynamischer Lichtstreuung gemessene Größenverteilung ist hier für PSNE dargestellt, die durch 100- und 200-Nanometer-Filter extrudiert wurden. Die Einheiten der Ordinatenachsen basieren auf der Intensität des von Partikeln einer bestimmten Größe gestreuten Lichts im Verhältnis zur gesamten Streulichtintensität der Probe.

Wenn der mittlere Durchmesser und die Standardabweichung von PSNE an einem und sieben Tagen nach der Extrusion mit 100- und 200-Nanometer-Filtern mittels dynamischer Lichtstreuung gemessen werden, zeigen die Ergebnisse, dass PSNE mindestens eine Woche lang stabil sind. Diese Abbildung zeigt B-Modus-Bilder von PSNE vor und nach der Verdampfung. In einem Polyacrylamidhydrogel zeigt der Pfeil den Fokusbereich an, in dem durch die Verdampfung von PSNE eine Blasenwolke entstand.

Dies sind Bilder eines Polyacrylamidhydrogels, das Albumin und PSNE enthält, vor und nach der Verdampfung und Sonolyse mittels hochintensiv fokussiertem Ultraschall oder Hy-Fu. Eine Läsion entsteht durch 15 Sekunden Hy-Fu-vermittelte Erwärmung. Die asymmetrische Form der Läsion resultiert aus einer präfokalen Erwärmung, die aufgrund der Anwesenheit einer Blasenwolke im Ultraschallstrahl entsteht. Präfokale Erwärmung und Läsionsbildung infolge Streuung an Blasen können minimiert werden, indem die übertragene akustische Leistung nach der Entwicklung verringert wird.

Diese Methode zur Herstellung stabiler Nanoemulsionen mit Phasenwechsel wird Forschern auf dem Gebiet der ultraschallvermittelten Therapie den Weg ebnen, eine blasenverstärkte HIFU-Ablation bei soliden Tumoren zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie stabile Nanoemulsionen mit schmalen Größenverteilungen hergestellt werden und wie die Blasenbildung sowie die verstärkte ultraschallvermittelte Ablation untersucht werden kann.