Name: Genomweiten Gen-Deletionen in Streptococcus sanguinis Von High Throughput PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: Lernen Sie eine effiziente Methode zur genomweiten Gendeletion in Streptococcus sanguinis mittels Hochdurchsatz-PCR. Diese Technik ermöglicht schnelle genetische Modifikationen zur Untersuchung bakterieller Genfunktionen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01DE018138 von den National Institutes of Health (PX) und zum Teil unterstützt durch Virginia Commonwealth University Presidential Forschung Incentive Program (PRIP) 144602-3 (PX). Wir danken Drs. Lei Chen, Yuetan Dou und Xiaojing Wang für die Unterstützung mit dem Bau der genomweiten Mutanten. Wir danken auch dem DNA Core Facility an der Virginia Commonwealth University für die DNA-Sequenzierung.

Ein. Primer Design <ol><li> Grundierungen werden unter Verwendung im Haus der Script basiert auf der S. sanguinis SK36 Genomsequenz. Drei Sätze von Primern, F1/R1, F2/R2 und F3/R3 sind zur Amplifikation des 1-kb stromaufwärts Sequenz des Ziel-Gens, das aphA-3 kodierenden Gens Kanamycinresistenz (Km r) Protein 3 und der 1 ausgelegt -kb stromabwärts Sequenz des Zielgens, bzw. (Abbildung 1). Unter dieser Primer sind F1 und R3 entwickelt mit ePrimer3 im EMBOSS Suite von Programmen ( <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a> ) an flankierenden Regionen stromaufwärts oder stromabwärts zu verstärken des Ziels Gen. Genspezifischen Primern, R1 und F3, werden basierend auf der 5 &#39;und 3&#39;-Sequenzen des Zielgens gestalten. R1 und F3 Primer enthalten 25-bp-Adapter-Sequenzen an ihrem 5&#39;-Ende, die komplementär zu dem aphA-3 sindGen. Die Schmelztemperaturen von jedem Primer wurden entwickelt, um so nah wie möglich auf 60 ° C um die Verwendung eines einheitlichen Glühtemperatur für alle PCR-Reaktionen in 96-Well-Format zu ermöglichen. </li><li> F1, R1, R3 und F3 Primer werden in 96-Well-Platten auf ein Gen Reihenfolge basierend synthetisiert. Jede Platte enthält eine Art von Primer im gleichen Gen sortiert. Verdünnt den Primer in 96-Well-Platte arbeitet Primer zu einer Endkonzentration von 10 uM zur PCR-Amplifikation unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. </li></ol> 2. High-throughput PCR-Amplifikation und Reinigung <ol><li> Mit hohem Durchsatz amplifizieren 1-kb stromaufwärts oder stromabwärts des Ziels S. sanguinis Gene, montieren ein PCR-Cocktail Mischung auf Eis in einem 15-ml konischen Röhrchen mit 1640 ul ddH 2 O, 250 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul 10 mM dNTP-Gemisch, 100 ul 50 mM MgSO 4, 100 ul 10 ng / ul S. sanguinis SK36 genomische DNA und 10 ul Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity und Transfer 23 ul des Gemisches in jedes Well auf 96-well PCR-Platte mit einer Mehrkanalpipette. Übertragen 1 ul jeder F1 und R1 (oder F3 und R3) aus den 10 uM arbeiten Primer Platten der PCR-Platte mit Mehrkanalpipette. Abzudichten und die PCR-Platte durchzuführen Amplifikation bei 94 ° C für 1 min und 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 54 ° C für 30 sec und 68 ° C für 1,5 min. </li><li> Bereiten 1% Agarosegel mit Ethidiumbromid mit 48 Kavitäten Montage Mehrkanalpipette loading. Mix 4 ul PCR-Produkt mit 1 ul 5xDNA Ladepuffer auf 96-Well-Platte und laden Sie die Proben auf Agarosegel unter Verwendung eines 10-ul Mehrkanalpipette. Führen Elektrophorese bei 135 V für 30 min. Untersuchen Sie das Band auf Gel unter UVP Dokumentation und Analyse-System. </li><li> Reinigen die PCR-Produkte durch PureLink 96 PCR Purification Kit unter Verwendung von Zentrifugation nach der Anleitung des Herstellers. Zum Eluieren DNA, fügen Sie 40 ul sterilem ddH 2 O zum Wohl des binding Platte. </li><li> Zufallsprinzip auswählen mehreren gereinigten Amplifikate auf der Platte, um die DNA-Konzentrationen mit NanoDrop Spektralphotometer prüfen. Die Konzentration der Amplikons auf Platte zu ~ 10 ng / ul. </li><li> Ein Plasmid enthaltenden Km r Kassette mit EcoR I verdaut als PCR-Template. Die verdaute Plasmid wird durch QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und das lineare Plasmid-DNA wird auf DNA-Endkonzentration 10 ng / ul eingestellt. Montieren Sie 25 ul Mischung Kilometer r Kassette Amplikon einschließlich 16,4 ul ddH 2 O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul 10 mM dNTP-Gemisch, 1 ul 50 mM Mg SO 4, 1 ul 10 uM F2, 1 ul 10 uM R2, 1 ul lineare Plasmid-DNA und 0,1 ul Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity. Eine PCR-Amplifikation bei 94 ° C für 1 min und 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec und 68 ° C für 1 min. Untersuchen des PCR-Produkts durch Gelelektrophorese an 1% Agarose. Poola Großteil des Km r Kassette Amplikon aus 10 einzelnen PCR gereinigte von QIAquick-PCR. Passen Sie die Amplikon-Konzentration auf 10 ng / ul. </li><li> Um die endgültige lineare rekombinante PCR Amplikon erhalten, werden drei PCR Amplikons mit je 1 ul (in fast gleich-molaren Mengen) in ein PCR-Platte sowie die PCR-Vorlage kombiniert. Andere PCR-Komponenten, einschließlich 14,4 ul ddH 2 O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul 10 mM dNTP-Gemisch, 1 ul 50 mM Mg SO 4, 1 ul 10 uM F1, 1 ul 10 uM R3, 0,1 ul Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity. PCR-Amplifikation bei 94 ° C für 2 min, 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec 55 ° C durchgeführt für 30 sec und 68 ° C für 3,5 min und schließlich 68 ° C für 4 min. </li><li> Untersuchen Sie die PCR Amplifikate im Agarosegel. Läutern und Quantifizierung der PCR-Amplikons wie oben beschrieben. Einfrieren der rekombinierten PCR Amplikons bei -20 ° C. </li></ol> 3. Comzuständigen Cells Vorbereitung <ol><li> Todd-Hewitt-Bouillon hergestellt wird, auf 7,6 eingestellten pH-Wert mit 10 N NaOH, erhitzt zum Sieden und kühlt dann auf Raumtemperatur und sterilisiert unter Verwendung 0,22 um Polystyrol-Filter 4. Fügen Sie 300 ul hitzeinaktiviertem Pferdeseren (Endkonzentration 2,5%) auf 11,7 ml Todd Hewitt Broth in 15-ml konischen Röhrchen, um Make-up TH + HS Medium. Aliquot TH + HS Medium in 2 ml und 10 ml in Tuben. </li><li> Beimpfen 5 ul Lager S. sanguinis SK36 bei -80 ° C in 2 ml TH + HS Medium eingefroren und inkubiere die Kultur über Nacht mit Capping fest bei 37 ° C, durch Vorinkubieren der 10 ml-TH + HS Rohr begleitet. </li><li> Nachdem über Nacht übertragen 50 ul Kultur in 10 ml TH + HS und inkubieren des Rohres bei 37 ° C für 3 Stunden (entspricht OD 660 von 0,07 bis 0,08), sofort mit der Transformation. </li></ol> 4. Zelltransformation und Antibiotika-Selektion <ol><li> Add 2 ul 70 ng S. sanguinis SK36 Kompetenztenz stimulierende Peptid (CSP) und 2 ul linearen rekombinanten PCR Amplikon (~ 50 ng) in Eppendorf-Röhrchen auf 96-Well-Block und Pre-warm sie bei 37 ° C. Übertragen 330 ul 3 hr-inkubierten SK36 Kultur in jedes Röhrchen. Bei 37 ° C für 1 Stunde. Ersetzen DNA mit sterilem ddH 2 O als Kontrolle. </li><li> Legen Sie den Block auf Eis und verteilt 100 ul jeder Transformation auf Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Platte mit 500 ug / ml Kanamycin. Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C für 2 d unter mikroaeroben Bedingungen. </li></ol> 5. Mutant Bestätigung und Lagerung <ol><li> Für jeden Ersatz Mutante, zufällig abholen 2 einzelnen Kolonien, impfen die Kolonie in 5 ml BHI mit 500 ug / ml Kanamycin und inkubieren das Inokulum mikroaerob über Nacht bei 37 ° C. Kryokonservierung jede Kultur in 30% Glycerin bei -80 ° C </li><li> Um zu untersuchen, ob die Mutante, die die erwartete Gen-Ersatz, führen Kolonie-PCR für jede Mutante mit F1 und R3Primer in 96-well PCR-Platte. Etwa 1 ul-Übernachtkultur von einzelnen Kolonie wird als DNA-Matrize in 25 ul-PCR-Amplifikationsreaktion verwendet. PCR wird bei 94 ° C für 5 min, 35 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 Sekunden durchgeführt und 68 ° C für 3,5 min und schließlich 68 ° C für 4 min. </li><li> Zur genauen Bestimmung Doppelbandpresse Mutanten oder Verunreinigung PCR Amplikon, prüft die PCR-Amplicon durch Elektrophorese für 4 h auf&gt; 12 cm lang 2% Agarosegel mit Ethidiumbromid. Unter diesem Agarosegelelektrophorese Zustand, wurden alle Amplikons mit ≥ 100 bp Unterschied eindeutig identifiziert. Wenn Bands aus Amplifikation der Km r Kassette und dem Wildtyp-Gen werden voraussichtlich durch &lt;100 bp, ein interner T1 Primer verwendet, um festzustellen, ob eine Wildtyp-Gens durch PCR nachgewiesen werden kann unterschiedlich sein. </li><li> Zur weiteren bestätigen Sie den Löschvorgang werden die Fragmente durch PureLink 96 PCR Purification Kit gereinigt und sequenziert mit dem P1-Primer,bindet an das Km r Kassette. Halten einzig richtige Mutanten durch Sequenzierung bestätigt. </li></ol>

<ol><li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Bacillus+subtilis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li>
<li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3%275%22-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li>
<li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li>
<li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+%28sic%29+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li>
<li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li>
<li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li>
<li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Um die möglichen polaren Effekte der Ersatz eines Zielgens mit exogenen Antibiotika-Gen auf benachbarten Genen zu minimieren, sind zwei Schritte gemacht, während erste Primer entwerfen. Für die meisten der Gene gelöscht werden der Primer R1 und F3 entworfen, um die codierende Region von 6 bp nach dem Startcodon und 30 bp vor dem Stopcodon löschen. Die letzten 30 Basenpaare zurückgehalten werden, um potenzielle ribosomale Bindungsstelle durch das benachbarte, nachgeschaltete Gen verwendet schützen. Das verbliebene Bereic...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Namen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalog #</strong</td&gt;<td<strong&gt; Kommentare (optional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Integrated DNA Technologies</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer R2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2p</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P1</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Sequenz: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNA Polymerase</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; Restriktionsenzym</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agar</td&gt;<td&gt; American Bioanalytical</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agarose</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Brain Heart Infusion</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pferdeserum</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; Pferdeserum</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Km</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamycin</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH Brühe</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Todd Hewitt Broth</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 PCR Purification Kit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; QIAquick PCR Purification Kit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Filter</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; 0,22 um Polystyrol-Filter</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anoxomat-System</td&gt;<td&gt; Mart Microbiology bv</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tischzentrifuge</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall Legend RT Plus Mikrotiterplatten Rotors</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gel-Dokumentation</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Incubator</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet die Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet die Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifuge</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Mikrozentrifuge 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mehrkanalpipetten</td&gt;<td&gt; Thermo Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermal Cycler</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Inc.</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR-System 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genomweiten gen-deletionen in<em&gt; streptococcus sanguinis</em&gt; von high throughput pcr

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon-Mutagenese-und Single-Gen-Deletion gibt zwei Methoden in genomweiten Gen-Knockout in Bakterien 1,2 angewendet. Obwohl Transposon-Mutagenese ist weniger zeitaufwendig, weniger kostspielig und erfordert keine abgeschlossene Genom Informationen gibt es zwei Schwachstellen in diesem Verfahren: (1) die Möglichkeit einer unterschiedlichen Mutanten in der gemischten Mutantenbibliothek daß der Zähler-wählt Mutanten mit verminderter Wettbewerb; und (2) die Möglichkeit eines teilweisen Geninaktivierung wobei Gene nicht vollständig verlieren ihre Funktion nach dem Einsetzen eines Transposons. Single-Gen-Deletion Analyse kann für die Nachteile, die mit der Transposon-Mutagenese zu kompensieren. Um die Effizienz der genomweiten einzigen Gen-Deletion zu verbessern, versuchen wir, einen hohen Durchsatz Technik für genomweite einzigen Gen-Deletion mit Streptococcus sanguinis als Modellorganismus zu etablieren. Jedes Gendeletion in S. konstruieren sanguinis Genom soll 1 umfassen-Kb stromaufwärts des Zielgens, das aphA-3-Gen, kodierend Kanamycinresistenz Protein und 1-kb stromabwärts des Zielgens. Drei Sätze von Primern F1/R1, F2/R2 und F3/R3 sind jeweils entworfen und synthetisiert in einer 96-Well-Platte Format für PCR-Amplifikationen von diesen drei Komponenten jedes Deletion konstruieren. Primer R1 und F3 enthalten 25-bp-Sequenzen, die komplementär zu Regionen der aphA-3-Gen an ihrem 5&#39;-Ende sind. Eine große Skala PCR-Amplifikation des aphA-3-Gen wird einmal für die Erstellung aller Single-Gendeletion Konstrukte durchgeführt. Der Promotor aphA-3-Gen wird zunächst ausgeschlossen, um das Potenzial polaren Effekt Kanamycinkassette minimieren. Um die Gendeletion Konstrukte zu erzeugen, werden Hochdurchsatz-PCR-Amplifikation und Reinigung in einem 96-Well-Platten-Format durchgeführt wird. Eine lineare rekombinante PCR Amplikon für jedes Gen Löschung wird nach oben durch vier PCR-Reaktionen mit High-Fidelity DNA-Polymerase erfolgen. Die anfängliche exponential Wachstumsphase S. sanguinis in Todd-Hewitt-Brühe kultiviert, ergänzt mit 2,5% inaktiviertem Pferdeserum wird verwendet, um die Zuständigkeit für die Transformation von PCR-rekombinante Konstrukte zu erhöhen. Unter dieser Bedingung bis zu 20% von S. sanguinis transformierten Zellen können unter Verwendung ~ 50 ng der DNA werden. Basierend auf diesem Ansatz wurden 2.048 Mutanten mit Single-Gen-Deletion letztendlich von den 2.270 Gene in S. erhalten sanguinis außer vier Gen-ORFs, die vollständig innerhalb anderen ORFs in S. sanguinis SK36 und 218 potentielle essentiellen Gene. Die Technik zur Erstellung von Gen-Deletion Konstrukte ist mit hohem Durchsatz und könnte leicht in genomweiten Gen Löschungen für alle transformable Bakterien verwenden.

Nach der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer und R1 F1 und F3 und R3, etwa 1-kb stromaufwärts und stromabwärts jeder S. sanguinis Gen wurden in 96-Well-Format bzw. (2A) erhalten. Unter unserer PCR-Bedingungen und mit entworfenen Primern wurde ein bestimmtes Produkt aus S. verstärkt sanguinis genomischen DNA in jeder PCR-Reaktion. Dieses Ergebnis zeigt die Primer waren sehr spezifisch für die Ziele der S. sanguinis. Durch PCR-Amplifikation mit erneute Primer ...

Eine effiziente genomweiten Gen-Mutation Methode ermittelt worden<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Als Modellorganismus. Diese Methode wurde über einen hohen Durchsatz rekombinanten PCRs und Transformationen erreicht.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Die Transposon-Mutagenese und die Einzelgen-Deletion sind zwei Methoden, die für den genomweiten Gene-Knockout in Bakterien eingesetzt werden 1,2. Obwohl die Transposon-Mutagenese ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittels Hochdurchsatz-PCR genomweite Einzelgen-Deletionen in Streptococcus sanguinis durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst drei Amplifikate mittels Hochdurchsatz-PCR-Amplifikation gewonnen werden, darunter das Antibiotikaresistenzgen sowie die upstream und downstream gelegenen DNA-Sequenzen des Zielgens. Der zweite Schritt besteht darin, das lineare rekombinante PCR-Amplifikat unter Verwendung der drei PCR-Amplifikate als Matrizen zu erhalten.Anschließend werden die kompetenten s sanguine-Zellen vorbereitet. Im letzten Schritt wird der lineare rekombinante PCR-Amplicon in kompetente s sanguineous-Zellen transformiert. Schließlich dienen Kolonie-A-PCR-Amplifikation und DNA-Sequenzierung der Bestätigung der korrekten Mutanten.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber erschöpfenden anderen Methoden wie dem Suizid-Plasmid-Knockout besteht darin, dass mit dieser Methode direkt genomweite Deletionsmutanten im Hochdurchsatzverfahren erzeugt werden können. PCR-Primer können wie in dem schriftlichen Protokoll beschrieben unter Verwendung von hauseigenen Skripten, die auf der Streptococcus sanguinis SK36-Genomsequenz basiere

genome-wide-gene-deletions-streptococcus-sanguinis-high-throughput

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Systematische, groß angelegte synthetische genetische (Gen-Gen-oder Epistase) Interaktion Bildschirme können verwendet werden, um genetische Redundanz und Weg cross-talk zu erkunden. Hier haben wir eine High-Throughput-quantitative synthetischen genetischen array Screening-Technologie beschreiben, bezeichnet ESGA dass wir für die Aufklärung epistatische Beziehungen und erforschen genetische Interaktion Netze in den...

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Das Green Monster Verfahren ermöglicht die schnelle Montage mehrerer Deletionen mit einem Reporter-Gen kodiert grün fluoreszierendes Protein markiert. Dieses Verfahren basiert auf der Fahrt Hefestämme durch wiederholte Zyklen von sexueller Sortiment von Deletionen und Fluoreszenz-basierter Anreicherung von Zellen, die mehrere Deletionen basiert.

The Green Monster Verfahren zur Erzeugung von Hefestämmen Buchwert Multiple Deletionen

Quelle: Tomás, J. M., et al. Generierung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen bei der bakteriellen Motilität. J. Vis. Exp. (2022).Dieses Video zeigt die initiatorabhängige Amplifikation eines Suizidplasmids in E. coli. Das Plasmid, das ein Antibiotikaresistenzgen trägt, repliziert sich nur in Gegenwart eines Initiatorproteins, das vom Wirt kodiert wird. Nach der Elektroporation und Inkubation in Rückgewinnungsmedium wird das Gemisch auf antibiotikahaltigen...

Amplifikation eines Suizidplasmids in einem bakteriellen Wirt

CRISPR/Cas9 ist ein robustes System, um Störungen von Genen und genetischen Elementen zu erzeugen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung genomischer Deletionen in Säugetierzelllinien mittels CRISPR/Cas9.

Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

Die experimentelle Validierung der Enhancer-Aktivität erfolgt am besten durch eine Funktionsverlustanalyse. Hier wird ein effizientes Protokoll vorgestellt, das die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion verwendet, um die allelspezifische Regulation der Gentranskription in F1-ES-Zellen zu untersuchen, die ein Hybridgenom (Mus musculus129 x Mus castaneus) enthalten.

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Diese Handschrift beschreibt eine Duplex digitalen PCR Assay , die gleichzeitig verwendet werden können , um Enterococcus spp quantifizieren. Und die HF183 genetischen Markern als Indikatoren für allgemeine und menschlichen assoziiertes fäkale Verunreinigung in Erholungsgewässern.

Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Und das menschliche Fecal-assoziierte HF183 Marker in Waters

Wir beschreiben eine einfache, schnelle und relativ kostengünstige Methode zur Erzeugung von gen gestört Streptococcus Mutans Stämme; Diese Technik kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von bereits bestehenden antibiotische Resistenz-Kassette Löschung Konstrukte als Grundlage für die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Solche Löschung Mutationen können mobilisiert und in den entsprechenden Locus eines Empfängers Stamm mit P1 Bakteriophagen Transduktion eingefügt.

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

Beschrieben hier ist eine einfache Methode zur Reinigung eines Genprodukts in Streptococcus mutans. Diese Technik kann bei der Reinigung von Proteinen, insbesondere Membranproteinen und Proteinen mit hoher Molekularmasse, von Vorteil sein und kann mit verschiedenen anderen Bakterienarten verwendet werden.

Reinigung eines hochmolekularen Proteins in Streptococcus mutans

Hier wird eine Methode zur gezielten, markerlosen Genlöschung bei Chlamydia trachomatis mit Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenese, FLAEM beschrieben.

Markerless Gene Deletion von Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Hier beschreiben wir die Konstruktion von Nullmutanten von Aeromonas in spezifischen Glykosyltransferasen oder Regionen, die Glykosyltransferasen enthalten, die Motilitätsassays und die Flagellenreinigung, die durchgeführt wurden, um die Beteiligung und Funktion ihrer kodierten Enzyme bei der Biosynthese eines Glykans zu bestimmen, sowie die Rolle dieses Glykans in der bakteriellen Pathogenese.

Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

Lernen Sie eine effiziente Methode zur genomweiten Gendeletion in Streptococcus sanguinis mittels Hochdurchsatz-PCR. Diese Technik ermöglicht schnelle genetische Modifikationen zur Untersuchung bakterieller Genfunktionen.

Genomweiten Gen-Deletionen in

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