Gleichzeitige Intrazelluläre Aufnahme eines Lumbar Motoneuron und dem Force durch seine Motor Unit in der adulten Maus Produziert In vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die elektrophysiologischen und kontraktilen Eigenschaften einer einzelnen motorischen Einheit der Maus zu untersuchen, indem intrazelluläre Ableitungen von Motoneuronen in vivo durchgeführt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst das Rückenmark und der betreffende Muskel freigelegt werden. Anschließend wird ein Kraftaufnehmer am Sehnenansatz des Muskels befestigt.

Anschließend wird das Motoneuron mit einer intrazellulären Elektrode stimuliert, wodurch die Kontraktion der aufgezeichneten motorischen Einheit ausgelöst wird. Letztendlich können so die elektrophysiologischen Eigenschaften des Motoneurons gleichzeitig mit den kontraktilen Eigenschaften seiner motorischen Einheit charakterisiert werden. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend, da die mikrochirurgischen Schritte aufgrund der geringen Größe des Tieres sehr schwer zu erlernen sind.

Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine Maus durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital oder einer Mischung aus Ketamin und Xylazin betäuben. Stellen Sie sicher, dass die Maus keine Zehenquetschreflexe zeigt. Schneiden Sie anschließend mit einer stumpfen Schere einen Einschnitt über der Luftröhre und ziehen Sie die Haut beidseits auseinander.

Dann zerreißen Sie die Speicheldrüse mit einem Paar stumpfer Pinzette. Um zwei dünne Muskeln, die die Luftröhre bedecken, freizulegen, trennen Sie die beiden Muskeln, um die Luftröhre sichtbar zu machen. Verwenden Sie ein Paar Dumont-7-Pinzetten.

Schieben Sie zwei Fäden einer vierfachen Aut-Silk-Naht unter die Trachea. Dann führen Sie einen Querschnitt in der Trachea zwischen zwei knorpeligen Ringen durch. Achten Sie jedoch darauf, die Trachea nicht vollständig zu durchtrennen.

Setzen Sie nun den Trachealtubus in die Luftröhre ein. Sichern Sie beide Seiten der Einführungsöffnung, indem Sie die Nähte darüber verknoten. Anschließend verbinden Sie den Trachealtubus mit einem Mausbeatmungsgerät und einem Kapnographen.

Verbinden Sie dann den Beatmungsapparat über einen Compliance-Beutel mit reinem Sauerstoff. Stellen Sie die Parameter des Beatmungsgeräts so ein, dass die Maus nicht gegen die künstliche Beatmung ankämpft und der endexspiratorische Kohlendioxidpartialdruck zwischen vier und fünf Prozent stabil bleibt. In diesem Schritt wird die Vena jugularis auf einer Seite des Halses mittels stumpfer Dissektion freigelegt.

Die Vena jugularis teilt sich in zwei Hauptstämme auf, die vordere und hintere Gesichtsvene. Trennen Sie die Vene vorsichtig von ihrem umgebenden Bindegewebe. Führen Sie dann zwei Fäden aus Seidennähgarn der Stärke sechs unter die Vene ein und platzieren Sie sie so weit wie möglich voneinander entfernt entlang der Länge der Vene.

Als Nächstes platzieren Sie eine kleine Gefäßklemme auf der proximalen Seite der Vene und ligieren Sie das distale Ende der Vene. Mit einer sehr feinen Iris-Schere führen Sie einen kleinen transversalen Schnitt in die Vene ein. Achten Sie darauf, die Vene nicht vollständig zu durchtrennen.

Danach einen vorgefüllten Katheter nach French über die Öffnung bis zur Gefäßklemme, die die Vene und den Katheter zusammenhält, einführen. Die Gefäßklemme vorsichtig entfernen. Anschließend den Katheter einige Millimeter weiter in die Vene vorschieben. Den Katheter durch Verbinden mit Nahtmaterial auf beiden Seiten der Einführstelle sichern.

Als Nächstes verbinden Sie einen der Katheter mit einer Spritze oder einer Spritzenpumpe, um zusätzliche Dosen von Anästhetika wie Pentobarbital, Natrium oder Ketamin-Xylazin zu injizieren. Wiederholen Sie den Vorgang für eine weitere Vene und verbinden Sie den anderen Katheter mit einer Spritzenpumpe für eine langsame intravenöse Infusion einer 4%igen Glucoselösung, die 1% Natriumbicarbonat und 14% Plasmon enthält. Schließen Sie zum Schluss die Hautoberfläche des Halses mit einer Nadel und Naht.

Danach bringen Sie die Maus in Bauchlage zurück. Führen Sie nun einen Schnitt von der Oberschenkelspitze bis zur Achillessehne durch. Lösen Sie die Haut von den darunterliegenden Muskeln und achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht zu beschädigen.

Als Nächstes identifizieren Sie den vorderen Rand des Musculus biceps femoris, der als weiße Linie erscheint, die am Oberschenkel entlang verläuft. Öffnen Sie dann vorsichtig entlang dieser Linie vom Knie bis hin zum Hüftknochen. Trennen Sie die Muskeln, um den Nervus ischiadicus unterhalb des Musculus biceps femoris freizulegen.

Dissezieren Sie den Musculus biceps femoris vorsichtig und entfernen Sie ihn. Um den Nervus ischiadicus und die Musculi triceps surae freizulegen, identifizieren Sie den Nervus tibialis zwischen dem Nervus peronaeus communis und dem Nervus suralis. Unter den verschiedenen Ästen des Nervus tibialis unterscheiden Sie die Äste, die den Musculus triceps surae versorgen, von den tiefer verlaufenden Ästen.

Verwenden Sie acht OTT-Seidenfäden, um alle Äste des Nervus tibialis zusammenzubinden, wobei die Äste, die den Musculus triceps surae innervieren, intakt bleiben. Durchtrennen Sie den Nervus tibialis so weit wie möglich vom Knoten entfernt. Identifizieren Sie die Wirbel T 13 und L1, wobei T 13 der letzte Wirbel ist, an dem Rippen angeheftet sind.

Dann immobilisieren Sie die Wirbelsäule mit den Cunningham-Spinalklemmen an beiden Seiten von T 13 und L 1. Achten Sie darauf, das Rückenmark nicht zu komprimieren, sondern leichten Zug entlang der Längsachse auszuüben. Stellen Sie sicher, dass die Wirbelsäule gut befestigt ist, indem Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette nach unten drücken.

Entfernen Sie mithilfe feiner R-Zangen die Dornfortsätze und anschließend die Lamine bei T13 und L1, um das Rückenmark freizulegen. Platzieren Sie dann ein speziell angefertigtes Kunststoffbad, das das Rückenmark umgibt. Befestigen Sie danach das Bad mit einem Seidenfaden der Stärke 4 an Ort und Stelle.

Zuletzt stellen Sie sicher, dass das Bad wasserdicht ist, indem Sie es mit Schnellguss-Dichtmittel abdichten. Sobald der Schnellguss getrocknet ist, entfernen Sie die Baumwollbedeckung des Rückenmarks und füllen das Bad mit Mineralöl. Verwenden Sie eine weitere Wirbelklemme, um einen Dornfortsatz des Sakralbereichs zu fixieren.

Um den hinteren Bereich des Tieres zu stützen, verwenden Sie eine dritte Klemme, um das rechte Hinterbein und den Knöchel fixiert zu halten, wobei das Bein am Knie und am Knöchel jeweils im 90-Grad-Winkel gebeugt ist. Entfernen Sie die Mullbinde, die den Bereich des Hinterbeins bedeckt. Präparieren Sie die Achillessehne vom umgebenden Gewebe frei.

Schneiden Sie den Trizeps so weit wie möglich aus dem umgebenden Gewebe heraus, indem Sie eine Nadel mit Faden verwenden. Fädeln Sie eine Seidennaht der Stärke 6/0 durch die Achillessehne und knoten Sie sie mit einem dreifachen Knoten um die Sehne. Bringen Sie dann den Kraftaufnehmer nahe am Knoten an.

Danach befestigen Sie die Sehne mithilfe des Seidenfadens am Kraftaufnehmer und schneiden Sie den distalen Teil der Sehne ab. Anschließend führen Sie zwei Edelstahl-Drähte unter die Faszie der Musculus-triceps-sury-Muskeln ein. Diese Drähte sind mit einem extrazellulären Wechselstromverstärker verbunden.

Platzieren Sie für die EMG-Aufzeichnung den Nervus tricipitis surae an der Kathode einer Hakenelektrode, wobei die Anode einen benachbarten Muskel berührt. Anschließend stimulieren Sie den Nervus tricipitis surae mit einem 50 Mikrosekunden langen Rechteckimpuls zunehmender Intensität bei niedriger Frequenz, bis die maximale Zuckungsamplitude beobachtet wird. Danach stimulieren Sie den Nervus tricipitis surae erneut mit einem 50 Mikrosekunden langen Rechteckimpuls zunehmender Intensität bei niedriger Frequenz, bis die maximale Zuckungsamplitude erreicht ist.

Diese Abbildungen zeigen, wie man ein Motoneuron aus der Trizeps-sury-Gruppe identifiziert. Nach Eindringen bei geringer Reizintensität kann bei höherer Intensität nur ein monosynaptisches EPSP beobachtet werden. Das EPSP kann bei noch höherer Reizintensität groß genug sein, um einen orthotropen Aktionspotentialauslöser zu triggern, und zwar nach dem Alles-oder-Nichts-Prinzip.

Ein antidromer Aktionspotential tritt mit einer kürzeren Latenz auf als das monosynaptische EPSP. Wenn über die Mikroelektrode genügend Strom injiziert wird, um ein Aktionspotential auszulösen, kann eine EMG-Aktivität im Muskel nach einer kurzen Verzögerung registriert werden, gefolgt von einem Muskelzucken.

Nach der Identifizierung des Motoneurons können dessen elektrophysiologischen Eigenschaften charakterisiert werden. Beispielsweise zeigt diese Abbildung, wie der Eingangswiderstand mithilfe von hyperpolarisierenden und depolarisierenden Stromimpulsen gemessen werden kann, indem die Änderungen des Membranpotentials in Abhängigkeit von der injizierten Strommenge aufgetragen werden. Die kontraktilen Eigenschaften der motorischen Einheit können ebenfalls mit verschiedenen Stimulationsprotokollen untersucht werden.

Zum Beispiel kann die Kraft-Frequenz-Beziehung ermittelt werden, indem kurze Stromimpulse mit verschiedenen Frequenzen in das Motoneuron injiziert werden. Die stationäre Kraft kann dann gegen die Frequenz der Stromimpulse aufgetragen werden, um eine sigmoidale Kraft-Frequenz-Kurve darzustellen. Wenn die chirurgische Technik beherrscht ist, kann ein Teil dieses Verfahrens bei perfekter Durchführung innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden.