Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, photogeschaltete Zellen in einem lebenden Zebrafischembryo zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Embryo eingebettet wird, wobei ein gewebespezifisches, photo, konvertierbares fluoreszierendes Protein in aros bei niedriger Schmelztemperatur exprimiert wird. Als nächstes wird das Protein in der interessierenden Region vollständig photokonvertiert.

Dann wird der Embryo vorsichtig aus dem Aros entnommen und bis zu späteren Stadien in Eiwasser bei 28,5 Grad Celsius aufbewahrt. Schließlich wird der photokonvertierte Embryo wieder in aros mit niedriger Schmelztemperatur eingebettet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass photokonvertierte Zellen in späteren Stadien aufgrund des stabilen Vorhandenseins des photokonvertierten Proteins durch konfokale Mikroskopie präzise nachgewiesen werden können.

Wir denken also, dass die Methode, die wir heute vorstellen werden, im Kontext der Zell- und Entwicklungsbiologie sehr nützlich sein wird. Wir denken also, dass die Verwendung dieser Methodik im Zusammenhang mit der Zellmigration, der Gewebedynamik und anderen Zellverhaltensweisen sehr nützlich sein wird. Veronica Lombardo, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren, nachdem sie transgene Zebrafische gekreuzt und ein photokonvertierbares fluoreszierendes Protein exprimiert hat.

Wählen Sie die hellsten Embryonen, die homozygot sind, und züchten Sie sie bei 28,5 Grad Celsius, wenn sie das gewünschte Stadium erreicht haben. Verwenden Sie eine Pinzette, um sie in einem Glasbehälter mit Eiwasser zu betäuben, um die Embryonen zu betäuben. Verwende eine Glaspipette oder eine abgeschnittene Pipettenspitze, um sie nacheinander in trica zu übertragen.

Übertragen Sie einen betäubten Embryo auf den Deckel einer Kulturschale und halten Sie den Embryo in einem möglichst kleinen Volumen des Mediums. Übertragen Sie den Embryo in Aros, indem Sie ihn mit 1%Agros mit niedriger Schmelztemperatur und Trica bei 30 Grad Celsius pipettieren und in eine Kulturschale mit Deckglas und Boden legen. Verwenden Sie eine glatte Kunststoffspitze, um den Embryo auszurichten, wenn der Agros polymerisiert ist.

Bedecken Sie es mit Trica-Lösung auf einem inversen konfokalen Mikroskop, das mit 405-, 488- und 561-Nanometer-Laserquellen und einem 20-fach-Objektiv ausgestattet ist. Verwenden Sie die 488- und 561-Nanometer-Laser, um einen Z-Stapel der gesamten Struktur der Probe zu erzeugen, der den interessierenden Bereich einschließt. Wählen Sie das Zeitreihenwerkzeug aus und stellen Sie es auf zwei Zyklen ohne Intervall ein, einen für die Vor- und einen für die Nachbereitungskonvertierung.

Wählen Sie das Werkzeug des Bereichs aus und definieren Sie einen oder mehrere interessante Bereiche für die Fotokonvertierung. Wählen Sie als Nächstes das Bleichwerkzeug aus und stellen Sie es auf "Bleichen nach dem Scan starten" ein. Einer von zweien, die hier zum Einsatz kommen, ist ein 30 Milliwatt 405 Nanometer Diodenlaser.

Sorgfältig optimiert für die minimale Menge an Laserlicht, die für eine vollständige Fotokonvertierung erforderlich ist, die durch Variation der Intensität des Laserlichts, der Scan-Iterationen des interessierenden Bereichs und der Scangeschwindigkeit erreicht wird. Scannen Sie die Probe mit den 488-Nanometer- und 561-Nanometer-Lasern, um die verbleibende grüne und die photokonvertierte rote Fluoreszenz des photokonvertierbaren fluoreszierenden Proteins zu visualisieren. Entsorgen Sie nach der Fotoumwandlung die Lösung und entfernen Sie den Embryo vorsichtig mit einer Nadel oder einer glatten Plastikspitze aus dem Agros.

Halten Sie den Embryo in Eiwasser im Dunkeln bei 28,5 Grad Celsius bis zum gewünschten Entwicklungsstadium. Betten Sie den Embryo ein zweites Mal ein und erzeugen Sie dann einen Zack der Probe, einschließlich der interessierenden Region, erneut mit den 488- und 561-Nanometer-Lasern. Da dieses Protokoll die normale Entwicklung nicht beeinflusst, ist es möglich, den photokonvertierten Embryo in späteren Stadien zu beobachten.

Hier ist ein Beispiel für einen Photokonversionsassay. Endothelzellen wurden während der Entwicklung des Zebrafisches von 48 bis 72 Stunden nach der Befruchtung mit einer transgenen Reporterlinie verfolgt, die Kick G in den Endothelkernen exprimierte, wie hier gezeigt, bevor die Photokonversion Kick G im Endothelgewebe exprimiert wurde und nur als grüne Fluoreszenz mit einem 488-Nanometer-Argon-Laser nachgewiesen werden konnte, Kontrollscans mit einem 561-Nanometer-Laser für rote Fluoreszenz. Vor der Fotokonvertierung wurde kein fotokonvertierter Kick GR erkannt.

Anschließend wurde die Region of Interest mit einem 405-Nanometer-Diodenlaser bei 10% Intensität, 20 Iterationen, vollständig photokonvertiert und die Kopfgefäße wurden erneut mit den 488-Nanometer- und 561-Nanometer-Lasern gescannt. In diesem Panel hatte der grüne Kick G innerhalb des interessierenden Bereichs vollständig auf Rot umgeschaltet, um die photokonvertierten Endothelzellen in späteren Stadien zu verfolgen. Der Embryo wurde 24 Stunden nach der Photokonversion beobachtet, d. h. etwa 72 Stunden nach der Befruchtung in Endothelgeweben, die aus der photokonvertierten Region von Interesse stammen.

Sowohl nicht- als auch photokonvertierte kick G-Proteine wurden aufgrund der Stabilität des rot fluoreszierenden photokonvertierten kick g und der Synthese von neuem grünem, nicht umgewandeltem kick G nach seiner Entwicklung beobachtet. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie den Weg zur Erforschung der Zellbiologie und des Gewebeumbaus bei mehreren Fischen.