Bronchoalveoläre Lavage (BAL) für Forschung, Beschaffung angemessene Probenausbeute

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Bronchoalveoläre Lavage sicher und wirksam durchzuführen. Dies wird zunächst dadurch erreicht, dass die Sicherheit, Kooperation und der Komfort der ausgewählten Probanden gewährleistet werden, unter Verwendung klar definierter Einschluss- und Ausschlusskriterien.

Vor der Prozedur durchgeführte Kontrollen und Beobachtungen werden ebenfalls vorgenommen. Anschließend, einmal im Bronchoskopieraum, nach Überprüfung sämtlicher Geräte, erhält der Proband ein Lokalanästhetikum und es wird eine bewusste Sedierung angeboten. Danach, nach Intubation der Stimmbänder, wird das Bronchoskop in eine geeignete Position innerhalb des rechten mittleren Lungenlappens (RML) vorgeschoben.

Dies gewährleistet eine gute Ausbeute an BAL-Flüssigkeitsvolumen. Schließlich wird die BAL-Flüssigkeit mittels sanfter manueller Absaugung gewonnen und unverzüglich auf Eis transportiert, um eine sofortige laboranalytische Verarbeitung zu ermöglichen. Letztendlich ermöglicht diese Technik die Gewinnung von Zellen und erhält deren Vitalität, um das Wachstum von Zellen in einer ex vivo-Kultur zu fördern.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, die von Pneumologen und Intensivmedizinern häufig als Bronchialwäsche, Bronchoalveoläre Lavage oder Darm-Lavage bezeichnet werden und darauf abzielen, diagnostische oder therapeutische Vorteile zu erzielen, liegt darin, dass unsere Methode eine sanfte manuelle Absaugung der zugeführten Flüssigkeit verwendet. Diese ist darauf ausgelegt, das zurückgewonnene Darmvolumen zu maximieren und eine minimale Scherkraft auf das Flimmerepithel auszuüben, um Struktur und Funktion der Zellen in der Darmflüssigkeit zu erhalten. Der Eingriff der bronchoalveolären Lavage wird ambulant durchgeführt, begleitet von geeigneten vor- und nachgelagerten Untersuchungen gemäß der geltenden Krankenhausrichtlinie, einschließlich der Gewährleistung, dass das schriftliche Einwilligungsformular korrekt unterschrieben und datiert ist.

Bei der Ankunft wird der Proband von der Atemwegsforschungsschwester empfangen, die anschließend alle erforderlichen vorprozeduralen Kontrollen durchführt, darunter die Überprüfung, ob der Proband mindestens vier Stunden lang nichts Festes und zwei Stunden lang keine Flüssigkeiten zu sich genommen hat. Wenn der Proband alle erforderlichen Kriterien erfüllt, zieht er sich einen Krankenhauskittel an, und vorprozedurale Untersuchungen – einschließlich der Messung von Blutdruck, Herzfrequenz und Sauerstoffsättigung – werden durchgeführt. Eine Kanüle mit kleinem Durchmesser wird idealerweise in die linke Hand eingeführt.

Dieser Zustand bleibt bis zum Ende der postprozeduralen Erholungsphase in C zwei bestehen. Anschließend wird der Proband in den Bronchoskopieraum verlegt, in dem ein erfahrener respiratorischer Forschungsbronchoskopist anwesend ist. Anschließend werden Überwachungsgeräte am Probanden angebracht.

Dazu gehören ein Dreikanal-EKG, ein Atemwegsmanometer und ein Pulsoximeter. Eine anästhesiologische Unterstützung ist nicht erforderlich. Nasenkanülen werden bei allen Probanden vor dem Einführen des Bronchoskops angelegt; Sauerstoff wird verabreicht, wenn die Sättigung unter 96 % fällt, mit bis zu vier Litern pro Minute.

An diesem Punkt führt der Bediener Vorbereitungsprüfungen am Bronchoskop durch. Dazu gehört die Überprüfung einer wirksamen Absaugung durch Aspiration von steriler isotonischer Kochsalzlösung. Sobald der Bediener sicher ist, dass das Bronchoskop optimal funktioniert, wird eine topische Anästhesie mittels Applikation von Instillagel an den Nasengängen und von Xylocain an der Mundschleimhaut des Probanden verabreicht.

Falls eine Sedierung angezeigt ist und vom Probanden gewünscht wurde, wird eine geeignete Dosis Midazolam intravenös verabreicht. Wie bei allen Verfahren unter Anästhesie sollte ein geeignetes Gegenmittel unverzüglich verfügbar sein. Stellen Sie außerdem sicher, dass auch Reanimationsausrüstung bereitsteht.

Die Intubation erfolgt über die Nase. Falls dies nicht möglich ist, kann die Intubation über den Mund durchgeführt werden, sofern eine geeignete Mundsperrkarte am Kehlkopf verwendet wird. Nach dem Passieren der Stimmbänder wird eine topische Analgesie mit vier bis sechs Millilitern 4%igem Lidocain verabreicht.

Außerdem wird eine Schleimhautanästhesie mittels zweier Aliquote von jeweils zwei Milliliter 2 %igem Lidocain an der Carina an der Aufteilung des rechten unteren Lappens und des rechten mittleren Lappens oder RML sowie am Eingang des RML verabreicht. Schließlich erreicht das Bronchoskop den rechten mittleren Lappen und sollte idealerweise im medialen Segment in einer sicheren distalen Position platziert sein. Führen Sie den Wink-Test unter Verwendung der Absaugtaste durch, um sicherzustellen, dass das Bronchoskop nicht zu distal positioniert ist, was zu einem Atemwegskollaps führen könnte.

Vier 60-Milliliter-Spritzen werden mit einem Volumen von jeweils 60 Milliliter, zwei mit 50 Milliliter und eine mit 40 Milliliter erwärmter, steriler Kochsalzlösung vorgefüllt. Sobald Proband und Bronchoskopierer bereit sind, wird die erste Spritze mit Kochsalzlösung von der Bronchoskopieassistentin oder dem Bronchoskopieassistenten instilliert. Während der Bronchoskopierer die Position im rechten mittleren Lappen (RML) beibehält, führt die Assistentin oder der Assistent eine sanfte Handsaugung über denselben Port und dieselbe Spritze durch.

Das Verfahren wird anschließend noch dreimal wiederholt, wobei nacheinander jede der Spritzen verwendet wird, wobei ein maximales Volumen von 200 Milliliter bei dieser spezifischen Technik zum Einsatz kommt. Die gewonnene BAL-Flüssigkeit wird vorsichtig in Plastikgefäße abgegeben, die möglicherweise bereits silikonisiert sind und auf schmelzendem Eis aufbewahrt werden. Die Silikonisierung hemmt die Zelladhäsion und maximiert die Zellrückgewinnung. Die BAL-Flüssigkeit erscheint trüb gegen das Licht, mit Oberflächenblasen, die durch Proteine und Tenside gebildet werden.

Schließlich wird das Bronchoskop langsam vollständig zurückgezogen. Der Proband wird zur überwachten Erholung weitergeleitet, und die BAL-Flüssigkeit wird unverzüglich auf Eis transportiert. Für eine sofortige Verarbeitung darf der Proband sich bis zu vier Stunden lang unter der Betreuung einer respiratorischen Forschungspflegekraft erholen.

Während dieser Zeit darf die Versuchsperson ruhen, jedoch nicht essen oder trinken, bis mindestens 60 Minuten nach dem Eingriff verstrichen sind. Danach, sobald die Schluckfähigkeit als sicher eingestuft wurde, soll das Aspirationsrisiko verringert werden. Die postprozeduralen Beobachtungen werden überwacht und dokumentiert.

Die klinische Untersuchung erfolgt vor der Entlassung. Der Proband erhält zudem eine Aufklärung über die häufigen Nebenwirkungen und eine Kontaktnummer für den Fall, dass erhebliche Nebenwirkungen auftreten. Ein Arzt oder eine Krankenschwester führt einen Nachsorgetermin mit dem Probanden ein bis fünf Tage nach dem Eingriff durch.

Dies kann entweder telefonisch oder persönlich erfolgen. Sobald sich die Probe im Forschungslabor befindet, müssen alle Handgriffe auf nassem Eis durchgeführt werden, sofern möglich.

Zunächst notieren Sie das Volumen der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit. Anschließend filtrieren Sie die Flüssigkeit durch eine doppelte Schicht steriler Mulltampons, um Schleimpfropfen zu entfernen, und sammeln das Filtrat in sterilen 50 Milliliter. Zentrifugenröhrchen pelletieren die Zellen durch Zentrifugation bei 500 G bei vier Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten.

Entfernen Sie das Überstand und waschen Sie mit 50 Milliliter kalter isotonischer Kochsalzlösung. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Resuspendieren Sie die Zellen erneut in einem geeigneten Volumen Kulturmedium.

Normalerweise ergeben zwei Milliliter eine geeignete Zelldichte für die Zählung. Führen Sie anschließend die Zellzählung unter Verwendung eines Hämocytometers und Trypanblau gemäß Standardverfahren durch und stellen Sie die Dichte der Zellsuspension durch Zugabe eines geeigneten Volumens Medium auf eine Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter ein. Überführen Sie dann ein Milliliter der Zellsuspension in jedes Loch einer 24er-Platte.

Die Zellen in der Mehrlochplatte bei 37 Grad Celsius drei Stunden lang inkubieren, um die Adhärenz der Makrophagen für die Lymphozytenarbeit zu ermöglichen. Nach drei Stunden Inkubation wird das Kulturmedium vorsichtig dreimal auf- und abpipettiert und gesammelt. Dieses Medium enthält Lymphozyten und nicht-adhärente Makrophagen und kann zur Beurteilung der Lymphozytenfunktion verwendet werden.

Sie kann auch in weiteren Reinigungsschritten für Arbeiten mit Makrophagen verwendet werden. Nach dreistündiger Inkubation das Medium vorsichtig abpipettieren und durch frisches, warmes Medium ohne Antibiotika ersetzen; die Makrophagen haften hier an der Zellkulturschale. BAL-Zellen wurden mithilfe einer Thermo Shandon-Zytosentrifuge auf einen Objektträger zentrifugiert und mit einer differentiellen Kernfärbung gefärbt, um die Zelltypen sichtbar zu machen.

Die meisten Zellen sind Makrophagen, wie die mit M gekennzeichnete Zelle, aber gelegentlich sind auch ein Neutrophiler, markiert mit N, und ein Lymphozyt, markiert mit L, zu sehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Bronchoskopie und Bronchoalveoläre Lavage sicher und effektiv zu Forschungszwecken durchführt, wobei insbesondere eine gute Anästhesie der Zungenwurzel und des hinteren Oropharynx, die Überprüfung des Bronchoskops auf wirksame Absaugung und das Fehlen von Luftlecks vor dem Eingriff sowie die Wahl des am besten geeigneten subsegmentalen Zweigs des rechten mittleren Lappens wichtig sind. Operateure sollten bei Probanden mit minimalen Nebenwirkungen durchgängig mehr als hundert Milliliter Bronchoalveoläre Lavage gewinnen.