Gleichzeitige Intrazelluläre Aufnahme eines Lumbar Motoneuron und dem Force durch seine Motor Unit in der adulten Maus Produziert In vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die elektrophysiologischen und kontraktilen Eigenschaften einer einzelnen motorischen Einheit der Maus durch intrazelluläre Aufzeichnungen von Motoneuronen in vivo zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zuerst das Rückenmark und der interessierende Muskel freigelegt werden. Dann wird ein Kraftaufnehmer an der Sehne des Muskels befestigt.

Als nächstes wird das Emoto-Neuron mit einer intrazellulären Elektrode stimuliert, wodurch die Kontraktion der aufgezeichneten motorischen Einheit bewirkt wird. Letztlich lassen sich die elektrophysiologischen Eigenschaften des Motoneurons gleichzeitig charakterisieren wie die kontraktilen Eigenschaften seiner motorischen Einheit. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die mikrochirurgischen Schritte aufgrund der geringen Größe des Tieres sehr schwer zu erlernen sind.

Um den Eingriff zu beginnen, betäuben Sie eine Maus, indem Sie Pentobarbital-Natrium oder eine Mischung aus Ketamin und Xylazin intraperitoneal injizieren. Stellen Sie sicher, dass die Maus keinen Zehenklemmreflex hat. Machen Sie dann mit einer stumpfen Schere einen Schnitt über die Luftröhre und ziehen Sie die Haut auf beiden Seiten weg.

Reißen Sie dann die Speicheldrüse mit einer stumpfen Pinzette auseinander. Um zwei dünne Muskeln freizulegen, die die Luftröhre bedecken, trennen Sie die beiden Muskeln, um die Luftröhre freizulegen. Mit einer Dumont Seven Pinzette.

Schieben Sie zwei Fäden mit vier Aut-Seidenfäden unter die Luftröhre. Machen Sie dann einen Querschnitt in der Luftröhre zwischen zwei Knorpelringen. Achten Sie aber darauf, die Luftröhre nicht vollständig zu durchtrennen.

Führen Sie nun den Trachealtubus in die Luftröhre ein. Sichern Sie beide Seiten der Einstichöffnung, indem Sie die Nähte darüber binden. Schließen Sie danach den Trachealtubus an ein Mausbeatmungsgerät und einen Kapnographen an.

Verbinden Sie dann das Beatmungsgerät über einen Compliance-Beutel mit dem reinen Sauerstoff. Passen Sie die Parameter des Beatmungsgeräts so an, dass die Maus nicht gegen die künstliche Beatmung und das Kohlendioxid am Ende der Tide ankämpft. Der Partialdruck liegt stabil zwischen vier und 5 %In diesem Schritt legen Sie die Halsvene auf einer Seite des Halses mit stumpfen Dissektionstechniken frei.

Die Vena jugularis teilt sich in zwei große Stämme, die vordere und die hintere Gesichtsvene. Trennen Sie die Vene vorsichtig vom umgebenden Bindegewebe. Schieben Sie dann zwei Fäden von sechs auten Seidenfäden unter die Vene und trennen Sie sie so weit wie möglich entlang der Vene.

Platzieren Sie als Nächstes einen kleinen Gefäßclip auf der proximalen Seite der Vene und binden Sie die distale Seite der Vene ab. Machen Sie mit der sehr feinen Irisschere einen kleinen Querschnitt in die Vene. Seien Sie sehr vorsichtig, die Vene nicht vollständig zu durchtrennen.

Führen Sie danach einen vorgefüllten französischen Katheter in die Öffnung bis zum Gefäßclip ein, der die Vene und den Katheter zusammenhält. Entfernen Sie vorsichtig den Gefäßclip. Schieben Sie dann den Katheter noch einige Millimeter in die Vene. Sichern Sie den Katheter, indem Sie ihn mit den Nähten auf beiden Seiten des Ansatzes verbinden.

Schließen Sie anschließend einen der Katheter an eine Spritze oder eine Spritzenpumpe an, um zusätzliche Dosen von Anästhetika wie Pentobarbital, Natrium oder Ketaminxylazin zu injizieren. Wiederholen Sie den Vorgang für eine andere Vene und schließen Sie den anderen Katheter an eine Spritzenpumpe an, um eine langsame intravenöse Infusion einer 4%igen Glukoselösung mit 1%Natriumbicarbonat und 14%Plasmon zu erhalten. Zum Schluss die Halshaut mit einer Nadel mit Naht verschließen.

Bringen Sie danach die Maus wieder in die Bauchlage. Mache nun einen Schnitt von der Oberseite des Oberschenkels bis zur Achillessehne. Trennen Sie die Haut von den darunter liegenden Muskeln und achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht zu beschädigen.

Identifizieren Sie als Nächstes den vorderen Rand des Bizeps femoris, der als weiße Linie erscheint, die am Oberschenkel entlang verläuft. Öffne dann vorsichtig entlang der Linie vom Knie bis zum Hüftknochen. Trennen Sie die Muskeln, um den Ischiasnerv unter dem Bizeps femoris freizulegen.

Präparieren Sie vorsichtig den Bizeps femoris und entfernen Sie ihn. Um den Ischiasnerv und die Trizeps-Siri-Muskeln freizulegen, identifizieren Sie den Nervus tibialis zwischen dem Nervus peroneus communis und dem Nervus suralis. Identifizieren Sie unter den verschiedenen Ästen des Nervus tibialis die Äste, die den Trizeps Sury innervieren, von den Ästen, die tiefer gehen.

Binden Sie mit acht OTT-Seidenfäden alle Äste des Schienbeinnervs zusammen, während die Äste, die den Trizeps innervieren, intakt bleiben. Den Nervus tibialis so weit wie möglich vom Knoten entfernen. Identifizieren Sie die Wirbel T 13 und L eins, während T 13 der letzte Wirbel ist, an dem Rippen befestigt sind.

Dann die Wirbelsäule mit den Cunningham-Rückenmarksklemmen auf jeder Seite von T 13 und L eins ruhigstellen. Und achten Sie darauf, das Rückenmark nicht zu komprimieren, sondern üben Sie ein wenig Spannung auf die Längsachse aus. Stellen Sie sicher, dass die Wirbelsäule gut gesichert ist, indem Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette nach unten drücken.

Entfernen Sie mit den feinen R-Juroren die Wirbelsäulenfortsätze und dann das Laminat über T 13 und L eins, um das Rückenmark freizulegen. Platzieren Sie dann eine speziell angefertigte Kunststoffbadewanne, um das Rückenmark zu umgeben. Befestigen Sie danach die Badewanne mit einem vierteiligen Seidenfaden.

Stellen Sie abschließend sicher, dass die Badewanne wasserdicht ist, indem Sie sie mit Schnellguss-Dichtmittel versiegeln. Sobald der Schnellgips getrocknet ist, entfernen Sie die Baumwolle, die das Rückenmark bedeckt, und füllen Sie das Bad mit Mineralöl. Verwenden Sie eine weitere Wirbelklemme, um einen Dornfortsatz der Sakralregion zu klemmen.

Um die Rückenregion des Tieres zu stützen, verwenden Sie eine dritte Klemme, um die rechte Hintergliedmaße und den Knöchel in einem 90-Grad-Winkel am Knie zu immobilisieren, während die Gliedmaße am Knie und am Knöchel um 90 Grad gebeugt ist. Entfernen Sie die Gaze, die den Bereich der hinteren Gliedmaßen bedeckt. Präparieren Sie die Achillessehne vom umgebenden Gewebe

Schneide den Trizeps mit einer Fadennadel so weit wie möglich aus dem umgebenden Gewebe ab. Fädeln Sie eine sechsteilige Seidennaht durch die Achillessehne und machen Sie einen Dreifachknoten um die Sehne. Platzieren Sie dann den Kraftaufnehmer in der Nähe des Knotens.

Befestigen Sie danach die Sehne mit dem Seidenfaden am Kraftaufnehmer und schneiden Sie den distalen Teil der Sehne ab. Als nächstes führst du zwei Edelstahldrähte unter die Faszie der Trizeps-Sury-Muskeln ein. Diese Drähte sind mit einem extrazellularen Wechselstromverstärker verbunden.

Für die EMG-Aufzeichnung legen Sie den Trizeps-Sury-Nerv auf die Kathode einer Hakenelektrode, wobei die Anode einen nahe gelegenen Muskel berührt. Stimulieren Sie dann den Trizeps-Sury-Nerv mit einem 50-Mikrosekunden-Quadratimpuls von zunehmender Intensität bei niedriger Frequenz, bis die maximale Zuckungsamplitude beobachtet wird. Stimulieren Sie dann den Trizeps-Sury-Nerv mit einem 50-Mikrosekunden-Quadratimpuls von zunehmender Intensität bei niedriger Frequenz, bis die maximale Zuckungsamplitude beobachtet wird.

Diese Abbildungen zeigen, wie man ein Moto-Neuron aus der Trizeps-Sury-Gruppe identifizieren kann. Nach der Penetration bei niedriger Stimulationsintensität kann bei höherer Intensität nur ein monos-synaptisches EPSP beobachtet werden. Das EPSP könnte groß genug sein, um einen orthotropen Spike bei noch höherer Stimulationsintensität auszulösen, und alles oder keines.

Der antidrome Spike tritt mit einer kürzeren Latenz auf als der monos-synaptische EPSP. Wenn genügend Strom durch die Mikroelektrode eingespeist wird, um einen Spike auszulösen. Nach einer kurzen Verzögerung kann eine EMG-Aktivität am Muskel aufgezeichnet werden, gefolgt von einem Muskelzucken.

Nach der Identifizierung des Motoneurons können seine elektrophysiologischen Eigenschaften charakterisiert werden. Diese Abbildung veranschaulicht beispielsweise, wie der Eingangswiderstand mit hyperpolarisierenden und depolarisierenden Stromimpulsen gemessen werden kann, und stellt die Variationen des Membranpotentials gegenüber der Menge des eingespeisten Stroms dar. Die kontraktilen Eigenschaften der motorischen Einheit können auch mit verschiedenen Stimulationsprotokollen untersucht werden.

Zum Beispiel kann die Kraft-Frequenz-Beziehung erhalten werden, indem kurze Stromimpulse mit verschiedenen Frequenzen in das Motoneuron injiziert werden. Die stationäre Kraft kann dann gegen die Frequenz der Stromimpulse aufgetragen werden, um eine sigmoidale Kraftfrequenzkurve zu erhalten. Sobald Sie die Operation beherrschen, kann ein Teil dieser Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie perfekt ist. Richtig.