Name: Bronchoalveoläre Lavage (BAL) für Forschung, Beschaffung angemessene Probenausbeute (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T19:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Lernen Sie eine sichere Bronchoalveoläre Lavage mit schonendem Handabsaugen zur Gewinnung lebensfähiger Immunzellen aus der Lunge für die Forschung. Diese Methode minimiert Gewebetrauma und maximiert die Zellausbeute.

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Vielen Dank an Elena Mitsi (Wissenschaftlicher Mitarbeiter) und Sr. Carole Hancock (Research Krankenschwester) und OP-Personal für ihren Beitrag zu filmen, und David Shaw (Forschung Krankenschwester) für seine Unterstützung mit unseren Forschungs Bronchoskopien. Vielen Dank auch an unsere ehrenamtlichen Rebecca Dunphy dafür, dass dieses Verfahren, gefilmt zu werden.

1. Die Themen werden auf Anreise mit dem Atem Forschung Krankenschwester Met <ol><li> Das Thema wurde Fasten für&gt; 4 h für feste Nahrung und 2 h für klare Flüssigkeiten ein. </li><li> Das Verfahren wird als Tag Fall mit entsprechenden Pre-und Post-Prozedur überprüft (nach Standard-Krankenhauspolitik) durchgeführt. </li><li> Das Thema trägt einen Krankenhauskittel. </li><li> Eine kleine Gauge-Kanüle eingeführt wird (idealerweise in die linke Hand) und bleibt in situ bis zum Ende der Post-Verfahren Erholungsphase ein. </li><li> Vorverfahren Beobachtungen getroffen werden (Blutdruck, Herzfrequenz, Sauerstoffsättigung [sats]). </li><li> Das Thema ist mit der Bronchoskopie-Suite übertragen. </li></ol> 2. Das Thema ist für die Vorgehensweise in der Suite durch eine Atemforschungsmediziner in Bronchoskopie Erfahrene Vorbereitet <ol><li> Überwachungsgeräte angeschlossen ist, einschließlich, 3-Kanal-EKG, Pulsoximeter 1,10 und Blutdruckmessgerät. Anesthetic-Unterstützung ist nicht erforderlich einschließlich schriftlicher Einwilligung. </li><li> Sauerstoff kann über eine Nasenkanüle mit bis zu 4 l / min geliefert werden, zu erreichen sats&gt; 90% ein. </li><li> Der Betreiber prüft die Bronchoskop, dies beinhaltet eine effektive Absaugung durch Absaugen sterile physiologische Kochsalzlösung. </li><li> Lokalanästhesie mit Lidocain in die Nasenwege (mit Instillagel 1) und der Mundschleimhaut erreicht (mit Xylocain) </li><li> Wenn Sedierung geeignete und von der Person beantragt, so wird die intravenöse Midazolam ein. Eine entsprechende Umkehrmittel (Flumazenil) ist ab sofort verfügbar. </li><li> Reanimationsausrüstung sollten leicht zugänglich sein 1,10. </li></ol> 3. Das Bronchoskop wird eingefügt und positioniert, <ol><li> Intubation ist in der Regel über die Nase. Ist dies nicht möglich, da Nasenpolypen, entzündeten Nasenmuscheln oder irgendwelche Beschwerden dann das Motiv über den Mund intubiert (ein Mundschutz verwendet wird, um zu verhindern,Schäden an Rahmen oder der Person Zähne). </li><li> Lokalanästhesie an der Kehlkopf wird mit 4% Lidocain abgeschlossen, in der Regel insgesamt von 4-6 ml verwendet. Häufig dies verursacht Husten auf Instillation. </li><li> Die Stimmbänder übergeben werden, und ferner Schleimhautanästhesie mit 2 ml Aliquots von 2% Lidocain bei der Carina bei der Teilung des rechten Unterlappen (RLL) und rechte Mittellappen (RML) und an der RML Eingang. </li><li> Das Bronchoskop wird innerhalb des RML positioniert, idealerweise im Mittelsegment in einer Position, wo es distal genug, um in einer sicheren Position ist, aber nicht zu, so daß die distalen Luftwege zusammenbricht, wenn ein Saugen angewandt unter Verwendung des Saug-Taste (&quot;Wink-Test&quot; ). </li><li> Gute Positionierung während der Test Nachricht von einem Bronchoskop, die vollständig in Position durch den bronchoscopist und einem Atemwege, die nicht vollständig schließen sofort auf sanfte Saugwirkung tut aufrechterhalten werden kann angezeigt. </li></ol> 4. Die BAL durchgeführt <ol><li> Vier 60-ml-Spritzen sind vorge60 ml, 50 ml, 50 ml und 40 ml in aufeinander Spritzen - mit erwärmter physiologischer Kochsalzlösung gefüllt. Wenn das Motiv und bronchoscopist sind bereit die erste Spritze von Kochsalzlösung wird von der Bronchoskopie Assistent eingeflößt während die bronchoscopist hält die Position in der RML. </li><li> Sanften Hand Sog wird dann vom Assistenten mit dem gleichen Port und 50-ml-Spritze durchgeführt. </li><li> Dieses Verfahren wird dann wiederholt eine weitere 3x mit einem maximalen Volumen von 200 ml in den spezifischen Technik verwendet. </li><li> Die abgerufenen BAL-Flüssigkeit wird sanft in gekennzeichneten Behältern bereits auf schmelzendem Eis gehalten ausgewiesen. Glasbehälter kann, um die Zellhaftung zu hemmen und zu maximieren Zellrück presiliconized werden. </li><li> Die BAL-Flüssigkeit trüb erscheint gegen das Licht mit Oberflächen Seifenblasen durch Tenside gebildet. </li><li> Das Bronchoskop wird langsam vollständig zurückgezogen. </li><li> Die BAL-Flüssigkeit wird unverzüglich auf Eis zur sofortigen Verarbeitung transportiert. </li></ol> 5. Betreff Rettung </p&gt; <ol><li> Das Thema wird für 2-4 Stunden durch die Atemforschungs Krankenschwester auf einer Station erholt. </li><li> Während dieser Zeit dürfen sie zur Ruhe und dann nur essen und trinken&gt; 60 min 1 nach dem Eingriff (wenn ihre Schwalbe als sicher beurteilt), um das Risiko der Aspiration. </li><li> Postprozedurale Beobachtungen werden überwacht und aufgezeichnet. Eine klinische Prüfung erfolgt vor der Entlassung. </li><li> Das Thema wird Predischarge über die häufigsten Nebenwirkungen (Fieber, mild rechts submammary Beschwerden in der Brust, Halsschmerzen) informiert und angesichts einer Kontaktnummer für den Fall erhebliche Nebenwirkungen auftreten, ein. </li><li> Das Thema wird an 1-5 Tagen nach dem Eingriff mit einer klinischen Kontakt Follow-up. Dies kann entweder über das Telefon oder in Person zu sein. </li></ol> 6. Die Zellen werden im Labor Isoliert - Führen auf Melting Ice Wo Mögliche <ol><li> Das Volumen der BAL-Flüssigkeit wird durch eine doppelte Schicht von steriler Gaze Tupfer aufgenommen und filtriert,Schleim-Stecker in vorgekühlte, sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen entfernen. </li><li> Zellen werden durch Zentrifugation bei 500 × g bei 4 ° C für 5-10 min pelletiert und durch Vortexen in 50 ml kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Zentrifugation wird einmal wiederholt. </li><li> Zellen werden in Kulturmedium resuspendiert (RPMI-1640 + 10% fötales Rinderserum + 2 mM L-Glutamin + Penicillin [40 IU / ml], Streptomycin [75 IU / ml], und Amphotericin B [0,5 IU / ml]) und Differenzzählung durchgeführt wird unter Verwendung eines gleichen Volumens von Trypanblau und einem Hämocytometer. </li><li> Die Zellsuspension wird normalisiert auf die gewünschte Dichte (wir verwenden 1 x 10 6 Zellen / ml), durch Pipettieren in geeignete Gewebekulturplatten eingebracht und bei 37 ° C für 3 Stunden, um Haftung zu Makrophagen inkubiert. 1 ml dieser Zellsuspension pro Well für 24-Well-Kulturplatten geeignet. </li><li> Für Lymphozyten-Arbeit, nach 3 Stunden Inkubation wird das Kulturmedium vorsichtig nach oben und unten 3x pipettiert und gesammelt. Dieses Medium enthält Lymphozytenund nicht-adhärenten Makrophagen und Lymphozyten verwendet werden, um Funktion zu beurteilen, sondern kann auch in Reinigungsschritten verwendet werden, z. B. mit CD14 magnetischen Kügelchen an Makrophagen zu entfernen. </li><li> Makrophagen für Arbeit, nach 3 h Inkubation wird das Medium vorsichtig mit minimaler Pipettieren entfernt und mit frischem, warmem Medium ohne Antibiotika (RPMI 1640 + 10% fötales Rinderserum + 2 mM L-Glutamin) ersetzt. Die Makrophagen sind Anhänger der Gewebekulturplatte (siehe Fig. 1). </li></ol>

<ol><li>BTS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+British+Thoracic+Society+Bronchoscopy+Guideline+Committee+-+A+sub-Committee+of+the+Standards+of+Care+Committee+of+the+British+Thoracic+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">The British Thoracic Society Bronchoscopy Guideline Committee - A sub-Committee of the Standards of Care Committee of the British Thoracic Society.</a> Thorax. 56 (Suppl I), 1-21 (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+and+guidelines+for+bronchoalveolar+lavage+%28BAL%29+report+of+the+European+Society+for+Pneumology+Task+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations and guidelines for bronchoalveolar lavage (BAL) report of the European Society for Pneumology Task Group.</a> Eur. Respir. , 561-585 (1989).</li>
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<li>Huang, Y. C., Bassett, M. A., Levin, D., Montilla, T., Ghio, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+phase+reaction+in+healthy+volunteers+after+bronchoscopy+with+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Acute phase reaction in healthy volunteers after bronchoscopy with lavage.</a> Chest. 129, 1565-1569 (2006).</li>
<li>Gritzfeld, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Human+Pneumococcal+Carriage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental Human Pneumococcal Carriage.</a> J. Vis. Exp. (72), (2013).</li>
</ol>

Andrea M. Collins wird von der Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung, und keine potenziellen Interessenkonflikte finanziert. Sie hat Mittel von Merck (MSD) und GSK zu Konferenzen und Vortragshonorare zu besuchen. 50 Forschungs BALs unabhängig voneinander durchgeführt. Jamie Rylance wird durch den Wellcome Trust finanziert und hat keinen Interessenkonflikt. Er hat keine anderen Mittel erhalten. 70 Forschungs BALs unabhängig voneinander durchgeführt. Daniel G. Wootton wird von einem NIHR PhD Fellowship finanziert und hat keine Interessenkonflikte. 40 Forschungs BALs unabhängig voneinander durchgeführt. Angela D. Wright hat keine potenzielle Interessenkonflikte. Mit über 100 Forschungs BALs unterstützt. Adam Wright KA hat keine potenzielle Interessenkonflikte. Er hat über 50 BAL-Proben verarbeitet. Duncan G. Fullerton </strong&gt; Hat keine potenzielle Interessenkonflikte. 100 Forschungs BALs unabhängig voneinander durchgeführt. Stephen B. Gordon hat keine potenzielle Interessenkonflikte. Er hat Mittel von Merck (MSD) und Novartis um an Konferenzen teilzunehmen. 400 Forschungs BALs unabhängig voneinander durchgeführt.

Um gute Ergebnisse zu erzielen, die folgenden sind hilfreich: <ol><li> Gute anesthetisation an der Basis der Zunge und der hinteren Rachen. Dies ist wichtig, weil es Verfahrens Toleranz des Patienten und der Gesamtkomfort verbessert. </li><li> Entweder ein pädiatrischer (Außendurchmesser 3,4-3,6 mm) oder erwachsenen Bronchoskop (Außendurchmesser 4,8 bis 5,9 mm) verwendet werden. </li><li> Wenn es irgendein Unbehagen während nasale Intubation, bevorzugt orale Intubation. Im Allgemeinen Nasen Intubation ist entweder eine einfache Technik oder aufgegeben werden sollte. </li><li> Nach der erstmaligen Einträufeln von Lidocain auf die Oropharynx, können Gegenstand der Bronchoskop zurückgenommen bevorzugen anhängigen dem Beginn der Anästhesie, insbesondere wenn das Bronchoskop oral eingeführt. </li><li> Stellen Sie sicher, mindestens 10 x 10 ml-Spritzen sind mit nur 2-4 ml Lidocain vorgefüllt. Die Luft sollte in den Spritzen ermöglicht verbesserte Lieferung der Narkose direkt auf Schnüre und endobronchialer schleimig gelassen werdensa. </li><li> Seit Husten während des Verfahrens deutlich reduziert BAL Ausbeute; erwärmt mit Kochsalzlösung und eine gute Schleimhautanästhesie sind wichtig, um diese zu reduzieren. </li><li> Die 50-ml-Spritzen sind mit Kochsalzlösung vorgefüllt erwärmt werden. Es ist für die ersten 50 ml physiologischer Kochsalzlösung eingeflößt, zwischen 10-20 ml aufgrund dead-space Verlust und der Rest läuft in der terminalen Luftwege ergeben gemeinsam. Weitere Aliquots geben einen größeren Anteil der Flüssigkeit. </li><li> Der Betreiber sollte immer die Bronchoskop vor der Intubation zu überprüfen, einschließlich der Gewährleistung effektiven Absaugung durch Absaugen sterile physiologische Kochsalzlösung. Verlust der Saugwirkung kann allgemein durch Abknicken des Schlauches oder Lecks um die Verbindungen mit dem Bronchoskop oder Saugvorrichtung auftreten. </li><li> Bei der manuellen Absaugung, idealerweise der Atemwege sollten nicht zusammenbrechen. Wenn Sog immer wieder zusammenbricht, die Atemwege sind BAL kehrt zu einem Ventilmechanismus reduziert und lokale Entzündungen und Blutungen ist wahrscheinlicher: dies wiederum macht die Atemwege mErz reizbar und Husten wahrscheinlicher. Die Wahl der am besten geeigneten RML subsegmentalen Zweig und mit geringer Saugdrücke sind deshalb beide wichtig. </li><li> Wenn Luft ständig abgesaugt überprüfen Sie die Verbindung der Spritze mit dem Bronchoskop und auch die Position des Bronchoskops im distalen Luftwege. Wenn dies ein wiederkehrendes Problem, post-Verfahren zu gewährleisten, dass keine Löcher in der Bronchoskop selber. </li><li> BAL von Rauchern häufig dunkler aufgrund der Anwesenheit des intrazellulären Partikel. Raucher können die Bronchoskopie weniger gut vertragen und haben vermehrtes Husten. </li><li> Die bevorzugte BAL Volumenausbeute&gt; 100 ml. Eine Ausbeute von&gt; 150 ml ist ausgezeichnet. Es wurden keine Erträge&gt; 170 ml erlebt. Gibt es keine lineare Beziehung zwischen der Zellausbeute und BAL Volumenausbeute. </li><li> Die Renditen von &lt;100 ml sind, nach unserer Erfahrung eher zu Nebenwirkungen wie Husten, Brustschmerzen und Fieber führen. Wir beraten, dass Probanden mit Ausbeuten von &lt;100 ml reco seinin Linksseitenlage Vered, kann diese Entwässerung eines verbleibenden Lungenflüssigkeit helfen. </li><li> Klinische Kontakt sollte mit dem Thema innerhalb von 1-5 Tagen erfolgen, um keine Nebenwirkungen zu gewährleisten. </li><li> Midazolam Sedierung ist für &lt;50% der Patienten in Großbritannien und &lt;5% in Malawi eingesetzt. Midazolam scheint nicht direkt die Verträglichkeit zu verbessern, einige Betreiber das Gefühl, dass Sedierung kann manchmal kontraproduktiv sein bei der Aufrechterhaltung einer kohärenten (und beruhigend) Dialog mit dem Thema. </li><li> Nach unserer Erfahrung gibt es eine signifikante Lernkurve mit dieser Technik. Zum Beispiel die Koordination zwischen Arzt und Krankenschwester braucht Zeit, und die Renditen sind oft niedriger am Anfang des Lernprozesses. </li><li> Bei HIV-positiven Patienten, verwenden wir Antibiotika prophylaktisch prebronchoscopy. </li></ol>

Hintergrund Bronchoskopie wurde für die klinische Praxis entwickelt, es ist weit verbreitet sowohl diagnostisch als auch therapeutisch 1,2 verwendet. Bronchoalveoläre Lavage (BAL) entfernt nicht-adhärenten Zellen und Lunge Futter Flüssigkeit aus der Schleimhautoberfläche; Biopsie wird verwendet, um Schleimhaut und Submukosa Gewebe probieren. In Forschungsumgebungen ermöglicht BAL Abtastung angeborenen (Lungen-Makrophagen 3-5), Mobil (B-und T-Zellen, 6) und humorale (Immunglobulin 7) Reaktionen in der Lunge. BAL ist international für Forschungszwecke 8 angenommen und seit 1999 die Technik in&gt; 1.000 Probanden in Großbritannien und Malawi von unserer Gruppe durchgeführt. Wir verwenden diese Technik in den Studien der angeborenen zellulären und humoralen Immunantwort auf den Pneumokokken-Antigen einschließlich experimenteller menschlichen Pneumokokken-Wagen 9,17, Biomasse Rauch 5, HIV und die Impfung und Ergänzung der Behandlung stustirbt in Genesung von einer Lungenentzündung. Unsere Technik nutzt sanfte Hand Absaugen von Flüssigkeit eingeflößt, dies ist für die BAL-Volumen zurück maximieren und gelten Mindestscherkraft auf Flimmerepithelien, um die Struktur und Funktion von Zellen in der BAL-Flüssigkeit zu bewahren. In einem Forschungskontext BAL nutzt eine andere Technik als die durch Atem-und Intensivmediziner (oft als bronchiale Wäsche, Wasch, Spülung, oder BAL), die darauf abzielen, diagnostischen oder therapeutischen Nutzen zu gewinnen praktiziert. Die Forschung Technik wurde entwickelt, um Zellen zu ernten und Lebensfähigkeit zu erhalten, um das Wachstum von Zellen in Kultur ex vivo zu erleichtern. Aus diesen Gründen ist die Forschung Technik verwendet ein größeres Volumen instillate (typischerweise in der Größenordnung von 200 ml) und beschäftigt manuellen Absaugung zu Zellschäden zu verringern. Die Patienten werden Lokalanästhetikum gegeben, bot Sedierung (Midazolam), und gut vertragen das Verfahren mit minimalen Nebenwirkungen. Mündliche und schriftliche subjektivent Informationen verbessert die Toleranz und eine schriftliche Einverständniserklärung ist zwingend ein. Ziel Das übergeordnete Ziel ist, dass das Verfahren sicher und wirksam zu sein. Themen sollten keine physiologische Störung erleben und Betreiber sollten konsequent von über 100 ml BAL von Patienten zu sammeln. Nach dem Eingriff sollten Themen minimalen Nebenwirkungen zu erleben. Sicherheit Sicherheit der Person im Vordergrund steht. Themen werden sorgfältig mit klarem und Ausschlusskriterien ausgewählt. Dieses Protokoll enthält eine Beschreibung der möglichen Risiken und die getroffenen Maßnahmen, um sie zu mildern. Kontraindikationen für Forschung Bronchoskopie kann absolut oder relativ ausgedrückt werden kann, und werden in unserem Studienprotokoll als Ausschluss-und Einschlusskriterien enthalten. Unsere Themen sind alle abgeschirmt zu voller Gesundheit zu gewährleisten. Absolute Kontraindikationengehören instabile Halswirbelsäule, reagiert Hypoxie, instabile Angina pectoris, Blutungsneigung, Herzrhythmusstörungen und bösartige. Relative Kontraindikationen, einschließlich der Bedingungen mit erhöhten Komplikationsraten verbunden sind, gehören: Allgemein: schlecht Genossenschaft ein Thema, eine signifikante allgemeine medizinische Problem zB Epilepsie, vorherige schlecht vertragen Bronchoskopie, bekannten Nebenwirkungen von Lidocain oder Midazolam, Schwangerschaft, schlechte Ernährung. Atemwege: Hypoxie [Sättigungen (sats) on air &lt;94%], Hyperkapnie, instabile Asthma 1, wesentlich beeinträchtigt Atemfunktion 1 (FEV 1 &lt;1 l), Lungenbluthochdruck. Herz-Kreislauf: Urämie, innerhalb von 6 Wochen nach Myokardinfarkt 1, obere Hohlvene Obstruktion. Sonstiges: Immunsuppression (unsere Gruppe führt regelmäßig dieses Verfahdure bei HIV-positiven Patienten). Siehe Tabelle 1 - Risiken mit BAL für Forschung verbunden.

<table><tbody><tr><td>Faseroptisches Bronchoskop, Licht- und Saugquelle</td><td>nicht spezifiziert</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> OP-Kittel, sterile Handschuhe </td><td>nicht spezifiziert</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Blutdruckmessgerät </td><td>nicht spezifiziert</td><td></td><td> Zur kontinuierlichen Patientenüberwachung </td></tr><tr><td> Pulsoximeter </td><td>nicht spezifiziert</td><td></td><td> Zur kontinuierlichen Patientenüberwachung </td></tr><tr><td>3-Kanal-EKG-Monitor</td><td>nicht spezifiziert</td><td></p</td><td>> Zur kontinuierlichen Patientenüberwachung </td></tr><tr><td>Nasale Sauerstoffzufuhr 2-4 L/min</td><td>nicht spezifiziert</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Lidocain 10% Spray (Xylocain) </td><td>AstraZeneca</td><td></td><td>Für topische Anästhesie</td></tr><tr><td> Lidocainhydrochlorid 2% </td><td>nicht spezifiziert</td><td></td><td>Für topische Anästhesie</td></tr><tr><td> Lidocain Gel (Instillagel) </td><td>Farco-Pharma, Deutschland</td><td></td><td> Alternative Produkte anderer Anbieter </td></tr><tr><td>Normale Kochsalzlösung, steril, 200 ml</td><td>nicht spezifiziert</td><td><</td><td>p>Warm auf 30 &#176; C</td></tr><tr><td>10 ml Kegelendspritze (x10)</td><td>nicht näher bezeichnet</td><td></td><td> Zur Verabreichung von Lidocain </td></tr><tr><td>Intravenöse Kanüle 18 G</td><td>nicht näher bezeichnet</td><td></td><td> Zur Verabreichung von Midazolam </td></tr><tr><td> Midazolam </td><td>nicht näher bezeichnet</td><td></td><td> Für die Sedierung </td></tr><tr><td> Flumazenil </td><td>nicht näher bezeichnet</td><td></td><td> Umkehrung der Benzodiazepin-Sedierung (nur für den Notfall) </td></tr><tr><td>60 ml Kegelendspritzen (x4)</td><td>nicht spezifiziert</td><td></td><td>Für die normale Kochsalzinjektion und die Entnahme von BAL-Flüssigkeit. Möglicherweise ist ein Konnektor erforderlich, der an der Injektionsöffnung des Bronchoskops.</td></tr><tr><td> Steriler Mulltupfer </td><td>Vernaid, UK</td><<td>p></td><td> Alternative Produkte anderer Anbieter</tr><tr><td> > Steriler Behälter für BAL-Flüssigkeit </td><td>Siehe Text und</td> <td>Kommentare</td><td>Silikonisierte Glasflaschen reduzieren die Adhärenz von Makrophagen. Alternativ können 50 ml Zentrifugenröhrchen verwendet werden (Gesamtkapazität 200 ml)</td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td>Sigma, UK</td><<td>p>SL2</td><td> Nur bei Verwendung von silikonisierten Glasflaschen. NB: Gesundheitsschädlich und brennbar. Befolgen Sie bei Verwendung die Vorsichtsmaßnahmen, die in der Beschreibung des Herstellers beschrieben sind. s MSDS </td></tr><tr><td> Zentrifuge </td><td>nicht spezifiziert</td><td></td><td>Mindestens 4 x 50 ml Röhrchenkapazität. Kühlung auf 4 &#176; C bevorzugt.</td></tr><tr><td> Shandon Cytospin Zentrifuge </td><td>Thermo Scientific, UK</td><<td>p></td><td> Nur für die Differenzzählung </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Medium mit L-Glutamin </td><td>Sigma, UK</td><<td>p>R8758</td><td> Alternative Produkte anderer Anbieter </td></tr><tr><td> fötales Rinderserum </td><td>Sigma, UK</td><<td>p>F6178</td><td> Alternative Produkte anderer Anbieter </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td>Sigma, UK</td><td>P4333</p</td><td>> Alternative Produkte anderer Lieferanten </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td>Sigma, UK</td><<td>p>A2942</td><td> Alternative Produkte anderer Anbieter </td></tr><tr><td> Gewebekulturplatten </td><td>Greiner Bio-One, UK</td><<td>p>662160</td><td> Alternative Produkte anderer Anbieter </td></tr><tr><td> Glasobjektträger </td><td>nicht spezifiziert</td><td></td><td> Nur für Differenzzählung </td></tr><tr><td> Shandon Cytofunnel </td><td>Thermo Scientific, UK</td><<td>p>A78710003 </td><td> Nur für die Differenzzählung</tr><tr><td> > Shandon Cytoclip </td><td>Thermo Scientific, UK</td><<td>p>59910052</td><td> Nur für die Differenzzählung </td></tr><tr><td> Hemacolor Färbeset (Fixiermittel, rote und blaue Reagenzien) </td><td>Merck, Deutschland</td><td>111661</td><td> Anwendung je nach Hersteller" s Anleitung</S> </td></tr></tbody></table>

bronchoalveoläre lavage (bal) für forschung, beschaffung angemessene probenausbeute

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

Wir beschreiben eine Technik für die Forschung Bronchoskopie mit BAL (BAL) mit manuellen Hand Sog, um nicht-adhärenten Zellen und Lunge Futter Flüssigkeit aus der Schleimhautoberfläche zu entfernen. In Forschungsumgebungen ermöglicht BAL Abtastung angeborenen (Lunge Makrophagen), Mobil (B-und T-Zellen) und die humorale (Immunglobulin)-Antworten innerhalb der Lunge. BAL ist international für Forschungszwecke akzeptiert und seit 1999 die Technik in&gt; 1.000 Probanden in Großbritannien und Malawi von unserer Gruppe durchgeführt. Unsere Technik nutzt sanfte Hand Absaugen von Flüssigkeit eingeflößt, dies ist für die Maximierung der BAL-Volumen zurückgeführt und gelten Mindestscherkraft auf Flimmerepithelien, um die Struktur und Funktion von Zellen in der BAL-Flüssigkeit erhalten und lebensfähig zu erhalten, um das Wachstum zu erleichtern von Zellen in ex-vivo-Kultur. Die Forschungstechnik verwendet daher ein größeres Volumen insDestillat (typischerweise in der Größenordnung von 200 ml) und beschäftigt manuelle Absaugung, um Zellschäden zu reduzieren. Die Patienten werden Lokalanästhetikum gegeben, bot Sedierung (Midazolam), und gut vertragen das Verfahren mit minimalen Nebenwirkungen. Mündliche und schriftliche Fachinformationen verbessert die Toleranz und eine schriftliche Einverständniserklärung ist Pflicht. Sicherheit der Person im Vordergrund steht. Themen werden sorgfältig mit klarem und Ausschlusskriterien ausgewählt. Dieses Protokoll enthält eine Beschreibung der möglichen Risiken und die Schritte unternommen, um sie zu mildern, eine Liste der Kontraindikationen, Pre-und Post-Prozedur überprüft, sowie präzise Bronchoskopie-und Labortechnik.

Gute klinische Ergebnisse sind ein BAL Volumen von über 100 ml und ein Thema, die in den meisten erlebt hat, kleinere Beschwerden (siehe Tabelle 1). Dies erfordert eine entspannte und kooperative Thema. Der Arzt muss sicher sein, voll und ganz bereit (Werkstoffe) und Verständnis gegenüber der Freiwilligen. Inter-und intraindividuelle Variabilität in der Zellausbeute (einschließlich Differentialblut) beschrieben worden. Differentialzellzählungen von gesunden Probanden in der Regel&gt; 90% Makrophagen, die mit einer kleinen Anzahl von Neutrophilen (&lt;2%) und Lymphozyten (5-10%). BAL-Zellen auf Objektträger zentrifugiert, kann mit einem Differenzkernfärbung angefärbt werden, um diese Informationen (Abbildung 1) zu erhalten. In Fig. 1 sind BAL-Zellen wurden fixiert und gefärbt mit Hemacolor Färbung nach den Anweisungen des Herstellers. Mindestens 300 Zellen gezählt, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, werden Makrophagen,Neutrophile und Lymphozyten; 500 Zellen für seltener Zelltypen. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Gefahr </td><td> Risiko </td><td> In diesem Protokoll reduziert nach: </td></tr><tr><td colspan="3"> Wirkung der Bronchoskopie und BAL 1, 14 </td></tr><tr><td> Leichte Beschwerden </td><td> &lt;25% 14 # </td><td> Entsprechende Analgesie und Sedierung. Zuversichtlich und fürsorgliche Umgang mit dem Thema. </td></tr><tr><td> Nasenbluten </td><td> &lt;1% # </td><td> Mild Druck für nur nasale Intubation. Wenn unterliegen Beschwerden oder verengte Öffnung - orale Intubation statt. </td></tr><tr><td> Endobronchial Blutung (Bluthusten) </td><td> &lt;0,1% * 15 </td><td> Keine Biopsien entnommen. Eine sorgfältige Kontrolle während der Bronchoskopie - Vermeidung Schleimhaut der Atemwege. </td></tr><tr><td> Nausea, Erbrechen und Aspiration Pneumonie </td><td> &lt;0,02% 14, # </td><td> Fasten für feste Nahrung&gt; 4 Std. Vorverfahren ein. Angemessene Lokalanästhesie. Semirecumbent Position während der Prozedur. Sorgfältige Beobachtung post-Verfahren. </td></tr><tr><td> Fieber </td><td> 0,01 14-1% #, 16 </td><td> Bezieht sich auf die Entzündung und kann durch maximal Sammlung von BAL minimiert. Einzellappen BAL nur. # </td></tr><tr><td> Wunde Nase / Rachen und Heiserkeit </td><td> &lt;25% 14 # </td><td> Angemessene Lokalanästhesie von Nase, Rachen und Kehlkopf (Minimierung Husten). </td></tr><tr><td> Infektion </td><td> &lt;0,1% der HIV-negativen, 1% der HIV-positiven 14, # </td><td> Standard-Bronchoskop Waschverfahren ein. Einzellappen BAL nur. # Frühzeitiges Erkennen der Infektion: klinische Prüfung innerhalb 1 Stunde eind klinischen Kontakt 1-5 Tage nach der Bronchoskopie. </td></tr><tr><td> Brustschmerzen / Husten </td><td> &lt;0,2% 14, # </td><td> Einzellappen nur BAL. Maximal BAL-Sammlung. # </td></tr><tr><td colspan="3"> Auswirkungen von Drogen: Lidocain, Midazolam </td></tr><tr><td> Arrhythmie </td><td> Sehr selten * </td><td rowspan="3"> Maximal 5 mg / kg 14 Lidocain verwendet. Erwärmt normaler Kochsalzlösung getropft. # Pulsoximetrie (sats&gt; 90% mit Sauerstoff Ergänzung), Herzüberwachung im gesamten Verfahren. Benzodiazepine Antagonisten (Flumazenil) sofort verfügbar. </td></tr><tr><td> Desorientierung / Agitation </td><td> &lt;0,1% † # </td></tr><tr><td> Cardio Atemdepression </td><td> Sehr selten * </td></tr></tbody></table> * Nicht in unserer Gruppe in über 1.500 Forschungsverfahren erlebt. † idiosyncratic eher als Dosis-abhängige Reaktion. # Erfahrung unserer Gruppe in über 1.500 Forschungsverfahren. Tabelle 1. Risiken im Zusammenhang mit BAL für Forschung verbunden. Dies schließt die Gefahr oder ein Risiko und wie diese unter Verwendung der beschriebenen Technik reduziert. Auswirkungen der Bronchoskopie / BAL und Auswirkungen von Arzneimitteln verwendet werden, enthalten. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/4345/4345fig1highres.jpg" width="500" /> Fig. 1 ist. Ein Objektträger Zeige BAL Makrophagen und Neutrophile Gelegentliche. BAL-Zellen in Methanol fixiert und mit Hemacolor rot (Eosin Y) und Blau (Azur B) gefärbt.

Wir beschreiben eine Technik für die Forschung Bronchoskopie und BAL mit Niederdruck-Absaugung. Die Technik wird verwendet, um die Immunzellen aus der Lunge bronchoalveolären Oberflächen ernten. Lokalanästhesie und milden Sedierung (Midazolam) verwendet. Themen vertragen die Prozedur gut und Erfahrung minimalen Nebenwirkungen.

Bronchoalveoläre Lavage (BAL) für Forschung, Beschaffung angemessene Probenausbeute

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Bronchoalveoläre Lavage sicher und wirksam durchzuführen. Dies wird zunächst dadurch erreicht, dass die Sicherheit, Kooperation und der Komfort der ausgewählten Probanden gewährleistet werden, unter Verwendung klar definierter Einschluss- und Ausschlusskriterien.Vor der Prozedur durchgeführte Kontrollen und Beobachtungen werden ebenfalls vorgenommen. Anschließend, einmal im Bronchoskopieraum, nach Überprüfung sämtlicher Geräte, erhält der Proband ein Lokalanästhetikum und es wird eine bewusste Sedierung angeboten. Danach, nach Intubation der Stimmbänder, wird das Bronchoskop in eine geeignete Position innerhalb des rechten mittleren Lungenlappens (RML) vorgeschoben.Dies gewährleistet eine gute Ausbeute an BAL-Flüssigkeitsvolumen. Schließlich wird die BAL-Flüssigkeit mittels sanfter manueller Absaugung gewonnen und unverzüglich auf Eis transportiert, um eine sofortige laboranalytische Verarbeitung zu ermöglichen. Letztendlich ermöglicht diese Technik die Gewinnung von Zellen und erhält deren Vitalität, um das Wachstum von Zellen in einer ex vivo-Kultur zu fördern.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, die von Pneumologen und Intensivmedizinern häufig als Bronchialwäsche, Bronchoalveoläre Lavage oder Darm-Lavage bezeichnet werden und darauf abzielen, diagnostische oder therapeutische Vorteile zu erzielen, liegt darin, dass unsere Methode eine sanfte manuelle Absaugung der zugeführten Flüssigkeit verwendet. Diese ist darauf ausgelegt, das zurückgewonnene Darmvolumen zu maximieren und eine minimale Scherkraft auf das Flimmerepithel auszuüben, um Struktur und Funktion der Zellen in der Darmflüssigkeit zu erhalten. Der Eingriff der bronchoalveolären Lavage wird ambulant durchgeführt, begleitet von geeigneten vor- und nachgelagerten Untersuchungen gemäß der geltenden Krankenhausrichtlinie, einschließlich der Gewährleistung, dass das schriftliche Einwilligungsformular korrekt unterschrieben und datiert ist.Bei der Ankunft wird der Proband von der Atemwegsforschungsschwester empfangen, die anschließend alle erforderlichen vorprozeduralen Kontrollen durchführt, darunter die Überprüfung, ob der Proband mindestens vier Stunden lang nichts Festes und zwei Stunden lang keine Flüssigkeiten zu sich genommen hat. Wenn der Proband alle erforderlichen Kriterien erfüllt, zieht er sich einen Krankenhauskittel an, und vorprozedurale Untersuchungen – einschließlich der Messung von Blutdruck, Herzfrequenz und Sauerstoffsättigung – werden durchgeführt. Eine Kanüle mit kleinem Durchmesser wird idealerweise in die linke Hand eingeführt.Dieser Zustand bleibt bis zum Ende der postprozeduralen Erholungsphase in C zwei bestehen. Anschließend wird der Proband in den Bronchoskopieraum verlegt, in dem ein erfahrener respiratorischer Forschungsbronchoskopist anwesend ist. Anschließend werden Überwachungsgeräte am Probanden angebracht.Dazu gehören ein Dreikanal-EKG, ein Atemwegsmanometer und ein Pulsoximeter. Eine anästhesiologische Unterstützung ist nicht erforderlich. Nasenkanülen werden bei allen Probanden vor dem Einführen des Bronchoskops angelegt; Sauerstoff wird verabreicht, wenn die Sättigung unter 96 % fällt, mit bis zu vier Litern pro Minute.An diesem Punkt führt der Bediener Vorbereitungsprüfungen am Bronchoskop durch. Dazu gehört die Überprüfung einer wirksamen Absaugung durch Aspiration von steriler isotonischer Kochsalzlösung. Sobald der Bediener sicher ist, dass das Bronchoskop optimal funktioniert, wird eine topische Anästhesie mittels Applikation von Instillagel an den Nasengängen und von Xylocain an der Mundschleimhaut des Probanden verabreicht.Falls eine Sedierung angezeigt ist und vom Probanden gewünscht wurde, wird eine geeignete Dosis Midazolam intravenös verabreicht. Wie bei allen Verfahren unter Anästhesie sollte ein geeignetes Gegenmittel unverzüglich verfügbar sein. Stellen Sie außerdem sicher, dass auch Reanimationsausrüstung bereitsteht.Die Intubation erfolgt über die Nase. Falls dies nicht möglich ist, kann die Intubation über den Mund durchgeführt werden, sofern eine geeignete Mundsperrkarte am Kehlkopf verwendet wird. Nach dem Passieren der Stimmbänder wird eine topische Analgesie mit vier bis sechs Millilitern 4%igem Lidocain verabreicht.Außerdem wird eine Schleimhautanästhesie mittels zweier Aliquote von jeweils zwei Milliliter 2 %igem Lidocain an der Carina an der Aufteilung des rechten unteren Lappens und des rechten mittleren Lappens oder RML sowie am Eingang des RML verabreicht. Schließlich erreicht das Bronchoskop den rechten mittleren Lappen und sollte idealerweise im medialen Segment in einer sicheren distalen Position platziert sein. Führen Sie den Wink-Test unter Verwendung der Absaugtaste durch, um sicherzustellen, dass das Bronchoskop nicht zu distal positioniert ist, was zu einem Atemwegskollaps führen könnte.Vier 60-Milliliter-Spritzen werden mit einem Volumen von jeweils 60 Milliliter, zwei mit 50 Milliliter und eine mit 40 Milliliter erwärmter, steriler Kochsalzlösung vorgefüllt. Sobald Proband und Bronchoskopierer bereit sind, wird die erste Spritze mit Kochsalzlösung von der Bronchoskopieassistentin oder dem Bronchoskopieassistenten instilliert. Während der Bronchoskopierer die Position im rechten mittleren Lappen (RML) beibehält, führt die Assistentin oder der Assistent eine sanfte Handsaugung über denselben Port und dieselbe Spritze durch.Das Verfahren wird anschließend noch dreimal wiederholt, wobei nacheinander jede der Spritzen verwendet wird, wobei ein maximales Volumen von 200 Milliliter bei dieser spezifischen Technik zum Einsatz kommt. Die gewonnene BAL-Flüssigkeit wird vorsichtig in Plastikgefäße abgegeben, die möglicherweise bereits silikonisiert sind und auf schmelzendem Eis aufbewahrt werden. Die Silikonisierung hemmt die Zelladhäsion und maximiert die Zellrückgewinnung. Die BAL-Flüssigkeit erscheint trüb gegen das Licht, mit Oberflächenblasen, die durch Proteine und Tenside gebildet werden.Schließlich wird das Bronchoskop langsam vollständig zurückgezogen. Der Proband wird zur überwachten Erholung weitergeleitet, und die BAL-Flüssigkeit wird unverzüglich auf Eis transportiert. Für eine sofortige Verarbeitung darf der Proband sich bis zu vier Stunden lang unter der Betreuung einer respiratorischen Forschungspflegekraft erholen.Während dieser Zeit darf die Versuchsperson ruhen, jedoch nicht essen oder trinken, bis mindestens 60 Minuten nach dem Eingriff verstrichen sind. Danach, sobald die Schluckfähigkeit als sicher eingestuft wurde, soll das Aspirationsrisiko verringert werden. Die postprozeduralen Beobachtungen werden überwacht und dokumentiert.Die klinische Untersuchung erfolgt vor der Entlassung. Der Proband erhält zudem eine Aufklärung über die häufigen Nebenwirkungen und eine Kontaktnummer für den Fall, dass erhebliche Nebenwirkungen auftreten. Ein Arzt oder eine Krankenschwester führt einen Nachsorgetermin mit dem Probanden ein bis fünf Tage nach dem Eingriff durch.Dies kann entweder telefonisch oder persönlich erfolgen. Sobald sich die Probe im Forschungslabor befindet, müssen alle Handgriffe auf nassem Eis durchgeführt werden, sofern möglich.Zunächst notieren Sie das Volumen der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit. Anschließend filtrieren Sie die Flüssigkeit durch eine doppelte Schicht steriler Mulltampons, um Schleimpfropfen zu entfernen, und sammeln das Filtrat in sterilen 50 Milliliter. Zentrifugenröhrchen pelletieren die Zellen durch Zentrifugation bei 500 G bei vier Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten.Entfernen Sie das Überstand und waschen Sie mit 50 Milliliter kalter isotonischer Kochsalzlösung. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Resuspendieren Sie die Zellen erneut in einem geeigneten Volumen Kulturmedium.Normalerweise ergeben zwei Milliliter eine geeignete Zelldichte für die Zählung. Führen Sie anschließend die Zellzählung unter Verwendung eines Hämocytometers und Trypanblau gemäß Standardverfahren durch und stellen Sie die Dichte der Zellsuspension durch Zugabe eines geeigneten Volumens Medium auf eine Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter ein. Überführen Sie dann ein Milliliter der Zellsuspension in jedes Loch einer 24er-Platte.Die Zellen in der Mehrlochplatte bei 37 Grad Celsius drei Stunden lang inkubieren, um die Adhärenz der Makrophagen für die Lymphozytenarbeit zu ermöglichen. Nach drei Stunden Inkubation wird das Kulturmedium vorsichtig dreimal auf- und abpipettiert und gesammelt. Dieses Medium enthält Lymphozyten und nicht-adhärente Makrophagen und kann zur Beurteilung der Lymphozytenfunktion verwendet werden.Sie kann auch in weiteren Reinigungsschritten für Arbeiten mit Makrophagen verwendet werden. Nach dreistündiger Inkubation das Medium vorsichtig abpipettieren und durch frisches, warmes Medium ohne Antibiotika ersetzen; die Makrophagen haften hier an der Zellkulturschale. BAL-Zellen wurden mithilfe einer Thermo Shandon-Zytosentrifuge auf einen Objektträger zentrifugiert und mit einer differentiellen Kernfärbung gefärbt, um die Zelltypen sichtbar zu machen.Die meisten Zellen sind Makrophagen, wie die mit M gekennzeichnete Zelle, aber gelegentlich sind auch ein Neutrophiler, markiert mit N, und ein Lymphozyt, markiert mit L, zu sehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Bronchoskopie und Bronchoalveoläre Lavage sicher und effektiv zu Forschungszwecken durchführt, wobei insbesondere eine gute Anästhesie der Zungenwurzel und des hinteren Oropharynx, die Überprüfung des Bronchoskops auf wirksame Absaugung und das Fehlen von Luftlecks vor dem Eingriff sowie die Wahl des am besten geeigneten subsegmentalen Zweigs des rechten mittleren Lappens wichtig sind. Operateure sollten bei Probanden mit minimalen Nebenwirkungen durchgängig mehr als hundert Milliliter Bronchoalveoläre Lavage gewinnen.

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Medicine

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Quelle: Venuprasad, K., et al. Intratracheale Verabreichung von Haemophilus influenzae in Mausmodellen zur Untersuchung von Atemwegsentzündungen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Entnahme und Verarbeitung von bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit aus einer euthanasierten Maus, die mit nicht typisierbaren Haemophilus influenzae infiziert war, für die nachgelagerte Analyse.

Entnahme von bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit aus einem Mausmodell, das mit nicht typisierbarem Haemophilus influenzae infiziert war

Dieses Video zeigt die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Identifizierung und Zählung verschiedener Immunzellen in bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit. Zunächst werden einzelne Immunzellen mit einem Viabilitätsfarbstoff identifiziert, gefolgt von einer differentiellen Färbung von Oberflächenmarkerproteinen, die eine genaue Zählung der einzelnen Zelltypen ermöglicht.

Identifizierung und Zählung von Immunzellen in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit mittels Durchflusszytometrie

Die Immunantwort des Wirts auf Pathogen-Infektion ist eine streng reguliert Prozess. Mit Hilfe eines Lipopolysaccharid Lungenexpositionsmodell in Mäusen, ist es möglich, hochauflösende Auswertungen der komplexen Mechanismen der Krankheitsentstehung verbunden durch.

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Dieser Artikel beschreibt bronchoskopischen Techniken in der Rinderlunge unter experimentellen Bedingungen, dh bronchoskopisch geführt Inokulation BAL-, Bronchial-Bürsten, und transbronchiale Lungenbiopsie.

Die Bovine Lung in der biomedizinischen Forschung: Optisch Geführte Bronchoskopie, intrabronchial Inokulation und<em&gt; In Vivo</em&gt; Sampling-Techniken

Der Gesundheitszustand der Lunge spiegelt sich in der Art und Anzahl der Immunzellen, die in den Bronchiolen der Lunge vorhanden sind. Wir beschreiben eine bronchoalveoläre Lavagetechnik, die die Isolierung und Untersuchung von nichtadhärenten Zellen und löslichen Faktoren aus dem unteren Atemtrakt der Mäuse ermöglicht.

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Bronchoalveoläre Lavage (BAL) für Forschung, Beschaffung angemessene Probenausbeute

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