Name: 寡肽测定气相酸性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学习使用Cook动力学方法测定含半胱氨酸寡肽的气相酸性。该方法通过生成质子结合簇离子并进行碰撞诱导解离实验，消除溶剂效应，为生物有机化学研究提供准确的肽酸性数据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由美国国家科学基金会（CHE-0749737）资助。仪器使用由太平洋大学质谱中心提供支持。

1. 样品溶液的制备
<ol>
	<li>首先使用体积比为1:1的甲醇和水混合溶剂配制肽和六种参考酸的储备液，储备液浓度应约为10-3 M。</li>
	<li>称取1 mg固体肽样品A3CH于1.5 ml离心管中，加入1.0 ml甲醇与水的混合溶剂，使用涡旋振荡器混匀。</li>
	<li>称取1 mg二氟乙酸（DFAH），加入1.0 ml甲醇与水的混合溶剂，使用涡旋振荡器混匀。</li>
	<li>采用相同方法配制其余五种参考酸——氯乙酸（MCAH）、溴乙酸（MBAH）、二氯乙酸（DCAH）、二溴乙酸（DBAH）和三氟乙酸（TFAH）的储备液。</li>
	<li>取约50 μl肽储备液加入1.5 ml离心管中，再加入约50 μl DFAH储备液。用900 μl甲醇与水的混合溶剂稀释该混合溶液，使终浓度约为10-4 M。该稀释后的溶液将用于质谱检测。肽与参考酸的实际比例以及样品溶液的最终浓度将根据质谱仪中观测到的离子信号强度进行调整。</li>
	<li>采用相同方法制备肽与其余五种参考酸的样品溶液。</li>
</ol>
2. 质谱测量 1：质子化团簇离子形成
<ol>
	<li>质谱测量的第一步是使肽与参考酸生成稳定的质子结合簇离子。</li>
	<li>将仪器设为负离子质谱模式，电喷雾电离针电压为 -4.5 kV，毛细管电压约为 -35 V，干燥气体温度维持在 150 °C。将 Q1 和 Q3 的峰宽均设置为校准标度（峰宽是可用于调节峰分辨率的仪器参数，“校准标度”设置可显示较窄的峰，以实现更好的峰分离）。可根据需要调整毛细管电压和干燥气体温度，以增强观测到的离子丰度。</li>
	<li>将约0.5 ml的肽-DFAH样品溶液注入1 ml Hamilton注射器中，并使用PEEK管将注射器连接至ESI针入口。然后将注射器置于注射泵上。开启注射泵，以10 μl/min的流速将样品溶液注入ESI针中。</li>
	<li>打开ESI针电压以启动ESI过程。开启检测器。应在轮廓模式下观察到质谱图显示。如果显示为质心模式，请切换至轮廓模式。通过监测质子结合簇离子在以下质荷比处的峰来观察其形成： m/z 428. 可通过微调仪器来调节簇离子的信号丰度。其中一个重要参数是毛细管电压。可通过手动改变毛细管电压（通常在 -20 至 -50 V 范围内）以最大化 m/z 428 处峰的丰度。</li>
</ol>
3. 质谱测量 2：CID 分级实验
<ol>
	<li>下一步是进行CID bracketing实验。</li>
	<li>当团簇离子的丰度达到理想值（约 100 mV）时，将仪器切换至 MS/MS 模式。在此模式下，Q1 作为质量过滤器用于分离团簇离子，Q2 作为碰撞池，Q3 作为质量分析器。</li>
	<li>将碰撞气（此处为氩气）压力设置为 0.5 mTorr，碰撞能量设置为 17 eV。在质谱显示窗口中应观察到三个峰。位于 m/z 428 对应于簇离子 [DFA•H•A3CS]¯。位于 m/z 332 和 m/z 95 对应去质子化肽（A3CS¯）和去质子化的二氟乙酸（DFA¯）。较小的峰位于 m/z 298 是去质子化肽段产生的二级碎片离子。采集该离子的 CID 谱图，持续 2 分钟。 图3a.</li>
	<li>进行类似的CID实验，并采集溴乙酸（MBAH）修饰肽样品溶液的CID质谱图， 图 3b.</li>
	<li>对含有其他所有参照酸的肽样品溶液进行类似的CID实验，并采集其CID谱图。所得CID谱图在定性上将类似于 图3a和图3b，但质荷比（m/z）值和相对峰高会有所不同。</li>
</ol>
4. 质谱测量法 3：动力学方法
<ol>
	<li>最后一步是采集SRM谱图。</li>
	<li>将谱图显示模式切换为质心模式（centroid），并将仪器设置为选择反应监测（SRM）模式。保持第一四极杆（Q1）选择隔离 m/z 428 的离子，并在第三四极杆（Q3）中填入四个待监测的质量数（质荷比）。这四个质量数分别为 m/z 428（簇离子）、m/z 332（肽离子）、m/z 298（肽离子的碎片）和 m/z 95（DFA¯ 离子）。保持碰撞气压力为 0.5 mTorr。</li>
	<li>将碰撞能量设为 11.7 eV，并采集 5 分钟的谱图。</li>
	<li>将碰撞能量改为 17.6 eV，并采集 5 分钟的谱图。</li>
	<li>依次将碰撞能量改为 23.4 eV 和 29.3 eV，并在每个碰撞能量下分别采集 5 分钟的谱图。</li>
	<li>对含有其他所有参考酸的肽样品进行类似的测量。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>将所有 SRM 谱图中的离子强度值复制到 Excel 工作表中。</li>
	<li>计算在四种碰撞能量下测得的全部六个质子结合簇的 CID 产物离子分支比，即 ln([A¯]/[Ai¯])。示例数值见表 1。</li>
	<li>将 ln([A¯]/[Ai¯]) 的数值对 ΔacidHi - ΔacidHavg 作图。将得到对应于四种碰撞能量的四幅图，见图 4a。</li>
	<li>通过线性回归分析四幅图，提取斜率和截距的数值。在本例中，斜率为正值，截距为负值。用符号“X”表示斜率，用符号“Y”表示截距。结果见表 2。将 Y 的数值乘以 -1，并用符号 Y' 表示所得正值（以便 y 轴显示正值）。注意：此转换为可选步骤，只要在下一步作图时使用相应的数值即可。</li>
	<li>将 Y' 的数值对 X 作图，见图 4b。对该图进行线性回归分析，得到斜率为 1.706，截距为 -0.536。该斜率对应于 ΔacidH - ΔacidHavg。已知 ΔacidHavg 为 330.5 kcal/mol，该值由所选参考酸的集合确定。由此斜率可得肽的气相酸度值：ΔacidH(A3CH) = 332.2 kcal/mol。</li>
</ol>

<ol><li>Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empirical+relationships+between+protein+structure+and+carboxyl+pKa+values+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3A+Struct.+Funct.+Genet%22%5BJournal%5D)">Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins.</a> Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).</li>
<li>Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+single+aspartate+on+helix+stability+at+different+positions+in+a+neutral+alanine-based+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide.</a> Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).</li>
<li>Takahashi, N., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Reactivity+and+Ionization+of+the+Active+Site+Cysteine+Residues+of+Escherichia+coli+Thioredoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin.</a> Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).</li>
<li>Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+thioltransferase+-+the+active+site+cysteines+display+differential+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Yeast thioltransferase - the active site cysteines display differential reactivity.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).</li>
<li>Philipps, B., Glockshuber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomization+of+the+Entire+Active-site+Helix+alpha+1+of+the+Thiol-disulfide+Oxidoreductase+DsbA+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).</li>
<li>Joshi, H. V., Meier, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+a+peptide+helix+macrodipole+on+the+pKa+of+an+Asp+side+chain+carboxylate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).</li>
<li>Kortemme, T., Creighton, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionization+of+cysteine+residues+at+the+termini+of+model+%CE%B1-helical+peptides.+Relevance+to+unusual+thiol+pKa+values+in+proteins+of+the+thioredoxin+family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family.</a> J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).</li>
<li>Gallo, E. A., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+C-Terminal+Cationic+Group+on+the+Competition+between+%CE%B1-Helical+Turn+and+%CE%B2-Turn+in+a+Model+Depsipeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).</li>
<li>Honig, B., Nicholls, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+electrostatics+in+biology+and+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Classical electrostatics in biology and chemistry.</a> Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).</li>
<li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+basis+of+structure-function+correlation+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins.</a> Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).</li>
<li>Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermochemical+determinations+by+the+kinetic+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Thermochemical determinations by the kinetic method.</a> Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).</li>
<li>Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetic+method+of+making+thermochemical+determinations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">The kinetic method of making thermochemical determinations.</a> J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).</li>
<li>Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collision+Energy+Dependence+of+Proton-Bound+Dimer+Dissociation%3A+Entropy+Effects%2C+Proton+Affinities%2C+and+Intramolecular+Hydrogen-Bonding+in+Protonated+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).</li>
<li>Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Li%2B%2C+Na%2B%2C+and+K%2B+Binding+to+the+DNA+and+RNA+Nucleobases.+Bond+Energies+and+Attachment+Sites+from+the+Dissociation+of+Metal+Ion-Bound+Heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).</li>
<li>Cooks, R. G., Wong, P. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Method+of+Making+Thermochemical+Determinations%3A+Advances+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications.</a> Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).</li>
<li>Armentrout, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+Measurements+and+the+Kinetic+Method%3A+a+Statistically+Meaningful+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).</li>
<li>Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+I%3A+A3%2C4CSH+and+HSCA3%2C4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+A%22%5BJournal%5D)">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).</li>
<li>Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyglycine+Peptides%3A+The+Effect+of+the+Cysteine+Position%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Structure+and+mechanism+in+protein+science%22">Structure and mechanism in protein science</a>. , W.H. Freeman & Co. New York. (1999).</li>
<li>Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin-a+fold+for+all+reasons%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin-a fold for all reasons.</a> Structure. 3 (3), 245-250 (1995).</li>
<li>Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+Differences+in+the+Thioredoxin+Superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily.</a> Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).</li>
<li>Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+Thermochemical+Data+by+the+Extended+Kinetic+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method.</a> J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).</li>
<li>Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Arginine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).</li>
<li>Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-Phase+Protonation+Thermochemistry+of+Glutamic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+A%22%5BJournal%5D)">Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid.</a> J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).</li>
<li>Zheng, X., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermochemical+Determinations+by+the+Kinetic+Method+with+Direct+Entropy+Correction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+A%22%5BJournal%5D)">Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction.</a> J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).</li>
<li>Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+acidities+of+the+20+protein+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids.</a> Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).</li>
<li>Tan, J. P., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+Gas-Phase+Acidities+of+Cysteine-Polyalanine+Peptides+Using+the+Extended+Kinetic+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).</li>
<li>Harrison, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gas-phase+basicities+and+proton+affinities+of+amino+acids+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides.</a> Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Peptides%3A+Synthesis%2C+Structures%2C+and+Applications%22">Peptides: Synthesis, Structures, and Applications</a>. Gutte, B. , (1995).</li>
<li>Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarany%2C+G+%22The+Peptides%22">The Peptides</a>. 2, Academic Press. New York. 1-284 (1979).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Fmoc+Solid+Phase+Peptide+Synthesis%3A+A+Practical+Approach%22">Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach</a>. Chan, W. C., White, P. D. , (2000).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

成功测定肽的气相酸性在很大程度上依赖于合适参考酸的选择。理想的参考酸应为结构相似、且具有明确已知气相酸性值的有机化合物。参考酸之间应具有相似的结构，以确保该组中每种参考酸的去质子化熵相近。参考酸的酸性值应接近目标肽的酸性值。对于C端酰胺化的含半胱氨酸短肽，卤代羧酸是合适的参考酸。成功开展CID实验的关键步骤之一是形成高丰度的稳定质子键合簇离子。通过调节肽与参考酸的比例、样品溶液的浓度以及仪器条件（如喷针电压、干燥气体温度和毛细管电压），可显著提高簇离子的稳定性和丰度。其中，毛细管电压（或某些其他类型仪器的锥孔电压）是一项关键的仪器参数。需注意避免使用浓度过高的样品溶液。
所述方法不仅限于寡肽。该方法可应用于多种分子体系，包括极性有机化合物、氨基酸及其衍生物、有机金属化合物、寡核苷酸以及拟肽聚合物。除了使用三重四极杆质谱仪外，实验也可采用离子阱和Q-TOF质谱仪进行。
本实验所用的多肽由本实验室采用固相多肽合成的标准方法合成29-31。使用Rink酰胺树脂作为固相载体，以获得酰胺化的C末端。Cooks动...

氨基酸残基的酸性是影响蛋白质结构、反应性以及折叠-去折叠过程的最重要热化学性质之一9,19。单个氨基酸残基常因其在蛋白质中的位置不同而表现出不同的有效酸性。特别是位于活性位点的残基，其酸性往往发生显著改变。一个典型的例子是硫氧还蛋白超家族酶活性位点中的半胱氨酸残基20,21。与未折叠蛋白质中的半胱氨酸相比，活性位点的半胱氨酸具有异常高的酸性3-5。有研究认为，螺旋构象可能对这种异常酸性具有重要贡献。目前已有大量关于肽段酸碱性质的实验研究在溶液中进行，尤其是在水溶液中2,6-8。然而，这些结果常常受到溶剂效应的复杂影响7。事实上，蛋白质中大多数活性位点位于内部区域附近，该区域的溶剂效应被最小化9,10。
为了理解肽和蛋白质的内在酸碱性质，必须在无溶剂环境中进行研究。本文介绍一种基于质谱法的气相酸性测定方法，该方法被称为扩展的库克斯动力学方法（extended Cooks kinetic method）。该方法已成功应用于多种化学体系，用于测定各种热化学性质，例如气相酸性、质子亲和力、金属离子亲和力、电子亲和力以及电离能11-15,22-26。我们已将此方法应用于测定一系列寡聚半胱氨酸-聚丙氨酸和半胱氨酸-聚甘氨酸肽的气相酸性17,18,27。这些研究表明，N端为半胱氨酸的肽显著比相应的C端半胱氨酸肽更具酸性。前者的高酸性可能归因于螺旋构象效应，其中硫醇根阴离子通过与螺旋宏观偶极的相互作用而得到强烈稳定。由于肽具有非挥发性和热不稳定性，目前动力学方法是获得肽类酸碱热化学数据最为实用的途径28。
动力学方法的一般方案及其相关方程如下所示 图1. 肽（AH）气相酸度的测定始于一系列质子键合簇阴离子[A•H•Ai]¯（或[A¯•H+•Ai¯]¯)，在质谱仪的离子源区域，其中 A¯ 和 Ai¯ 分别为肽和参考酸的去质子化形式。参考酸是具有已知气相酸性的有机化合物，其结构应彼此相似（但不一定与肽的结构相似）。参考酸之间的结构相似性可确保它们去质子化过程的熵变相近。质子键合簇 阴离子经过质量选择后，通过碰撞活化，随后在碰撞诱导解离（CID）实验中解离，生成相应的单体阴离子 A¯ 和 Ai¯，其速率常数为 k 和 ki，分别如图所示 图1a若二级碎裂可忽略不计，则CID碎片离子的丰度比[A¯]/[Ai¯] 代表了速率常数之比的近似度量， k/ki. 假设两个解离通道均无逆向活化能垒，CID产物离子分支比ln[A¯]/[Ai¯] 将与肽的气相酸度（Δ酸H）以及参考酸的（Δ酸Hi)，如图所示 图1b. 在此方程中，Δ酸H平均值 是参考酸的平均气相酸度，Δ(ΔS) 是熵项（如果参考酸在结构上彼此相似，则可假设其为常数）， R 是通用气体常数，以及 Teff 是系统的有效温度。有效温度是一个经验参数，其数值取决于多个实验变量，包括碰撞能量。
通过构建两组热动力学图来确定气相酸度值。第一组图是将 ln([A¯]/[Ai¯]) 对 ΔacidHi - ΔacidHavg 作图得到，如图4a所示。线性回归将得到一组直线，其斜率为 X = 1/RTeff，截距为 Y = - [ΔacidH - ΔacidHavg]/RTeff - Δ(ΔS)/R。第二组图是将第一组所得的截距（Y）对其相应的斜率（X）作图得到，如图4b所示。线性回归产生一条新直线，其斜率为 ΔacidH - ΔacidHavg，截距为 Δ(ΔS)/R。由此，ΔacidH 的值由斜率确定，而熵变项 Δ(ΔS) 则由截距获得。
实验采用配备电喷雾电离（ESI）离子源的三重四极杆质谱仪进行。质谱仪的示意图如图2所示。碰撞诱导解离（CID）实验通过第一级四极杆单元对质子结合簇阴离子进行质荷比选择，使其进入碰撞室，并与引入该室的氩原子发生碰撞；碰撞室压力维持在约0.5 mTorr。解离产生的碎片离子由第三级四极杆单元进行质谱分析。CID谱图在多个碰撞能量下采集，质荷比（m/z）范围足够宽，以涵盖所有可能的二级碎片离子。通过将仪器设置为选择反应监测（SRM）模式，可测量CID产物离子的强度，该模式下扫描聚焦于选定的产物离子。CID实验在四种不同的碰撞能量下进行，对应的质心系能量（Ecm）分别为1.0、1.5、2.0和2.5 eV。质心系能量通过以下公式计算：Ecm = Elab [m/(M+m)]，其中Elab为实验室坐标系中的碰撞能量，m为氩原子的质量，M为质子结合簇离子的质量。
本文以寡肽 Ala3CysNH2 (A3CH) 作为模型化合物。其C端为酰胺化结构，半胱氨酸残基上的巯基（SH）为酸性位点。选择合适的参考酸对于成功测定气相酸性至关重要。理想的参考酸应为结构相似（彼此之间）、且具有明确已知气相酸性值的有机化合物。参考酸的酸性值应与目标肽的酸性值相近。对于肽 A3CH，选用六种卤代羧酸作为参考酸，分别为氯乙酸（MCAH）、溴乙酸（MBAH）、二氟乙酸（DFAH）、二氯乙酸（DCAH）、二溴乙酸（DBAH）和三氟乙酸（TFAH）。其中，DFAH 和 MBAH 将用于演示本实验方案。

<table><tbody><tr><td>质谱仪</td><td>Varian</td><td>1200 L 和 320 L</td><td></td></tr><tr><td>氯乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402923</td><td></td></tr><tr><td>溴乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B56307</td><td></td></tr><tr><td>二氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>142859</td><td></td></tr><tr><td>二氯乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D54702</td><td></td></tr><tr><td>二溴乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242357</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr></tbody></table>

寡肽气相酸性的测定

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

在折叠蛋白中处于不同位置的氨基酸残基通常表现出不同程度的酸性。例如，位于螺旋N端或其附近位置的半胱氨酸残基通常比位于C端或其附近位置的更具酸性1-6。尽管在凝聚相（特别是水溶液）中已对肽的酸碱性质进行了大量实验研究6-8，但结果常常受到溶剂效应的干扰7。事实上，蛋白质中大多数活性位点都位于内部区域，该区域的溶剂效应已被最小化9,10。为了理解肽和蛋白质的本征酸碱性质，在无溶剂环境中进行研究具有重要意义。
我们介绍一种在气相中测定寡肽酸度的方法。以含半胱氨酸的寡肽Ala3CysNH2（A3CH）作为模型化合物。该方法基于成熟的扩展Cooks动力学方法（图1）11-16。实验采用配备电喷雾电离（ESI）离子源的三重四极杆质谱仪进行（图2）。对于每个肽样品，选择若干种参考酸。这些参考酸是结构相似且气相酸度已知的有机化合物。将肽与一种参考酸的混合溶液引入质谱仪，形成肽-参考酸的气相质子键合阴离子簇。对该质子键合簇进行质荷比选择，并通过碰撞诱导解离（CID）实验使其发生碎片化。利用酸度与簇离子解离动力学之间的关系，分析所得碎片离子的相对丰度。通过热力学-动力学图的线性回归，即可获得肽的气相酸度17,18。
该方法可应用于多种分子体系，包括有机化合物、氨基酸及其衍生物、寡核苷酸和寡肽。通过将实验测得的气相酸度与不同构象体的计算值进行比较，可以评估构象效应对酸度的影响。

<ol>
 <li>CID 串级实验提供了关于肽相对于所选参考酸的相对酸性的信息。两种代表性的肽的 CID 谱图（A3CH）与两种参考酸DFAH和MBAH的反应结果如图所示 图3。在 图3a 肽离子的离子丰度（峰高）弱于 DFA¯ 的离子丰度，且在 图3b，该肽离子的离子丰度强于MBA¯。这两张谱图表明，该肽在气相中的酸性介于这两种参比酸的酸性之间。</li>
 <li>通过定量碰撞诱导解离实验测定肽的气相酸度值。肽与六种参考酸形成的质子结合簇离子解离的热动力学曲线如图所示。 图4根据气相酸性与CID产物离子分支比之间的热动力学关系，对图表进行线性回归分析图1b) 给出肽 A 的气相酸度值3CH，其值为 332.2 kcal/mol。斜率和截距的示例数值如图所示。 表1 和 2.</li>
</ol>
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

本文描述了含半胱氨酸寡肽的气相酸度测定方法。实验采用三重四极杆质谱仪进行。通过碰撞诱导解离实验测定肽段的相对酸度，并利用扩展的库克斯动力学方法确定其定量酸度。

折叠蛋白中位于不同位置的氨基酸残基通常表现出不同程度的酸性。例如，一个半胱氨酸残基……

本实验的总体目标是应用库克动力学方法测定寡聚丙氨酸肽的气相酸性。该目标通过以下步骤实现：首先生成质子键合的团簇离子；第二步是进行碰撞诱导解离的括号实验。接下来，进行选定的反应监测实验。最后一步是分析从选定的反应监测实验中收集的数据。最终，利用动力学曲线来确定气相酸度的数值。与在溶液中进行的滴定等传统方法相比，该技术的主要优势在于能够消除溶剂效应。该方法有助于回答生物有机化学领域的一些关键问题，例如在无溶剂环境中肽的酸性强弱。由于消除了溶剂效应，该技术的应用还可拓展至对蛋白质内部氨基酸残基有效酸性性质的测定。通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为最佳质谱条件若无直观演示，难以掌握。该方法可揭示肽类内在的酸碱性质，也可很好地应用于其他体系，如模拟肽的聚合物和寡核苷酸。我们最初产生这一方法的想法，是源于希望研究构象效应对螺旋肽酸碱性质的影响。首先按照本视频配套书面方案中的描述，制备胱氨酸多聚丙氨酸肽和六种卤代羧酸的样品溶液。质谱测量的第一步是生成肽与参考酸之间稳定的质子结合簇离子。将仪器设为负离子质谱模式，电喷雾电离针电压设为负4.5千伏，毛细管电压约为负35伏，干燥气体温度维持在150摄氏度。将第一个和第三个四极杆（Q1 和 Q3）的峰宽设置为校准后的标度。峰宽是一项仪器参数，可用于调节峰的分辨率。校准标度设置可显示更窄的峰，从而实现更好的峰分离。可以调节毛细管电压和干燥气体温度。为了增强观测到的离子丰度，将约0.5毫升的二氟乙酸肽样品溶液注入1毫升Hamilton注射器中，并使用peek管将注射器连接到电喷雾电离（ESI）针入口。然后将注射器安装到注射泵上。打开注射泵，以每分钟10 µL的流速将样品溶液注入电喷雾离子化（ESI）针中。开启ESI针电压以启动电喷雾离子化过程。然后打开检测器。应在轮廓模式下观察质谱图。如果显示为 OID 模式，则应切换至轮廓模式。通过监测质荷比为 428 的峰来观察质子结合簇离子的形成。将峰宽从校准后的比例调整为1.5比例。可通过微调仪器来调节簇离子的信号丰度。将毛细管电压从负35伏特调整为负25伏特，以最大化质荷比为428的峰的丰度。下一步是进行碰撞诱导解离（CID）括弧实验。当团簇离子的丰度达到约100毫伏的设定值时，将仪器切换至MS/MS模式。在此模式下，Q1作为质量过滤器用于分离团簇离子，Q2作为碰撞池，而Q3发挥作用。当质量分析器将碰撞气压力设为0.5毫托，碰撞能量设为17电子伏特时，应在质谱显示窗口中观察到三个峰。质荷比（m/z）为428处的峰对应于团簇离子。质荷比为 332 和 95 的两个峰分别对应去质子化的肽段和去质子化的二氟乙酸。质荷比为 298 的小峰来自去质子化肽段的次要碎片。采集该肽段样品溶液的 CID 谱图，持续两分钟；进行类似的 CID 实验，并采集含有丙酸的肽段样品溶液的 CID 谱图。然后对肽

determination-of-the-gas-phase-acidities-of-oligopeptides

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

寡肽测定气相酸性

肽-金属配合物结构与配位测定的1D与2D 1H NMR方法

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

本文描述了一种通过质谱分析进行序列鉴定的寡聚肽拟物的手动合成方案。...

寡聚肽模拟物的合成与质谱分析

本文描述了使用非离子型表面活性剂相分离方法富集细菌脂蛋白，可直接用于Toll样受体（TLR）检测或其他应用。此外，还详细介绍了制备N端胰蛋白酶消化脂肽的后续步骤，以通过质谱法进行结构表征。...

细菌脂蛋白的富集及N端脂肽的制备用于质谱法结构鉴定

本文通过内源性修饰与使用稳定同位素标记酸酐进行定量化学酰化后引入的修饰之间的比率分析，实现了对整个蛋白质组中位点特异性蛋白质乙酰化和/或琥珀酰化占有率（化学计量比）的无偏定量。结合高灵敏度的数据非依赖性采集质谱技术，可获得准确的位点占有率测量结果。...

使用数据非依赖性采集质谱法定量位点特异性蛋白质赖氨酸乙酰化与琥珀酰化化学计量比

本文介绍了一种利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF）测定粗鼠组织提取物中蛋白酶特异性的实验方案。...

通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定小鼠组织提取物中蛋白酶特异性的方法：调控pH值以诱导特异性改变

离子淌度-质谱联用技术和分子模拟技术可用于表征设计型金属结合肽及铜结合肽methanobactin的选择性金属螯合性能。开发新型金属螯合肽有望为与金属离子失衡相关疾病的治疗提供新途径。...

离子淌度-质谱技术用于研究金属结合寡肽的金属离子识别结构与氧化还原活性机制

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

本文介绍了一种基于加热灭活的样品制备方法，用于保护内源性肽段以避免死后降解，随后采用同位素标记结合液相色谱-质谱法（LC-MS）进行相对定量。...

用于肽组学研究的胺类还原甲基化法样品制备与相对定量

开放搜索能够鉴定出带有先前未知聚糖组成的糖肽。本文以Acinetobacter...

基于开放搜索策略在Acinetobacter baumannii O-连接糖肽鉴定中的应用

学习使用Cook动力学方法测定含半胱氨酸寡肽的气相酸性。该方法通过生成质子结合簇离子并进行碰撞诱导解离实验，消除溶剂效应，为生物有机化学研究提供准确的肽酸性数据。

寡肽气相酸性的测定

探索更多视频