Orthotopen Aortic Transplantation in Mäuse für das Studium der Vascular Disease

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine abdominale Aorta einer Spendermaus in eine allogene Empfängermas zu transplantieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Aorta der Spendermaus entnommen wird. Anschließend wird die Transplantationsstelle im Empfängertier angelegt.

Die native Aorta des Empfängertieres wird anschließend präpariert und durchtrennt. Im letzten Schritt wird die Spenderaorta mittels zweier end-zu-end-vaskulärer Anastomosen implantiert. Letztendlich kann dieses Verfahren verwendet werden, um die Entstehung vaskulärer Erkrankungen nach Transplantation in allogenen Stammkombinationen zu untersuchen.

Der Vorteil dieser Methode gegenüber beispielsweise der heterotopen Herztransplantation liegt darin, dass die morphometrische Analyse einfacher durchzuführen ist, da die Gefäße eine einheitliche Größe aufweisen. Außerdem ist das Gefäß nicht von Parenchymgewebe umgeben, das von zellulären Infiltraten und anderen Faktoren umgeben sein kann, die die Analyse der gewonnenen Daten erschweren. Die Anwendung dieser Technik kann besonders nützlich sein, um die an der vaskulären Transplantat-Erkrankung beteiligten Mechanismen zu veranschaulichen, einem hartnäckigen Problem in der klinischen Transplantationsmedizin beim Menschen.

Um die Auswirkungen von Stress zu minimieren und die Energiereserven zu maximieren, sollten die Tiere mindestens 72 Stunden vor der Operation im Vivarium gehalten werden. Am Tag der Operation stellen Sie eine metallene Operationsplatte auf eine Heizplatte, die auf 35 bis 38 Grad Celsius eingestellt ist. Entfernen Sie anschließend nach der Anästhetisierung das Haar am ventralen Bauchbereich des Tieres.

Befestigen Sie das Tier mit Labor-Klebeband in ausgestreckter Position auf dem Operationstisch und desinfizieren Sie den gesamten rasierten Bereich des Tieres dreimal abwechselnd mit einem Desinfektionsmittel und anschließend mit Ethanol unter Verwendung steriler Schere. Anschließend schneiden Sie durch die Bauchwand, um die Bauchorgane freizulegen. Verwenden Sie dann einen sterilen Wattestäbchen, um die Organe zur Seite zu schieben und auf ein Stück sterile Gaze zu legen, das mit warmer Kochsalzlösung angefeuchtet ist, wodurch die großen Bauchgefäße freigelegt werden.

Nun die Bauchaorta sehr vorsichtig stumpf vom umgebenden Gewebe, einschließlich der unteren Hohlvene, ablösen und anschließend die Arteria lumbalis vorsichtig anheben und koagulieren. Der Bereich der Aorta, der präpariert werden soll, befindet sich unterhalb der Nierengefäße und oberhalb der Gabelung der Aorta in die A. femoralis. Nach der Identifizierung des Bereichs eine Naht direkt unterhalb der Nierenarterien und eine weitere direkt oberhalb der Aortengabelung anlegen.

Anschließend die Aorta mit einer Schere durchtrennen und dann vorsichtig ein Ende des Gefäßes halten, wobei hepatisierte Kochsalzlösung so eingetropft wird, dass sie durch Schwerkraft durch das Gefäß fließt. Danach die Gefäßenden so wenig wie möglich manipulieren. Die Transplantat entnehmen und sie unmittelbar in einen Behälter mit eiskalter Kochsalzlösung legen.

Nach der Verabreichung von Anästhesie und Analgetika an das Empfängertier wie eben gezeigt den ventralen Bauch rasieren. Gentamicin-Ophthalmika-Salbe auf die Augen auftragen, um Austrocknung zu verhindern, und anschließend den Bauch wie zuvor demonstriert desinfizieren, um eine ausreichende Keimfreiheit sicherzustellen. Anschließend einen medianen Schnitt durch die Haut und die Bauchwand in Stufen ausführen.

Danach einen Spreader einsetzen, um den Bauchschnitt geöffnet zu halten, wobei die Schraubvorrichtung in Richtung des Hinterendes des Tieres zeigt, um die Hauptmasse der Klammer aus dem Weg zu halten. Anschließend ein mit Salzlösung getränktes steriles Tupfer über die Därme legen. Dann das Tupfer vorsichtig mit einem Finger an Ort und Stelle halten.

Führen Sie einen sterilen Wattetupfer unter die Därme ein, und heben Sie diese vorsichtig an, sodass die Därme auf der Gaze liegen. Legen Sie ein weiteres Stück sterile Gaze auf die Därme und befeuchten Sie es mit Kochsalzlösung. Entfernen Sie nach vorsichtiger Abtrennung jeglichen Fettgewebes, das die ATA und die Vena cava inferior bedeckt, mit einer Pinzette die infrarenale Aorta vorsichtig von der Vena cava inferior.

Reinigen Sie nun einen Bereich, der groß genug ist, um Platz für zwei Klammern zu bieten, und verfügen Sie über ausreichend Gefäße, sodass nach der Teilung genügend Gefäßmaterial vorhanden ist, an das das Transplantat genäht werden kann. Beachten Sie, dass der schwarze Faden verwendet werden kann, um das Gewicht entlang des Gefäßes zu ertasten. Suchen Sie beim Präparieren nach Gefäßästen und koagulieren Sie die Äste bei Bedarf mit einem Niedertemperatur-Koagulationsgerät.

Als Nächstes wird eine vaskuläre Klemme direkt unterhalb der Nierenarterie und eine weitere vaskuläre Klemme direkt oberhalb der Bifurkation platziert. Anschließend wird die Aorta durchtrennt. In diesem Fall erfolgt der Schnitt näher an der Bifurkation, da ein Seitenast nahe der Mitte zwischen den beiden Klammern kauterisiert wurde, wodurch dieser Bereich als Porensite für die Anastomose dient. Die Enden der Aorta ziehen sich in der Regel zurück und hinterlassen einen Spalt von etwa fünf Millimetern.

Überprüfen Sie die Blutstillung. Wenn die Klammern korrekt funktionieren, sollte nach dem Durchtrennen nur eine geringe Menge Blut austreten. Spülen Sie anschließend die durchtrennten Enden der Aorta mit heparinisiertem Kochsalzlösung aus und tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab.

Nun befestigen Sie das Transplantat mit jeweils drei diskontinuierlichen Nähten an jedem Ende. Danach nähen Sie jeweils eine Seite der Anastomose an beiden Enden und vervollständigen Sie die Naht mit sieben bis acht diskontinuierlichen Einzelnähten. Falls eine kontinuierliche Naht bevorzugt wird, achten Sie darauf, dass die Gefäßwände entspannt bleiben und keine Stenose an der Anastomose entsteht.

Entfernen Sie nun vorsichtig die Klemme am kranialen Ende der Aorta und prüfen Sie die Nahtstellen auf Undichtigkeiten. Drücken Sie anschließend sanft mit einem angefeuchteten Wattestäbchen auf die Aorta oberhalb der Anastomosestelle und entfernen Sie die zweite Klemme. Drücken und lösen Sie die Aorta mehrmals leicht, um zu überprüfen, ob das Gefäß durchgängig ist. Die Transplantatperfusion setzt unmittelbar ein, und ein Puls sollte sichtbar sein.

Entfernen Sie nun die Mullbinde, die die Därme bedeckt, und bringen Sie diese unter Beibehaltung ihrer normalen anatomischen Ausrichtung und unter Vermeidung von Verdrehungen wieder in die richtige Lage zurück. Schließen Sie die Muskelschicht mit einer Vicryl-Naht der Stärke 5-0 und anschließend die Haut mit einer Proline-Naht der Stärke 5-0 oder 6-0. Behandeln Sie die Maus subkutan mit Carprofen, um die Analgesie vor Beendigung der Anästhesie zu verstärken, und verabreichen Sie der Maus danach 0,5 bis 0,8 Milliliter physiologische Kochsalzlösung auf dem gleichen Weg.

Schließlich das Tier in einen beheizten Käfig zur Erholung bringen und sorgfältig überwachen. 12 und 24 Stunden nach der Operation Buprenorphin bzw. Carprofen subkutan verabreichen. Diese erste Abbildung zeigt ein aortales Transplantat.

Beachten Sie die Nähten, die hier durch die weißen Pfeile gekennzeichnet sind. Dargestellt ist ein typisches Experiment, bei dem die Überlebensrate der Empfänger über einen Zeitraum von 56 Tagen verfolgt wurde. Die Kontrollgruppe bestand aus Wildtyp-C57BL/6xFVB-Empfängermäusen, die mit Dünndarmaorten transplantiert wurden.

Die Versuchsgruppe bestand aus C57BL/6xFVB-Empfängern, die einen Defekt in der Expression von Häm-Oxygenase-1 aufwiesen. Dieser Knockout führte innerhalb von 24 Stunden zur Thrombose der Transplantate. Bemerkenswerterweise resultierte dies im Tod aller Empfänger.

Diese letzte Abbildung zeigt die Echomessungen der Vena cava inferior und der Bauchaorta bei einem gesunden Tier und bei einem Transplantatempfänger. Beachten Sie, dass das Transplantat durchgängig ist und im Aussehen der nicht-transplantierten Aorta ähnelt. Wie Sie gesehen haben, sind die Gewebe sehr empfindlich und klein, weshalb Sie im Hinterkopf behalten sollten, dass dieses Verfahren auf jeden Fall eine erworbene Fähigkeit darstellt und daher viel Übung erfordert, bevor es erfolgreich und routinemäßig durchgeführt werden kann, sobald es einmal beherrscht wird.

Diese Technik kann innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.