Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die EEG-definierte Schlaf- und Laktatkonzentration während der optogenetischen Stimulation an präzisen stereotaktischen Koordinaten zu messen. Chirurgische Implantation der notwendigen elektroenzephalographischen Elektroden und Kanülen für einen Laktatsensor und ein Glasfaserkabel. Führen Sie dann das Glasfaserkabel und den vorkalibrierten Laktatsensor in ihre Führungskanülen im Schädel des Tieres ein.

Passen Sie anschließend die Intensität des Blaulicht-Stimulus an, um die gewünschte elektrophysiologische Reaktion zu erzielen. Fahren Sie dann mit der Erfassung der elektroenzephalographischen, elektromyographischen und Laktatkonzentrationsdaten fort, während das Tier sich spontan verhalten und/oder schlafen darf. Im Vergleich zu anderen Methoden, wie z.B. pharmakologischen Untersuchungen des EEG, hat dieser experimentelle Ansatz den Vorteil, dass die Biochemie und Elektrophysiologie des Gehirns überwacht werden kann, während die Aktivität der Neuronen in Echtzeit auf einer Zeitskala von weniger als einer Sekunde manipuliert wird.

Das Potenzial, neue Erkenntnisse für die Schlafforschung zu gewinnen, ist also hoch. So lassen sich beispielsweise metabolische und elektrophysiologische Begleiterscheinungen des Slow-Wave-Schlafs identifizieren. Diese Art von Experimenten kann auch in anderen Bereichen der Neurowissenschaften angewendet werden, z. B. in Bezug auf Lernen und Gedächtnis, synaptische Plastizität oder Anfallsleiden.

Die Operationstechnik ist technisch anspruchsvoll. Es erfordert ein hohes Maß an Geschicklichkeit, aber das kann durch Übung erreicht werden. In dieser visuellen Demonstration werde ich die kritischen Schritte einiger komplizierter chirurgischer Eingriffe wiederholen, die die schriftliche Beschreibung ergänzen.

Sobald sich ein Tier von der Operation erholt hat, besteht die Herausforderung darin, den Laktatsensor und das Glasfaserkabel richtig einzuführen. Jonathan und ich werden zeigen, wie man das Tier mit fester Hand festhält, um diese beiden empfindlichen Ausrüstungsgegenstände einzuführen. Schließlich zeigen wir, wie man die EEG-Reaktion optimieren kann, indem man die Intensität des Stimulus in Echtzeit anpasst.

Verwenden Sie für dieses Experiment transgene Mäuse, die den blaulichtempfindlichen Kationenkanal exprimieren. Der Kanal nimmt in zwei zerebralen kortikalen Neuronen an. Betäuben Sie die Maus zunächst mit 5 % Fluor, 95 % Sauerstoff zur Induktion, während Sie die Anästhesie mit 3 % Fluor und 97 % Sauerstoff aufrechterhalten.

Machen Sie einen medialen Schnitt an der Oberseite des Schädels zwischen den Augen bis zur Rückseite des Schädels. Reinigen Sie den Schädel mit Wasserstoffperoxid und steriler Kochsalzlösung. Lokalisieren und markieren Sie B und Lambda zur Bestimmung stereotaktischer Koordinaten für optogenetische Stimuluskonfigurationen der Elektrode: Grundieren von Schraubenlöchern mit einem Hochgeschwindigkeits-Dentalbohrer mit einem 0,5-Millimeter-Kugelbohrer, gefolgt von einem 0,7-Millimeter-Kugelbohrer.

Führen Sie die Elektroden-Kelo-Gramm-Schrauben mit einem geschlitzten Handschraubendreher in die Löcher ein. Fahren Sie sie in etwa vier bis fünf Umdrehungen, um die gewünschte Tiefe zu erreichen. Halten Sie die Führungskanülen mit einer stereotaktischen Kanüle fest und befestigen Sie sie dann mit Acrylzement am Schädel und an den Ankern. Um die Durchgängigkeit zu erhalten, sollte jede Führungskanüle vom Zeitpunkt der Operation bis zum Zeitpunkt des Experimentierens eine Dummy-Kanüle oder ein Stilett enthalten.

Sobald EEGs und Führungskanülen im Schädel positioniert sind, kleben Sie sie mit einer dünnen Schicht Zahnacrylzement zusammen. Nachdem der Zement ausgehärtet ist, positionieren Sie den Kunststoffstecker über dem getrockneten Zementhügel, der an den Enden der Drähte verkauft wird, die von den EEG-Leitungen ausgehen, zu den Kontakten am Kunststoffstecker, falls der Draht in Zement führt. Ziehen Sie dann die Elektromyogrammdrähte durch die Kernmuskulatur, indem Sie sie in den Lauf einer 21-Gauge-Nadel schieben.

Durch den Muskel gestochen, bindet ein doppelter Chirurgenknoten, eine Fünf-Null-Nylonnaht um diese Drähte, gerade distal bis zu der Stelle, an der sie austreten, die Muskelnaht, die wieder zusammen, die Haut, die zurückgezogen wurde, um mit einzelnen unterbrochenen Chirurgenknoten auf das Muskelgewebe zuzugreifen, mit einer umgekehrt schneidenden P-, Drei-Nadel- und Fünf-Null-Nylonnaht. Sobald die mc-Stimuluseinheit programmiert ist, können Sie sie als eigenständigen Signalgenerator als binäres Ein-Aus-Signal mit fünf Volt ausführen. Verbinden Sie die mc-Stimuluseinheit mit BNC-Anschlüssen mit dem TTL-fähigen Netzteil des Lasers.

Verbinden Sie das Laser-Netzteil über ein Flachbandkabel mit dem Laser. Verbinden Sie den Laser auch mit dem FC-Stecker des ursprünglichen Glasfaser-Patchkabels. Verbinden Sie das ursprüngliche Glasfaserkabel mit der Drehdurchführung.

Kommutator Die faseroptische Drehdurchführung dient als Kommutator. Während sich das Tier in seinem Käfig bewegt, dreht sich das Drehgelenk, um einen Bruch der Glasfaserkabel aufgrund des Drehmoments zu verhindern. Befestigen Sie den Kommutator mit Kunststoffkabelbindern an einem Metallständer, der über dem zylindrischen Käfig platziert ist, in dem das Tier untergebracht ist.

Halten Sie die Maus fest, indem Sie sie mit einer Hand unter einer hohlen Handfläche feststecken. Richten Sie den Kopf zwischen Mittel- und Zeigefinger des Experimentators aus. Befreien Sie nun die Führungskanüle mit einer sterilen 25-Gauge-Nadel von Schmutz, Schmutz.

Führen Sie dann das Glasfaserkabel von Hand ein und befestigen Sie es mit einem Gewindeschraubverschluss an der Glasfaserführungskanüle. Kontrollieren Sie die Einführtiefe des Glasfaserkabels im Gehirn durch einen Nahtknoten, der in einem festen Abstand zum flachen gespaltenen Ende an das Glasfaserkabel gebunden ist. Der Sensor wird mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gleichgesetzt und schrittweise drei Konzentrationen von L-Laktat ausgesetzt.

Führen Sie den vorkalibrierten Sensor gemäß den Herstellerprotokollen in die am Schädel montierte Laktatführungskanüle ein, und zwar auf die gleiche Weise wie beim Einführverfahren des Glasfaserkabels. Verbinden Sie den Laktatsensor mit bipolaren Steckverbindern mit dem Vorverstärker des Pinnacle 8, 400 Biosensors. Befestigen Sie dann diesen Vorverstärker an dem achtpoligen Stecker an der chirurgisch implantierten Kopfhalterung.

Bevor Sie Daten sammeln, verwenden Sie den Laserintensitätsregler, um die Intensität des optogenetischen Stimulus einzustellen. Die Amplitude der EEG-Reaktion variiert von Tier zu Tier aufgrund von Faktoren, die nicht systematisch untersucht wurden. Es ist daher notwendig, die Intensität des optogenetischen Stimulus anzupassen und zu überprüfen, ob die EEG-Antwort angemessen ist, wenn die gewünschte Reaktion erreicht wird.

Sammeln Sie Daten mit dem Pinnacle 8, 400 System mit dem Neuro-Score. Eine SEIA-Schnittstelle klassifiziert die Schlafzustände durch visuelle Inspektion des EEG- und EMG-Datenprozesses. Die Daten in Zehn-Sekunden-Epochen als Wachzustand ohne schnelle Augenbewegung, Schlaf oder schneller Augenbewegungsschlaf basieren auf dem EEG und EMG.

Diese optogenetische Stimuluskonfiguration des Biosensors zeigt die chirurgisch implantierten EEG-Elektroden, den Laktatsensor und die Kanüle für die optogenetische Stimulation. In Ermangelung einer optogenetischen Stimulation schlief diese Maus spontan ein. Die Wachzustandsübergänge während der E-E-G-E-M-G und der zerebralen Laktatkonzentration wurden kontinuierlich wach und die beiden Subtypen des Schlafs überwacht.

Rapid Eye Movement und Non Rapid Eye Movement werden auf Basis des EEG und des EMG definiert. Interessanterweise steigt der Strom des Laktat-Biosensors in Abhängigkeit vom EEG mit niedriger Amplitude an und sinkt in Abhängigkeit vom EEG mit hoher Amplitude. Beide Kanäle des EEGs reagieren auf optogenetische Reize, die im frontalen Kortex abgegeben werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Maus chirurgisch implantieren, um gleichzeitig das Elektroenzephalogramm, das Elektromyogramm und die Laktatkonzentration im Gehirn zu manipulieren und zu messen. Einmal gemeistert, kann diese Operationstechnik in 90 bis 120 Minuten richtig durchgeführt werden. Denken Sie daran, die Atmung des Tieres ständig zu überwachen, um die Narkosetiefe zu messen.

Wenn das Tier seltener als einmal alle vier bis fünf Sekunden atmet, kann die Anästhesie zu tief sein. Wenn das Tier häufiger als einmal alle zwei Sekunden atmet, kann die Anästhesie zu leicht sein. Denken Sie daran, die entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen zu treffen, wenn Sie das Gasanästhetikum Fluor verwenden.

Sorgen Sie für eine ausreichende Belüftung im Operationssaal, um Ihre Netzhaut vor dem Laser zu schützen, der für die optogenetische Stimulation verwendet wird. Tragen Sie entweder eine Schutzbrille oder schließen Sie das Tier in einen lichtdichten Schrank ein. Sie sollten üben, wie Sie den Laktat-Biosensor und das Glasfaserkabel in eine vollständig wache Maus

Mäuse halten sich nicht an diese Verfahren und müssen immobilisiert werden. Die Fixierung darf jedoch nicht so stark sein, dass sie das Tier verletzt oder die Atmung verhindert.