Genomweiten Gen-Deletionen in

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittels Hochdurchsatz-PCR genomweite Einzelgen-Deletionen in Streptococcus sanguinis durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst drei Amplifikate mittels Hochdurchsatz-PCR-Amplifikation gewonnen werden, darunter das Antibiotikaresistenzgen sowie die upstream und downstream gelegenen DNA-Sequenzen des Zielgens. Der zweite Schritt besteht darin, das lineare rekombinante PCR-Amplifikat unter Verwendung der drei PCR-Amplifikate als Matrizen zu erhalten.

Anschließend werden die kompetenten s sanguine-Zellen vorbereitet. Im letzten Schritt wird der lineare rekombinante PCR-Amplicon in kompetente s sanguineous-Zellen transformiert. Schließlich dienen Kolonie-A-PCR-Amplifikation und DNA-Sequenzierung der Bestätigung der korrekten Mutanten.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber erschöpfenden anderen Methoden wie dem Suizid-Plasmid-Knockout besteht darin, dass mit dieser Methode direkt genomweite Deletionsmutanten im Hochdurchsatzverfahren erzeugt werden können. PCR-Primer können wie in dem schriftlichen Protokoll beschrieben unter Verwendung von hauseigenen Skripten, die auf der Streptococcus sanguinis SK36-Genomsequenz basieren, entworfen und synthetisiert werden. Drei Primer-Sets wurden für die Amplifikation der eintausend Basenpaare upstream liegenden Sequenz des Zielgens, des A PHA drei Gen ENC kodierenden Proteins und des Proteins für Kanamycinresistenz sowie der eintausend Basenpaare downstream liegenden Sequenz des Zielgens entworfen.

Gen-spezifische Primer. R one und F three werden basierend auf den 5'- und 3'-Sequenzen des Zielgens entworfen, um den ein Kilobase langen upstream- oder downstream-Bereich der Ziel-s-sanguine-Gene mit hoher Durchsatzkapazität zu amplifizieren. Stellen Sie zunächst eine PCR-Cocktailmischung auf Eis in einem 15-Milliliter-Konischgefäß zusammen.

Siehe den Text für die Bestandteile der PCR-Mischung, die genomische DNA von s sanguineous enthält; übertragen Sie 23 Mikroliter der Mischung mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer 96-Loch-PCR-Platte. Für die upstream gelegene Sequenz des Zielgens übertragen Sie jeweils ein Mikroliter von F1 und R1 aus 10-Mikromolar-Arbeitsprimerplatten auf die PCR-Platte, und zwar ebenfalls mit der Mehrkanalpipette. Wiederholen Sie dies mit den Primern F3 und R3, um die downstream gelegene Sequenz des Zielgens zu amplifizieren. Versiegeln Sie die PCR-Platte und führen Sie die Amplifikation bei 94 Grad Celsius für eine Minute durch, gefolgt von 30 Zyklen à 94 Grad Celsius für 30 Sekunden.

54 Grad Celsius für 30 Sekunden und 68 Grad Celsius für 1,5 Minuten. Nach der Amplifikation ein 1 %iges Agarosegel mit Bromid, das für eine 48-Loch-Platte geeignet ist und das Beladen mit einer Mehrkanalpipette ermöglicht, vorbereiten. Vier Mikroliter des PCR-Produkts mit einem Mikroliter 5× DNA-Ladepuffer mischen.

Auf einer 96-Well-Platte die Proben mit einer 10-µL-Multikanalpipette auf ein Aros-Gel auftragen. Elektrophorese 30 Minuten lang bei 135 Volt durchführen. Die Bande im Gel mit einem UVP-Dokumentations- und Analysesystem untersuchen.

Reinigen Sie die PCR-Produkte mithilfe des Pure Link 96 PCR-Reinigungs-Kits durch Zentrifugation gemäß den Herstelleranweisungen zur Elution von DNA. Geben Sie 40 Mikroliter steriles, doppelt destilliertes Wasser in jedes Loch der Bindungsplatte. Wählen Sie zufällig mehrere gereinigte Amplikone auf der Platte aus, um die DNA-Konzentrationen zu überprüfen.

Passen Sie mithilfe eines NanoDrop-Spektrophotometers die Konzentration der Amplifikate in der Platte auf etwa 10 Nanogramm pro Mikroliter an. Verdauen Sie anschließend mit eco R one ein Plasmid, das die Kanamycin-Resistenz gisette enthält, damit es als PCR-Vorlage dienen kann. Reinigen Sie das geschnittene Plasmid mit dem kayak quick PCR-Reinigungs-Kit und stellen Sie die endgültige DNA-Konzentration der linearen Plasmid-DNA auf 10 Nanogramm pro Mikroliter ein.

Stellen Sie eine 25-Mikroliter-PCR-Mischung für das Kanamycin-Resistenz-Cassette-Amplicon her, einschließlich der in der schriftlichen Anleitung aufgeführten Primer F zwei und R zwei. Begleitend zu diesem Video führen Sie die PCR-Amplifikation wie hier beschrieben durch. Um das PCR-Produkt zu untersuchen, führen Sie eine Gelelektrophorese auf einem 1%-Agarosegel durch.

Anschließend werden die Amplifikate der Kanamycin-Resistenzkassette aus 10 PCR-reinigten Individuen gesammelt. Die Amplikonkonzentration wird auf 10 Nanogramm pro Mikroliter eingestellt. Der schwierigste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, das endgültige linear kompetente PCR-Amplifikat aus seinen drei PCR-Amplifikat-Vorläufern zu erhalten.

Um den Erfolg sicherzustellen, werden die drei PCR-Ansatzter auf nahezu gleiche Mengen eingestellt. Kombinieren Sie je einen Mikroliter der drei 10 Nanogramm pro Mikroliter PCR-Aons in einer PCR-Platte sowie die PCR-Vorlage. Bereiten Sie anschließend die PCR-Mischung vor, einschließlich der in der schriftlichen Anleitung aufgeführten F1- und R-Drei-Primer.

Führen Sie als Nächstes die PCR-Amplifikation der Proben durch. Untersuchen Sie die PCR-AMPLICONS nach Reinigung und Quantifizierung der PCR-Amplicons in einem Agarosegel. Wie zuvor frieren Sie die rekombinierten PCR-Amplicons bei minus 20 Grad Celsius ein.

Bereiten Sie zunächst Todd-Hewitt-Medium mit Pferdeserum gemäß der schriftlichen Anleitung vor, die diesem Video beiliegt. Aliquotieren Sie zwei Milliliter Medium und zehn Milliliter Medium in zwei 15-Milliliter-Konischgefäße. Inokulieren Sie fünf Mikroliter aufgetauten Stamm s. sanguinis SK 36, der bei minus 80 Grad Celsius eingefroren war, in zwei Milliliter Medium. Inkubieren Sie die fest verschlossene Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Brüten Sie auch das 10-Milliliter-Mediumröhrchen unter den gleichen Bedingungen nach einer Übernacht-Inkubation vor. Übertragen Sie 50 Mikroliter der Kultur in das 10-Milliliter-Mediumröhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für drei Stunden.

Nach der Inkubation sofort zwei Mikroliter einer 70 Nanogramm pro Milliliter enthaltenden sanguinen SK-36-Kompetenz-stimulierenden Peptidlösung und zwei Mikroliter des linearen rekombinanten PCR-Amplicons zu den Röhrchen in einem 96-Loch-Block geben und bei 37 Grad Celsius vorwärmen. 330 Mikroliter der dreistündigen inkubierten SK-36-Kultur in jedes Röhrchen überführen. Als Kontrolle die DNA durch steriles, doppelt destilliertes Wasser ersetzen.

Die Röhrchen nach der Inkubation eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Den Block auf Eis stellen und 100 Mikroliter jeder Transformation auf Brain-Heart-Infusion- oder BHI-Agarplatten mit 500 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin auftragen. Die Platten zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius unter mikroaeroben Bedingungen inkubieren. Für jeden Replacements-Mutanten zufällig zwei einzelne Kolonien auswählen und jede Kolonie in fünf Milliliter BHI mit 500 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin impfen. Jeden Inokulum über Nacht bei 37 Grad Celsius unter mikroaeroben Bedingungen inkubieren.

Jede Kultur in 30 % Glycerin bei minus 80 Grad Celsius kryokonservieren. Um zu überprüfen, ob der Mutant die erwartete Genersetzungen enthält, Kolonien-PCR für jeden Mutanten unter Verwendung der Primer F1 und R3 in einer 96-Loch-PCR-Platte durchführen.

Verwenden Sie etwa ein Mikroliter Übernachtkultur von jeder einzelnen Kolonie als DNA-Vorlage in einer 25-Mikroliter-PCR-Amplifikationsreaktion. Führen Sie anschließend die PCR-Amplifikation durch, um den mutierten Genersatz zu bestätigen und Doppelband-Mutanten oder kontaminierende PCR-Amplifikate genau zu identifizieren. Untersuchen Sie das PCR-Amplifikat vier Stunden lang mittels Gelelektrophorese auf einem Gel, das länger als 12 Zentimeter ist.

Bei dieser Agarose-Gelelektrophorese-Bedingung zeigt ein 2 %iges Agarose-Gel mit Bromid-Färbung. Amplifikate mit einer Differenz von größer oder gleich 100 Basenpaaren können eindeutig identifiziert werden. Alternativ, wenn erwartet wird, dass die Banden, die aus der Amplifikation der Kanamycin-Resistenzkassette und des Wildtyp-Gens resultieren, sich um weniger als 100 Basenpaare unterscheiden, verwenden Sie einen internen T1-Primer des Zielgens, um zu bestimmen, ob das Wildtyp-Gen mittels PCR nachgewiesen werden kann.

Um die Deletion weiter zu bestätigen, reinigen Sie die Amplikone mit dem Pure Link 96 PCR-Reinigungs-Kit und sequenzieren Sie diese unter Verwendung des P-one-Primers, der an die Kanamycin-Resistenzkassette bindet. Behalten Sie nur die korrekten Mutanten, die nach PCR-Amplifikation mittels der Primer F1 und R1 für die upstream gelegene Sequenz sowie F3 und R3 für die downstream gelegene Sequenz durch Sequenzierung bestätigt wurden. Etwa ein Kilobasenpaar upstream und downstream jedes s. sanguinis-Gens wurde im 96-Well-Format unter den PCR-Bedingungen und unter Verwendung der entworfenen Primer erhalten.

Ein spezifisches Produkt wurde aus s-sanguineoser genomischer DNA in jeder PCR-Reaktion amplifiziert, was darauf hindeutet, dass die Primer durch PCR-Reamplifikation unter Verwendung der Primer F1 und R3 hochspezifisch für die Ziele in s sanguinis waren, wobei drei Amplikone als DNA-Vorlagen dienten. Lineare rekombinante PCR-Konstrukte wurden mit hoher Ausbeute erzeugt. Auf einer 96-Well-Platte, bestehend aus einem Bereich upstream jedes Zielgens, einer cany-Kassette und einem Bereich downstream jedes Zielgens in dieser Reihenfolge, wurden die rekombinanten PCR-Konstrukte anschließend in s sanguinis SK36 transformiert und durch cany auf BHI-Agarplatten ausgewählt.

Für die meisten Transformationen wurden auf jeder Platte über 1000 Kolonien nach einer zweitägigen Inkubation unter mikroaeroben Bedingungen erhalten. Wenn diese Kolonien mittels PCR mit den Primern F1 und R3 amplifiziert wurden, zeigte die Gelelektrophorese ein einzelnes DNA-Band, das der erwarteten Mutantengröße entsprach, beim Versuch, potenziell essentielle Gene zu löschen. Bei der Deletion einiger essentieller Gene sollten bei den meisten Transformationen keine Kolonien erhalten werden.

Jedoch wurden nach der Transformation noch immer Kolonien erhalten, und nach PCR-Amplifikation dieser Kolonien mit den Primern F1 und R erschienen zwei DNA-Banden im Gelelektrophoresebild, die der erwarteten Mutanten- und der Wildtyp-Größe entsprachen. Bei einigen Mutanten lagen die erwartete Mutanten- und die Wildtyp-Größe des PCR-Amplikons zu eng beieinander, um sie durch ein langes Agarosegel voneinander zu trennen. In diesem Fall wurde ein interner T1-Primer des Zielgens basierend auf der Wildtyp-Gensequenz entworfen.

Die PCR wurde unter Verwendung des internen T-one-Primers und des F1-Primers durchgeführt. Der Wildtyp SK 36 wurde als positiver Kontrollstamm für diese PCR verwendet. Wenn ein Band mit der erwarteten Größe aus dem Mutanten mit dem internen Primer amplifiziert wurde, galt das Gen als essentielles Gen.

Da das Vorhandensein der Kanamycin-Kassette im Mutanten zuvor durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung des P-one-Primers bestätigt wurde, wurden gemäß diesem Protokoll 2048 Mutanten von nicht essentiellen S.-sanguineus-Genen gesammelt. Vier offene Leserahmen, die vollständig innerhalb anderer offener Leserahmen liegen, wurden ausgeschlossen.

218 Gene, die unter den experimentellen Bedingungen für das Überleben von s sanguine essentiell sind, wurden identifiziert. Nachdem Sie sich diese Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das gesamte Genom erfasst. Genabschnitte werden mittels Hochdurchsatz-PCR analysiert.