Name: Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Erfahren Sie, wie Gensignale in Haarfollikeln untersucht werden: Isolation dermaler und epidermaler Zellen von neugeborenen Mäusen, Lentivirus-Infektion und Transplantation auf Nacktmäuse. Diese Methode ermöglicht schnelle funktionelle Analysen.

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Diese Arbeit wurde vom NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) und NIH Zuschüsse AR052785 und AR046786 (AEO und W.-MW) unterstützt.

Ein. Bereiten 0 bis 2 Tage alten Neugeborenen Mäuse für Haut Dissection <ol><li> Euthanize Maus Jungtieren mit einem CO 2-Kammer für mindestens 20 min. Lassen Welpen auf Eis bis zu einer Stunde, bis Dissektion. P0-P2-Mäuse sind hoch als Zellen von älteren Mäusen hergestellt empfohlenen Vorläuferzellen Kapazität reduziert, dass die Ergebnisse im unteren Pfropfausbeuten. Bereiten Sie ein Gericht aus 70% Ethanol (für Schritt 1,3) und drei Gerichte der Waschlösung (für Schritt 3), wenn Sie bereit für die Haut Dissektion durchzuführen. Auftauen Dispase-Lösung und lassen Sie es bei 4 ° C. Cervical verrücken Welpen nach CO 2 Überbelichtung Euthanasie zu gewährleisten. </li><li> Zeigen eingeschläfert Welpen in einer Kulturschale auf Eis und Transfer zu einem sterilen Werkbank. </li><li> Waschen Welpen durch kurzes Eintauchen in 70% Ethanol und Ort auf sterile Kulturschale. </li></ol> 2. Dissect Mäusehaut <ol><li> Schneiden Sie jedes Glied und Schwanz an der Basis des Rumpfes mit einer sterilen Schere. </li><li> Fassen Sie den Körper fest zwischen einem Paar von curved Zange und einen Einschnitt entlang der dorsalen Haut von Kopf bis Schwanz mit einem Skalpell ohne Durchdringung der zugrunde liegenden Faszie. </li><li> Sie vorsichtig die Haut von der Mittellinie entfernt der Maus. </li><li> Fassen Sie den exponierten Maus fest mit der langen Seite der gekrümmten Pinzette und fügen Sie ein weiteres Paar von gekrümmten Pinzette unter die Haut am hinteren Ende der Maus und ziehen Haut über Hüfte in Richtung der ventralen Hälfte der Maus. </li><li> Sie vorsichtig die Haut völlig aus der Maus in einer geschmeidigen Bewegung und entsorgen Sie die Karkasse. </li></ol> 3. Waschen der Haut und inkubieren mit Dispase-Lösung <ol><li> Zeigen die Haut in der ersten Teller der Waschlösung mit Dermis-Seite nach unten. Verteilt Haut aus und bewegen Sie mit einer Pinzette. Lassen Sie die Haut in der ersten Schüssel Waschlösung während sezieren die nächste Haut. </li><li> Nach dem Platzieren des nächsten seziert Haut in der ersten Schüssel Waschlösung, übertragen Sie die vorherige Haut an die zweite Schüssel Waschlösung. Halten Skins in the zweiten Waschlösung bis alle Skins gesammelt werden. Übertragen Sie alle der Häute der letzten Wäsche, kurz schütteln. </li><li> 10 ml eiskaltem Dispase in eine sterile 10 cm Kulturschale. Übertragen Haut an die Dispase-Lösung und glätten die Haut Dermis nach unten. </li><li> Float Haut für 8-16 h bei 4 ° C (Alternative: 1 Stunde bei 37 ° C). </li></ol> 4. Separate Dermis und Epidermis <ol><li> Übertragen Haut zu einem neuen sterilen Kulturschale und glätten die Haut Dermis nach unten. Vorsichtig halten die Dermis von einer Ecke mit einem Skalpell. </li><li> Fassen Sie die Epidermis mit einer Pinzette langsam und lösen sich von der Dermis. Epidermis sollte Schale weg als ein Stück. Die Epidermis wird weiß und dünn und die Dermis sollte bräunlich, dicker und gallertartig. </li><li> Trennen Sie die beiden Gewebe in separate sterile Kulturschalen. <ol class="lalpha"><li> Um einen dermal spezifischen Gen knockdown / Überexpression Graft machen, nehmen Dermis und Hackfleisch in sehr kleine Stücke mit two Skalpelle. Entsorgen Epidermis. Am Tag der Infektion (Schritt 7), sezieren weiteren Satz von Maus Häute, um frische, unbehandelte Epidermiszellen vorzubereiten, mit lentiviralen-infizierten dermalen Zellen zu kombinieren. </li><li> Um eine epidermale spezifischen Gen knockdown / Überexpression Graft machen, schneiden jedes Epidermis in 6 bis 8 kleinere Stücke. Entsorgen Dermis. Am Tag der Infektion (Schritt 7), sezieren weiteren Satz von Maus Häute, um frische, unbehandelte dermalen Zellen zu erstellen, um lentiviralen-infizierten Epidermiszellen zu kombinieren. </li></ol></li></ol> 5. Distanzieren Primäre Maus Dermal Cells (mDCs) aus zerkleinertem Gewebe <ol><li> Distanzieren mDCs durch Inkubation dermal Stücke mit frisch zubereiteten Collagenase-Lösung bei 37 ° C für 1 Stunde. Verwenden Sie 10 ml Collagenase-Lösung per Mausklick Welpen. </li><li> Vorsichtig mischen Lösung Dermis alle 10 min. Überprüfen des Ausmaßes der Dissoziation unter einem Mikroskop; die verdaute Zellsuspension sollte meist einzelne Zellen sein. Die Lösung sollte klar bis trüb wie der Wandeldermalen Zellen dissoziiert von der Dermis. </li><li> Hinzufügen FBS auf Collagenase-Lösung enthaltenden Dermis zu einer 10% Endvolumen um die Aktivität der Kollagenase reduzieren. </li><li> Passieren die Zellsuspension durch ein 70 um Zellsieb in ein neues 50 ml Röhrchen zu großen Klumpen und unverdauten ganze Follikel zu entfernen. 10 ml DMEM/10% FBS pro 30 ml des Durchstromkanals weiter verdünnen Kollagenase. </li><li> Enthaltenden Zentrifugationsröhrchen verdaut Dermis bei 30 × g über einer Tischzentrifuge für 5 min zur weiteren Entfernung ganze Follikel. </li><li> Vorsichtig den Überstand in ein neues 50 ml Tube. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg auf einer Tischzentrifuge für 5 min. </li><li> Resuspendieren Zellen mit DMEM/10% FBS (1 ml pro Jungtier) und zählen Zellen. Platte Zellen mit Amniomax C-100 Medien für Infektionen (Schritt 7), oder mit Lentivirus-infizierten KC zum Pfropfen (Schritt 9) zu kombinieren. Typische Ausbeute beträgt 20 x 10 6 Zellen pro Welpe. </li></ol> 6. Distanzieren Primäre Keratinozytens (KC) aus zerkleinertem Gewebe <ol><li> Dissoziieren KC durch Inkubieren epidermalen Stücke mit frisch aufgetauten 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 15 min. Verwenden 7 ml Trypsin-EDTA pro Maus Welpen. </li><li> Vorsichtig schwenken Lösung Epidermis alle 5 min. </li><li> Hinzufügen gleichen Volumen Neutralisierungslösung auf Trypsin-EDTA enthaltende Epidermis die Aktivität von Trypsin zu reduzieren. </li><li> Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg auf einer Tischzentrifuge für 5 min. Verbleibende unverdauten Gewebe sollte auf schweben. </li><li> Vorsichtig abgießen meisten der Überstand mit unverdauten Gewebe. Entfernen Sie verbleibende Überstand mit einer 10 ml Pipette ohne störende Zellpellet. Zellpellet mit PBS. Bei KCs nicht pelletiert vollständig, giesst die meisten der Überstand und wiederholen Zentrifugieren bis die meisten der Zellen pelletiert werden. </li><li> Stamm Zellsuspension durch 70 um Zellsieb in ein neues Röhrchen zum restlichen Gewebe oder Klumpen zu entfernen. </li><li> Pellet Zellen durch Zentrifugierenbei 200 xg auf einer Tischzentrifuge für 5 min. </li><li> Die Zellen in CnT-07 Medien oder PBS (1 ml pro Jungtier) und Anzahl Zellen. Verwenden CnT-07 für die Beschichtung Zellen für eine Infektion (Schritt 7), verwenden PBS mit Lentivirus-infizierten mDCs zum Pfropfen (Schritt 9) zu kombinieren. Typische Ausbeute 3-10 x 10 6 Zellen pro Welpe. </li></ol> 7. Infect Primärzellen mit Lentivirus enthaltend shRNA oder cDNA Am Tag der Infektion sezieren weiteren Satz von Maus Häute, um frische, unbehandelte primäre KCs oder mDCs mit virusinfizierten Zellen am Tag der Operation (Schritt 9) verbinden vorzubereiten. <ol><li><ol class="lalpha"><li> Für mDCs, Platte 4 x 10 6 mDCs pro 10-cm-Platte mit Amniomax-C100 Medien und bei 37 ° C + 5% CO 2 für den nächsten Tag Infektion bei 50% Zelldichte. Regel 3-4 Platten mDCs werden verwendet, um ein Transplantat zu erzeugen, und eine Gesamtmenge von 10 bis 12 Platten erforderlich sind, um drei Transplantaten in einem Experiment zu erzeugen. Alternativ lassen mDCs anlagern und ausbreiten foder ein Minimum von 2 Stunden bei 37 ° C + 5% CO 2 und führen Infektion am gleichen Tag von Zellen Plattieren. mDCs haben Fibroblasten-ähnliche Morphologie. </li><li> Für KC, Platte 12 x 10 6 KC pro 10-cm-Platte mit CNT-07 Medien und bei 37 ° C + 5% CO 2 für den nächsten Tag Infektion. Alternativ lassen KC befestigen und für ein Minimum von 2 Stunden verteilt auf 37 ° C + 5% CO 2 und führen Infektion am gleichen Tag. Regel 3-4 Platten KC werden verwendet, um ein Transplantat zu generieren. Eine Gesamtzahl von 10-12 Platten erforderlich sind, um drei Transplantaten für einen Versuch zu erzeugen. KCs haben Kopfsteinpflaster Morphologie. </li></ol></li><li> Vorinkubiert Zellen für 5-10 min mit 8 ug / ml Polybren Lösung bei 37 ° C + 5% CO 2. </li><li> Exchange-Medien und fügen Lentivirus + 8 pg / ml Polybren Solution. Lentivirale Titer variieren je nach der verwendeten Konstruktion und sollte vor der Infektion bestimmt. </li><li> Zentrifuge die Platten bei 200 × g bei einer Tischzentrifuge für 1 Stunde bei 32 °, C, Zellen mit Lentivirus infizieren. </li><li> Entfernen Lentivirus-haltigen Medien und frisches Medien. Für KC, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS vor der Zugabe wieder frisches Medium. Normalerweise infizierten Zellen erholen Nacht bei 37 ° C + 5% CO 2. Alternativ lassen Sie mindestens zwei Stunden der Erholung bei 37 ° C + 5% CO 2 vor TRYPSINIERUNGSFLASCHEN die Zellen für Transplantationen. Weiter zur Kultur ein kleiner Teil der infizierten Zellen für eine Infektion Effizienz zu überprüfen, wie im Repräsentative Ergebnisse beschrieben. </li></ol> 8. Bereiten infizierten Zellen für die Transplantation <ol><li> Isolieren frische primäre mDCs oder KCs von der Haut über die Schritte 4-6. Die Zellen in eiskaltem sterilen PBS. Zählen von Zellen. </li><li><ol class="lalpha"><li> Für dermale spezifischen Gens Knockdown / Überexpression Transplantat, dissoziieren infizierten mDCs von Platten unter Verwendung von 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 8 min. </li><li> Für epidermalen spezifischen Gen knockdown / Überexpression Transplantat, distanzieren infizierten KC aus Platten using 0,125% Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 15 min. </li></ol></li><li> Neutralisieren Trypsinaktivität Verwendung von DMEM + 10% FBS (mDCs) oder Neutralisationslösung (KC). Übertragung der Zellen auf eine trypsinisierte 50 ml Röhre. </li><li> Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg auf einer Tischzentrifuge für 5 min. </li><li> Die Zellen in eiskaltem sterilen PBS. Zählen von Zellen. </li><li> Vereinen die Virus-infizierten Zellen mit dem frisch hergestellten unbehandelten Gegenstück Zelltyp. Zum einen Pfropf, kombinieren 7-10 x 10 6 mDCs mit 7-10 x 10 6 KCs in eiskaltem sterilen PBS und Pellet die Zelle Aufschlämmung in einer Tischzentrifuge bei 4 ° C. Die Zellen in 50 -100 ul eiskaltem sterilen PBS. Halten Zellen auf Eis, bis nu / nu Maus Kammern bereit sind. </li></ol> 9. Erstellen Wound Bed and Fix Kammer auf den Rücken der nu / nu Maus Ein Tag vor der Transplantation, sterilisieren chirurgische Instrumente mit Autoklav und steril Silizium-Kammern, die durch Eintauchen in 70% Ethanol. Ersetzen Sie die 70% ethanol mit sterilem PBS, bevor Sie die Kammern. <ol><li> Anesthetize nu / nu Maus (7-12 Wochen alte Weibchen) mit Ketamin (8 mg / ml) / Xylazin (1,6 mg / ml) durch intraperitoneale Injektion (100 μl/10 g Körpergewicht) oder andere bevorzugte Methode. Bewerben Auge Schmiermittel. Ort Heizkissen unter Maus. </li><li> Desinfizieren Nacktmaus Rückenhaut mit Jod und sauber mit Alkoholtupfer. </li><li> Fügen Sie 1-3 Tropfen 0,25% Bupivacain zur Inzisionsstelle topisch. Drücken Sie den Nacktmaus Rückenhaut an der Basis des Halses mit einer Pinzette. </li><li> Schneiden Sie ein kleines rundes Loch (ca. 1 cm Durchmesser) in Hautfalte mit einer sterilen Schere. </li><li> Zeigen sterile Kammer auf Wundbett und decken Kammer Kanten mit der umgebenden Haut. </li><li> Sichere Kammer einrastet mit Nähten entlang Kammer Kanten (6 Maschen pro Kammer), wie in 2A gezeigt. </li><li> Wenn Kammern bereit sind, schwenken Zellaufschlämmung und erarbeiten in 23-Gauge-Nadel an 1 ml Spritze. Wenn Zellaufschlämmung hat an der Unterseite kondensiert, sanftresuspendieren mit 1 ml Pipettenspitze vor dem Zeichnen in die Nadel. </li><li> Puncture Kammer mit Nadel und langsam tropft Zellen auf Wunde. </li><li> Ort Mäuse in sauberen, autoklaviert Käfigen. House 2 Mäuse pro Käfig und fügen Antibiotika und Tylenol (3 mg / ml) zu Trinkwasser. Nach unseren Erfahrungen wurden zwei weibliche Mäuse pro Käfig keine schädlichen Trauma an der Kammer, Pfropf oder Tiere resultierten. </li><li> Zeigen Erwärmung pad weniger als die Hälfte des Käfigs und beobachten Mäuse, bis Narkose nachlässt. </li></ol> 10. Entfernen Kammer nach 7-9 Tagen <ol><li> Anesthetize chambered nu / nu-Maus, wie in Schritt 9.1. Bewerben Auge Schmiermittel. </li><li> Desinfizieren Sie die Haut rund Kammer mit Jod und sauber mit Alkoholtupfer. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig Stiche und entfernen Sie aus der Kammer. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Kammer von Maus. Wenn neue skin graft-Sticks in die Kammer, heben Teil der Kammer und sanft separaten Transplantat von der Kammer mit einer Pinzette. Halten Transplantat nach unten während des Entfernens der Kammer. Graft sollte look matt und undurchsichtig wie in Abbildung 2B. </li><li> Anwenden einer nicht-haftenden Unterlage mit einem dünnen Film von Antibiotika auf die offene Wunde und Nahtmaterial einrastet (2 Stiche). </li><li> Wickeln Verband um Maus, um das Pad zu sichern und schützen die Wunde. Naht Verband einrastet. </li><li> Die Silizium-Kammern werden durch Auswaschen mit milder Seife gereinigt und mit entionisiertem Wasser gründlich gespült. Weichen Sie die Kammern in 70% Ethanol über Nacht an der Luft trocknen und lagern. </li></ol> 11. Untersuchen Mouse for Hair Growth <ol><li> Entfernen Bandagen und Pad nach 3 Tagen der Kammer entfernen. Graft sollte trocken sein und undurchsichtig braun gefärbt. </li><li> Überprüfen Mäusen regelmäßig für das Haarwachstum. Die Haare sollten anfangen, nach 16 Tagen nach der Transplantation zu zeigen. </li></ol> Vorgehensweise Gliederung Day 1 (2-3 Std.): Opfere neugeborenen Welpen, Haut entfernen, und lassen auf Dispase bei 4 ° C über Nacht. Day 2 (2-3 Std.): Isolieren primären Zellen von Haut undPlatte bei empfohlene Zelldichte. 3. Tag (3-4 Stunden): Infect Zellen mit Lentivirus. Entfernen Sie die Haut von einer anderen Gruppe von neugeborenen Welpen und lassen auf Dispase bei 4 ° C über Nacht. 4. Tag (6-8 Stunden): Isolieren primären Zellen von Haut, zählen, und lassen Sie auf dem Eis. Recover Lentivirus-infizierten Zellen durch Trypsinisierung und Zentrifugation, zählen, und kombinieren 7-10 x 10 6 Hautzellen und Keratinozyten in 50-100 ul PBS pro Graft. Erstellen Wundbett auf Maus legen Kammer und gelten Zellgemisch ins Bett gewickelt. Alternative Vorgehensweise Outlines Alternative Vorgehensweise Konturen wird das Verfahren von vier auf drei Tage zu verkürzen. <ol><li> Kombinieren Tag 1 und Tag 2, indem man mit der Maus Skins in Dispase bei 37 ° C für eine Stunde (geschätzte 5-7 h). </li><li> Kombinieren Tag 2 und Tag 3 durch Infizieren von Zellen mit Lentivirus nach dem Plattieren Zellen für zwei Stunden (geschätzte 5-7 h). </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Haar Rekonstitution Assays bieten eine einzigartige Organregeneration Modell zur Untersuchung des Mechanismus von de novo Haarfollikelbildung. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Kammer Haar Assay nützlich zum Bestimmen der Genfunktion in Haarfollikelbildung. Unserem Assay basiert auf der Rekonstitution Haaren berichtet Kammer Assay 5, 6,11, die wir modifiziert, um eine Technik zur Expression lentiviralen Genüberexpression oder Knockdown entweder in den dermalen oder epidermalen Zelltypen zu erreichen einzuführen basiert. Unserem Assay stellt eine schnelle Alternative zum Gewebe-spezifische genetische Knockout Erzeugen. Dieser Test ermöglicht es uns, die Funktion von Genen in Haarfollikelbildung in weniger als drei Wochen nach Infektion Primärzellen mit Lentivirus zu pfropfen Sammlung zeigen. Unserem Assay erweitert werden, um genetische Wechselwirkungen unter Verwendung Kombination shRNA / cDNA Lieferung von Lentivirus in einem Zelltyp 12 angesprochen werden, sowie ermöglicht die Untersuchung der Signalisierung zwischen der dermalen und epidermalen Zellen typ.es. Unser Haar Assay wird am besten zum Erfassen starken Gewinn oder Verlust-Funktionsverlust-Phänotypen in Haarfollikel Regeneration geeignet, während feine Fehlstellen schwerer zu beobachten sind. Wir haben erfolgreich dermal spezifische Gen-Funktion von wenigen Genen mit unseren Haarregeneration Assay 1,12 demonstriert. Bezogen auf das GFP-Markers aus Lentivirus-Vektor, shRNA 10 coexprimierten zeigten wir, dass die shRNA exprimierenden dermalen Zellen Spenders in den regenerierten Haargrafts anhielt. GFP-positive Zellen waren in der dermalen Papille (DP) der regenerierten Haarfollikel (Abbildung 3). Die DP Zellen wahrscheinlich bestand aus verschiedenen Ebenen der Gen-Knockdown als Zellen exprimiert unterschiedlichem GFP, damit die beobachtete Haarfollikel Phänotyp eine Reihe von genetischen hypomorph auf null war. Eine Verbesserung für diesen Test wird es sein, eine schnelle und effiziente Auswahl für die hohen shRNA exprimierenden Zellen vor Graftin etabliereng wie mittels FACS eine starke GFP-exprimierenden Zellen zu reinigen. Eine Alternative ist die Mutante oder konditionale Knockout-Zellen in diesem Assay 9 ersetzen. Auf der anderen Seite, ist eine Kultur, das DP Zellfunktion bewahren kann sehr nützlich als DP Potenz allmählich verloren geht, sobald die primäre dermale Zellen passagiert werden. Potenzielle Kultur Systemen umfassen die Verwendung von Biomaterialien aus künstlichen Nischen-oder Aggregation Kulturen 2,7,8,13 abgeleitet. Eine weitere Verbesserung wird es sein, eine zuverlässige Epidermiszelle Einfriermethode mit einem hohen Zellwiederfindungsrate da dies die Verwendung des zweiten Satzes der Maus Welpen (Schritt 7) zu reduzieren, um frische Keratinozyten in dermal-spezifischen Verlust-oder generieren generieren gain-of- Funktions-Studien. Diese Kammer Haar Assay erzeugt Haarfollikel Dichte und Qualität ähnlich wie bei normalen Haut von Mäusen, obwohl das Haarwachstum ist etwas weniger synchronisiert und Follikel Orientierung ist eher zufällig. Ein paar Einschränkungen der Regeneration der Haare genetische Tests einschließliche das Erfordernis der großen Menge von Lentivirus und Zellzahlen, und es ist sehr arbeitsintensiv in Bezug auf chirurgische Verfahren, wenn auf andere Formen von Haaren Rekonstitution Assays wie dem Patch und Klappe Assays 3,4,14 verglichen. Allerdings ist die Qualität der Haarfollikel und Timeline, um das Haarwachstum zu erkennen besser als andere Assays 4. Unsere gezielte Regeneration der Haare Assay bietet einen schnellen und bequemen Begleiter zu bestehenden genetischen Modelle.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Cnt-07 </td><td> Zelle N Tec </td><td> CnT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMax-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMax-C100 Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase Typ 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107.689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Gewebekulturschale </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Präparierschere </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Zange </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> gewölbt </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex Versorgung </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> Größe Nr. 10 </td></tr><tr><td> 70 um Zell stainer </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49D </td><td></td></tr><tr><td> Alkoholtupfer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> 23-Gauge-Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Eye Schmierstoff </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providon-Jod Tupfer </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silicon Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Nahtmaterial </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Flexible Bandage </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Nichtadhärente Dressing </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materialien </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Waschlösung PBS 500 ug / ml Penicillin / Streptomycin 12,5 pg / ml Fungizone 100 ug / ml Gentamycin Dispase-Lösung HBSS 2,5 mg / ml Endkonzentration Dispase 100 ug / ml Gentamycin Neutralisierenden Medien HBSS 15% (v / v) FBS Kollagenaselösung 0,25% (w / v) Kollagenase, Typ 1 nhalt &quot;&gt; 100 ug / ml Penicillin / Streptomycin 2,5 ug / ml Fungizone 50 ug / ml Gentamycin Polybrene Lösung HBSS 8 ug / ml (w / v) Polybrene </td></tr></tbody></table>

schnelle genetische analyse von epithelial-mesenchymale signaling während haarregeneration

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Haarfollikelmorphogenese, ein komplexer Prozess, Interaktion zwischen Epithelien abgeleiteten Keratinozyten und der zugrunde liegenden Mesenchym, ist ein attraktives Modellsystem zur Entwicklung der Organe und Gewebe-spezifische Signalisierung zu studieren. Obwohl Haarfollikel Entwicklung ist genetisch gefügig, schnelle und reproduzierbare Analyse der wesentlichen Faktoren für diesen Prozess bleibt eine Herausforderung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur gezielten Überexpression oder shRNA-induzierte Hemmung von Faktoren Verwendung Lentivirus in einer Gewebe-spezifischen Art und Weise zu erzeugen. Mit einer modifizierten Version eines Haarregeneration Modell 5, 6, 11, können wir erreichen, robuste Gewinn-oder Verlust-of-function-Analyse in primären Maus Keratinozyten oder Hautzellen, um das Studium epithelial-mesenchymale Signalwege, die Haarfollikelmorphogenese führen zu erleichtern . Wir beschreiben, wie die frische primären Maus Keratinozyten und dermalen Zellen, die Hautpapillazellen und deren Vorstufen enthalten isolieren, liefern Lentivirus ContaiNing entweder shRNA oder cDNA einem der Zellpopulationen, und verknüpfen die Zellen vollständig ausgebildet Haarfollikel auf dem Rücken von Nacktmäusen erzeugen. Dieser Ansatz ermöglicht die Analyse von Gewebe-spezifischen Faktoren erforderlich, um Haarfollikel innerhalb von drei Wochen zu generieren und bietet eine schnelle und komfortable Begleiter vorhandenen genetischen Modelle.

In Abbildung 1 zeigen wir das Ergebnis der dermal-spezifischen lentiviralen shRNA Knockdown von Smoothened (Smo), eine kritische Shh Signalgebungsbauteil, in einem 3-Wochen alten regenerative Haar-Transplantat. Steuerung Transplantate mit lentiviralen Vektor allein zeigen robust Haarwuchs (Abbildung 1A). Im Gegensatz dazu, dermal-spezifischen Knockdown von Smo führt zum Verlust des Haarwachstums (Abbildung 1B). Hämatoxylin und Eosin-Färbung zeigt das Stadium der Haarfollikel in Kontroll-und experimentellen Bedingungen (1C, D). Das Haarwachstum Phänotyp aus ähnlichen Behandlungen können unter Experimenten Variablen, einschließlich der positiven Kontrolle mit lentiviralen Vektor allein Infektion. Deshalb positive Kontrolle Transplantate sollte immer in jedem Experiment als Referenz als 30% der Transplantate kann als Folge der Narbenbildung oder unvollständige Befestigung der Transplantate nicht einbezogen werden. Im Fall der Prüfung einer Interaktion zwischen zwei Faktoren wie überexprimierenden cDNA eines Faktors erneutSCUE shRNA-vermittelte Knockdown von einem anderen Faktor, sollte man immer auch knockdown allein Transplantate zu manifestieren die loss-of-function Ergebnis in jedem Experiment. Dadurch wird eine notwendige Bandbreite, um zu bestimmen, wie ein bestimmtes Gen die Haarfollikel Regeneration Weg und wie zwei Gene interagieren stört. Entfernung von der Kammer (2A) muss mit Vorsicht durchgeführt werden. Die neu gebildete Pfropf sollte etwas undurchsichtig mit einer matten Oberfläche (Abbildung 2B). Das Transplantat kann die Kammer bleiben, so leichtes Anheben der einen Seite ist darauf zu achten, das Transplantat bleibt an der Wundbett. Das Transplantat ist recht stabil nach drei Tagen und sollte wenig Schwierigkeiten bereiten beim Entfernen des Verbandes. Robust Haarwuchs sollte nach drei Wochen (2C) beobachtet werden. Weglassen entweder mDCs oder KCs wird in einem wiederhergestellten Wunde ohne Haare (2D) 11 führen. Zelltod oder Zellverlust in einem derZelltypen führt auch ohne Haare im Gegensatz zu reduzierten Haarregenerierungszusammensetzung in dermo-Smo Knockdown wie in 1B gezeigt. Um einen erfolgreichen Test zu gewährleisten, ist es von entscheidender Bedeutung, um eine größere als 90% virale Infektion von Zellen mit geeigneten Überexpression oder Knockdown Effizienz vor dem Pfropfen. Aufgrund der zeitlichen Beschränkungen des Transplantationsverfahren, empfiehlt es Fehlersuche Virusinfektion Wirkungsgrade vor Beginn einer Pfropfung Experiment, und immer Speichern einen kleinen Teil der Zellen am Tag der Transplantation Verfahren zur verlustfreien oder gain-of-Expression zu verifizieren. Lentivirale Titer variieren je nach der verwendeten und konstruieren zu bestimmen vor der Infektion von 90 bis 100% Wirkungsgrad zu werden. Wir überwachen Virusinfektion Effizienz mit GFP aus dem lentiviralen Vektor koexprimiert. Wir routinemäßig quantitative PCR und / oder Western Blot um das Ausmaß der Knockdown oder Überexpression zu bestimmen. Verwendung Dual-Expressionsvektoren mit fluoreszierenden Markierungen zu kennzeichnenviral infizierte Zellen bietet eine Möglichkeit, perdurance des Signals und die Anzahl von Zellen, die unsere Konstrukte in reifen Transplantate hinweisen. Wir verwenden GFP durch einen CMV-Promotor aus der Lentivirusvektor pSicoR-CMV-GFP-10 in Kombination mit Smo shRNA angetrieben. In Abbildung 3 zeigen wir ein 3-Wochen alten dermal-spezifischen Graft, wo GFP in Hautpapilla einer repräsentativen Haarfollikel lentivirally-exprimiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Abbildung 1. Histologische Analyse der Haarfollikel Wachstum. (A) der Steuerung Haarregenerierungszusammensetzung Pfropf Ansicht mit dermalen Zellen mit leeren lentiviralen Vektor und unbehandelten Keratinozyten infiziert. (B) mit Smoothened Knockdown lentiviralen shRNA in dermalen Zellen mit unbehandelten Keratinozyten führt zu einem Verlust der Haarfollikel kombiniert. (C) Hämatoxylin und Eosin Färbung zeigt Anagenhaar follicles Kontrolle Transplantate erstrecken sich bis in die Dermis und (D) Smoothened Knockdown Haarfollikel bleiben gehemmt und weitgehend. Alle Bilder sind drei Wochen nach der Transplantation. Maßstab bedeutet 100 um. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Abbildung 2. Pfropfen primären Zellen. (A) nu / nu-Maus mit vernäht Kammergehäuses primäre dermale Zellen und Keratinozyten. (B) Entfernung von Kammer belichtet neu Haut, ist stumpf und undurchsichtig Charakter gebildet. (C) Ausgewachsene Haare auf Transplantats mit Wildtyp- Geben primäre dermale Zellen und Keratinozyten bei drei Wochen nach der Transplantation. (D) Zugabe von primären dermalen Zellen ohne Keratinozyten führt zu keiner Haar nach drei Wochen. Ähnliche Ergebnisse werden unter Zusatz von primären Keratinozyten ohne dermalen Zellen gesehen. Abbildung 3. Wartung der GFP-Expression in dermalen Papille. Konfokale Bilder von Hautpapilla von einem 3-Wochen alten regeneriert Transplantat. GFP wurde in der dermalen Zellpopulation aus einem lentiviralen Vektor exprimiert und detektiert in der dermalen Papille (grün). Versican (rot) grenzt die dermale Papille und Kerne waren Etikett mit Hoechst (blau). Anmerkung GFP ist speziell in dermalen Zellen, nicht aber in den umliegenden Keratinozyten exprimiert. Maßstab bedeutet 20 um.

Gewebe-spezifische Analyse von einem Haarfollikel Regeneration Modell mit Lentivirus, um Gewinn-oder Verlust-of-function vermitteln.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Die Morphogenese der Haarfollikel ist ein komplexer Prozess, der eine Interaktion zwischen epithelabgeleiteten Keratinozyten und dem darunter liegenden Mesenchym erfordert, und stellt ein ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die gewebespezifischen Funktionen von Signalwegen zu untersuchen, die für die Bildung der Haarfollikel entscheidend sind. Dies wird erreicht, indem primäre dermale und epidermale Zellen aus neugeborenen Mäusen isoliert werden. Anschließend wird die Genexpression verändert, indem die primären Zellen mit Lentivirus infiziert werden.Der dritte Schritt besteht darin, die epidermalen und dermalen Zellpopulationen in Kammern zusammenzuführen, die auf einem Wundbett an einer Nacktmaus befestigt sind. Anschließend wird das Transplantat auf Haarwachstum überwacht. Letztendlich kann der Einfluss der Genmanipulation auf die Bildung der Haarfollikel visuell sowie durch histologische Färbung der Transplantationsstelle beurteilt werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie einem nasalen Mausmodell, besteht darin, dass die Transplantation innerhalb von drei Wochen abgeschlossen sein kann. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie beantworten, beispielsweise, wie Faktoren in einem Gewebe die Signalübertragung und Funktion in einem anderen beeinflussen können. Wir hatten die ursprüngliche Idee zu dieser Methode, als wir die gewebespezifischen Funktionen von Ceiling-Molekülen bei der Bildung der Haarfollikel untersuchen wollten, nachdem eine Maus gewaschen wurde, die durch Asphyxie euthanasiert worden war.Schneiden Sie jedes Gliedmaßen- und Schwanzende an der Basis des Rumpfes mit sterilen Scheren ab. Fassen Sie dann den Körper fest mit einem Paar gebogener Pinzetten und führen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt entlang der dorsalen Haut vom Kopf bis zum Schwanz durch. Durchdringen Sie dabei nicht die darunterliegende Faszie.Nun entfernen Sie vorsichtig die Haut entlang der Mittellinie der Maus. Greifen Sie die freigelegte Maus fest mit der langen Seite der gebogenen Pinzette und führen Sie ein weiteres Paar gebogener Pinzetten unter die Haut am hinteren Ende der Maus ein. Ziehen Sie nun die Haut in einer fließenden Bewegung vollständig von der Maus ab und entsorgen Sie die Leiche.Legen Sie die Haut mit der Dermisseite nach unten in die erste Schale mit Waschlösung. Breiten Sie die Haut in der Lösung aus und bewegen Sie sie mit der Pinzette. Lassen Sie die Haut anschließend in der Waschlösung, während Sie die nächste Haut dissezieren.Nachdem Sie die nächste präparierte Haut in die erste Schale mit Waschlösung gelegt haben, überführen Sie die zuvor behandelte Haut in die zweite Schale mit Waschlösung. Belassen Sie die Hautproben in der zweiten Waschlösung, bis alle Hautproben gesammelt sind. Überführen Sie nach dem letzten Waschschritt bis zu fünf Hautproben in eine Schale mit kalter Disbe-Lösung.Glätten Sie die Häute mit der Dermisseite nach unten und lassen Sie sie acht bis 16 Stunden bei vier Grad Celsius schwimmen. Überführen Sie eine Haut von den Kühlfächern in eine neue Schale. Glätten Sie sie mit der Dermisseite nach unten.Fassen Sie die Epidermis mit einer Pinzette und ziehen Sie sie langsam von der Dermis ab. Die Epidermis sollte sich in einem Stück ablösen, sie ist weiß und dünn, während die Dermis bräunlich, dicker und gallertartig ist. Sortieren Sie die beiden Gewebe in getrennte Kulturschalen, um mit der Zellisolierung zu beginnen.Um die Hautzellen zu isolieren, zerkleinern Sie die Dermis mit zwei Skalpellen in sehr kleine Stücke. Inkubieren Sie das zerkleinerte Hautgewebe mit frisch hergestellter Kollagenase-Lösung bei 37 Grad Celsius eine Stunde lang und schwenken Sie die Zellsuspension alle 10 Minuten vorsichtig, bis die Verdauung abgeschlossen ist.Die Suspension sollte hauptsächlich aus Einzelzellen bestehen, und die Lösung sollte sich von klar zu trüb verfärbt haben. Geben Sie nun 10 % Volumen FBS zur Zellsuspension hinzu. Lassen Sie sie durch einen 70-Mikron-Zellsieb in 50-Milliliter-Röhrchen laufen.Sammeln Sie bis zu 30 Milliliter Durchfluss pro Röhrchen. Fahren Sie mit der Isolierung der Hautzellen gemäß dem schriftlichen Protokoll fort. Um die Keratinozyten zu isolieren, schneiden Sie jedes Epidermis in sechs bis acht kleinere Stücke. Incubieren Sie das geschnittene Gewebe mit frisch aufgetautem 0,05 % Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Fahren Sie mit der Keratinozyten-Isolierung gemäß dem schriftlichen Protokoll fort, betäuben Sie eine weibliche Nacktmaus im Alter von sieben bis zwölf Wochen mit Ketamin und Xylazin oder einer bevorzugten Methode. Achten Sie darauf, Augenschmiermittel aufzutragen, und legen Sie die Maus auf eine Heizplatte.Desinfizieren Sie nun die Rückenhaut mit Jod, gefolgt von Alkoholtupfern. Greifen Sie mit einer Pinzette die Haut an der Halsbasis, und schneiden Sie ein Loch mit einem Durchmesser von einem Zentimeter in die eingeklemmte Haut. Setzen Sie die Kammer auf das Wundbett und bedecken Sie die Ränder der Kammer mit der umgebenden Haut.Befestigen Sie die Kammer mit etwa sechs Nähten. Befestigen Sie jeweils nur eine Kammer pro Maus entlang der Ränder. Sobald die Kammer befestigt ist, überprüfen Sie die Zellsuspension. Wenn sich diese am Boden abgesetzt hat, resuspendieren Sie sie vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze.Nun die Zellsuspension vorsichtig wirbeln und mit einer 23-Gauge-Nadel, die an eine Ein-Milliliter-Spritze angeschlossen ist, aufziehen. Jede Kammer mit der Nadel durchstechen und PBS-gepufferte Zellen langsam auf die Wunde tropfen lassen. Sobald die Mäuse aus der Narkose erwachen, sie in saubere Autoklaviertierkäfige mit jeweils zwei Mäusen pro Käfig setzen.Stellen Sie sicher, dass Antibiotika und Tylenol über das Trinkwasser verabreicht werden. Nach sieben bis neun Tagen das behandelte Nacktmaus-Anästhetikum wie zuvor durchführen. Die Haut um die Kammer mit Jod desinfizieren und mit Alkoholtupfern reinigen.Schneiden Sie die Nähte vorsichtig ab und entfernen Sie sie aus der Kammer. Entfernen Sie die Kammer vorsichtig, falls die neue Haut daran haftet. Lösen Sie das Transplantat vorsichtig von der Kammer.Halten Sie den Transplantat mit einer Pinzette fest. Während der Entfernung der Kammer sollte das Transplantat stumpf und undurchsichtig erscheinen. Legen Sie eine nicht haftende Auflage mit einem dünnen Film von Antibiotika auf die offene Wunde und nähen Sie sie mit zwei Stichen an Ort und Stelle.Wickeln Sie einen Verband um die Maus, um den Tupfer zu fixieren und die Wunde zu schützen. Nähen Sie den Verband an Ort und Stelle. Nach drei Tagen entfernen Sie die Verbände und den Tupfer. Die Maus muss für diesen Schritt nicht anästhesiert werden.Das Transplantat sollte trocken sein und eine undurchsichtige bis braune Farbe aufweisen. Überprüfen Sie das Transplantat regelmäßig auf Haarwuchs, der 16 Tage nach der Transplantation beginnen sollte. Ein spezifischer Knockdown des Smoothened-Gens, einer entscheidenden Komponente der Sonic-Hedgehog-Signalübertragung, wurde in isolierten dermalen Zellen durchgeführt.Diese Zellen wurden gemäß dem beschriebenen Protokoll auf Haarrekonstitutions-Transplantate angewendet. Nach dreiw&ouml;chigem Wachstum zeigten die positiven Kontrolltransplantate mit Lentiviralvektor allein ein kr&auml;ftiges Haarwachstum. Die Absenkung der Expression des Smoothened-Gens f&uuml;hrte jedoch zu einer starken Verminderung des Haarwachstums.Negativkontrolltransplantate, bei denen entweder primäre Dermazellen oder Keratinozyten weggelassen wurden, führten zu einer regenerierten Wundstelle ohne jegliche Behaarung. Ebenso führte der Zelltod oder Verlust einer der beiden Zelltypen im Transplantat zu keinem Haarwachstum. Es wurde festgestellt, dass der Lentivirusvektor vor dem Transplantatexperiment eine gute Infektionseffizienz aufwies, und er wurde zudem so konstruiert, dass er GFP zusammen mit diesem Smoothened, S-H-R-N-A, produziert.Die Betrachtung der dermalen Papille der Haarfollikel unter fluoreszierender Optik diente daher als nützliche Kontrolle zur Bestätigung der Dauer der lentiviralen Expression. Nach drei Wochen wird die H-und-d-Färbung verwendet, um den Wachstumsstadium der Haarfollikel im Kontrolltransplantat sowie ihr verzögertes Entwicklungsstadium bei Herabregulierung der Smoothened-Expression darzustellen. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei Tagen in insgesamt 14 Stunden durchgeführt werden. Diese Technik kann erweitert werden, um die Beziehung zwischen Tumor und Stroma während der Tumorentstehung im Bereich der Krebsbiologie zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Genfunktion bei der Bildung von Haarfollikeln untersucht. Nutzen Sie unseren schnellen Rekonstitutions-Haartest als Alternative zu traditionellen genetischen Knockouts.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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