Name: Genomweiten Gen-Deletionen in Streptococcus sanguinis Von High Throughput PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: Lernen Sie eine effiziente Methode zur genomweiten Gendeletion in Streptococcus sanguinis mittels Hochdurchsatz-PCR. Diese Technik ermöglicht schnelle genetische Modifikationen zur Untersuchung bakterieller Genfunktionen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01DE018138 von den National Institutes of Health (PX) und zum Teil unterstützt durch Virginia Commonwealth University Presidential Forschung Incentive Program (PRIP) 144602-3 (PX). Wir danken Drs. Lei Chen, Yuetan Dou und Xiaojing Wang für die Unterstützung mit dem Bau der genomweiten Mutanten. Wir danken auch dem DNA Core Facility an der Virginia Commonwealth University für die DNA-Sequenzierung.

Ein. Primer Design <ol><li> Grundierungen werden unter Verwendung im Haus der Script basiert auf der S. sanguinis SK36 Genomsequenz. Drei Sätze von Primern, F1/R1, F2/R2 und F3/R3 sind zur Amplifikation des 1-kb stromaufwärts Sequenz des Ziel-Gens, das aphA-3 kodierenden Gens Kanamycinresistenz (Km r) Protein 3 und der 1 ausgelegt -kb stromabwärts Sequenz des Zielgens, bzw. (Abbildung 1). Unter dieser Primer sind F1 und R3 entwickelt mit ePrimer3 im EMBOSS Suite von Programmen ( <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a> ) an flankierenden Regionen stromaufwärts oder stromabwärts zu verstärken des Ziels Gen. Genspezifischen Primern, R1 und F3, werden basierend auf der 5 &#39;und 3&#39;-Sequenzen des Zielgens gestalten. R1 und F3 Primer enthalten 25-bp-Adapter-Sequenzen an ihrem 5&#39;-Ende, die komplementär zu dem aphA-3 sindGen. Die Schmelztemperaturen von jedem Primer wurden entwickelt, um so nah wie möglich auf 60 ° C um die Verwendung eines einheitlichen Glühtemperatur für alle PCR-Reaktionen in 96-Well-Format zu ermöglichen. </li><li> F1, R1, R3 und F3 Primer werden in 96-Well-Platten auf ein Gen Reihenfolge basierend synthetisiert. Jede Platte enthält eine Art von Primer im gleichen Gen sortiert. Verdünnt den Primer in 96-Well-Platte arbeitet Primer zu einer Endkonzentration von 10 uM zur PCR-Amplifikation unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. </li></ol> 2. High-throughput PCR-Amplifikation und Reinigung <ol><li> Mit hohem Durchsatz amplifizieren 1-kb stromaufwärts oder stromabwärts des Ziels S. sanguinis Gene, montieren ein PCR-Cocktail Mischung auf Eis in einem 15-ml konischen Röhrchen mit 1640 ul ddH 2 O, 250 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul 10 mM dNTP-Gemisch, 100 ul 50 mM MgSO 4, 100 ul 10 ng / ul S. sanguinis SK36 genomische DNA und 10 ul Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity und Transfer 23 ul des Gemisches in jedes Well auf 96-well PCR-Platte mit einer Mehrkanalpipette. Übertragen 1 ul jeder F1 und R1 (oder F3 und R3) aus den 10 uM arbeiten Primer Platten der PCR-Platte mit Mehrkanalpipette. Abzudichten und die PCR-Platte durchzuführen Amplifikation bei 94 ° C für 1 min und 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 54 ° C für 30 sec und 68 ° C für 1,5 min. </li><li> Bereiten 1% Agarosegel mit Ethidiumbromid mit 48 Kavitäten Montage Mehrkanalpipette loading. Mix 4 ul PCR-Produkt mit 1 ul 5xDNA Ladepuffer auf 96-Well-Platte und laden Sie die Proben auf Agarosegel unter Verwendung eines 10-ul Mehrkanalpipette. Führen Elektrophorese bei 135 V für 30 min. Untersuchen Sie das Band auf Gel unter UVP Dokumentation und Analyse-System. </li><li> Reinigen die PCR-Produkte durch PureLink 96 PCR Purification Kit unter Verwendung von Zentrifugation nach der Anleitung des Herstellers. Zum Eluieren DNA, fügen Sie 40 ul sterilem ddH 2 O zum Wohl des binding Platte. </li><li> Zufallsprinzip auswählen mehreren gereinigten Amplifikate auf der Platte, um die DNA-Konzentrationen mit NanoDrop Spektralphotometer prüfen. Die Konzentration der Amplikons auf Platte zu ~ 10 ng / ul. </li><li> Ein Plasmid enthaltenden Km r Kassette mit EcoR I verdaut als PCR-Template. Die verdaute Plasmid wird durch QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und das lineare Plasmid-DNA wird auf DNA-Endkonzentration 10 ng / ul eingestellt. Montieren Sie 25 ul Mischung Kilometer r Kassette Amplikon einschließlich 16,4 ul ddH 2 O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul 10 mM dNTP-Gemisch, 1 ul 50 mM Mg SO 4, 1 ul 10 uM F2, 1 ul 10 uM R2, 1 ul lineare Plasmid-DNA und 0,1 ul Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity. Eine PCR-Amplifikation bei 94 ° C für 1 min und 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec und 68 ° C für 1 min. Untersuchen des PCR-Produkts durch Gelelektrophorese an 1% Agarose. Poola Großteil des Km r Kassette Amplikon aus 10 einzelnen PCR gereinigte von QIAquick-PCR. Passen Sie die Amplikon-Konzentration auf 10 ng / ul. </li><li> Um die endgültige lineare rekombinante PCR Amplikon erhalten, werden drei PCR Amplikons mit je 1 ul (in fast gleich-molaren Mengen) in ein PCR-Platte sowie die PCR-Vorlage kombiniert. Andere PCR-Komponenten, einschließlich 14,4 ul ddH 2 O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul 10 mM dNTP-Gemisch, 1 ul 50 mM Mg SO 4, 1 ul 10 uM F1, 1 ul 10 uM R3, 0,1 ul Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity. PCR-Amplifikation bei 94 ° C für 2 min, 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec 55 ° C durchgeführt für 30 sec und 68 ° C für 3,5 min und schließlich 68 ° C für 4 min. </li><li> Untersuchen Sie die PCR Amplifikate im Agarosegel. Läutern und Quantifizierung der PCR-Amplikons wie oben beschrieben. Einfrieren der rekombinierten PCR Amplikons bei -20 ° C. </li></ol> 3. Comzuständigen Cells Vorbereitung <ol><li> Todd-Hewitt-Bouillon hergestellt wird, auf 7,6 eingestellten pH-Wert mit 10 N NaOH, erhitzt zum Sieden und kühlt dann auf Raumtemperatur und sterilisiert unter Verwendung 0,22 um Polystyrol-Filter 4. Fügen Sie 300 ul hitzeinaktiviertem Pferdeseren (Endkonzentration 2,5%) auf 11,7 ml Todd Hewitt Broth in 15-ml konischen Röhrchen, um Make-up TH + HS Medium. Aliquot TH + HS Medium in 2 ml und 10 ml in Tuben. </li><li> Beimpfen 5 ul Lager S. sanguinis SK36 bei -80 ° C in 2 ml TH + HS Medium eingefroren und inkubiere die Kultur über Nacht mit Capping fest bei 37 ° C, durch Vorinkubieren der 10 ml-TH + HS Rohr begleitet. </li><li> Nachdem über Nacht übertragen 50 ul Kultur in 10 ml TH + HS und inkubieren des Rohres bei 37 ° C für 3 Stunden (entspricht OD 660 von 0,07 bis 0,08), sofort mit der Transformation. </li></ol> 4. Zelltransformation und Antibiotika-Selektion <ol><li> Add 2 ul 70 ng S. sanguinis SK36 Kompetenztenz stimulierende Peptid (CSP) und 2 ul linearen rekombinanten PCR Amplikon (~ 50 ng) in Eppendorf-Röhrchen auf 96-Well-Block und Pre-warm sie bei 37 ° C. Übertragen 330 ul 3 hr-inkubierten SK36 Kultur in jedes Röhrchen. Bei 37 ° C für 1 Stunde. Ersetzen DNA mit sterilem ddH 2 O als Kontrolle. </li><li> Legen Sie den Block auf Eis und verteilt 100 ul jeder Transformation auf Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Platte mit 500 ug / ml Kanamycin. Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C für 2 d unter mikroaeroben Bedingungen. </li></ol> 5. Mutant Bestätigung und Lagerung <ol><li> Für jeden Ersatz Mutante, zufällig abholen 2 einzelnen Kolonien, impfen die Kolonie in 5 ml BHI mit 500 ug / ml Kanamycin und inkubieren das Inokulum mikroaerob über Nacht bei 37 ° C. Kryokonservierung jede Kultur in 30% Glycerin bei -80 ° C </li><li> Um zu untersuchen, ob die Mutante, die die erwartete Gen-Ersatz, führen Kolonie-PCR für jede Mutante mit F1 und R3Primer in 96-well PCR-Platte. Etwa 1 ul-Übernachtkultur von einzelnen Kolonie wird als DNA-Matrize in 25 ul-PCR-Amplifikationsreaktion verwendet. PCR wird bei 94 ° C für 5 min, 35 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 Sekunden durchgeführt und 68 ° C für 3,5 min und schließlich 68 ° C für 4 min. </li><li> Zur genauen Bestimmung Doppelbandpresse Mutanten oder Verunreinigung PCR Amplikon, prüft die PCR-Amplicon durch Elektrophorese für 4 h auf&gt; 12 cm lang 2% Agarosegel mit Ethidiumbromid. Unter diesem Agarosegelelektrophorese Zustand, wurden alle Amplikons mit ≥ 100 bp Unterschied eindeutig identifiziert. Wenn Bands aus Amplifikation der Km r Kassette und dem Wildtyp-Gen werden voraussichtlich durch &lt;100 bp, ein interner T1 Primer verwendet, um festzustellen, ob eine Wildtyp-Gens durch PCR nachgewiesen werden kann unterschiedlich sein. </li><li> Zur weiteren bestätigen Sie den Löschvorgang werden die Fragmente durch PureLink 96 PCR Purification Kit gereinigt und sequenziert mit dem P1-Primer,bindet an das Km r Kassette. Halten einzig richtige Mutanten durch Sequenzierung bestätigt. </li></ol>

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<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Bacillus+subtilis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li>
<li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3%275%22-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li>
<li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li>
<li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+%28sic%29+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li>
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<li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li>
<li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li>
<li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Um die möglichen polaren Effekte der Ersatz eines Zielgens mit exogenen Antibiotika-Gen auf benachbarten Genen zu minimieren, sind zwei Schritte gemacht, während erste Primer entwerfen. Für die meisten der Gene gelöscht werden der Primer R1 und F3 entworfen, um die codierende Region von 6 bp nach dem Startcodon und 30 bp vor dem Stopcodon löschen. Die letzten 30 Basenpaare zurückgehalten werden, um potenzielle ribosomale Bindungsstelle durch das benachbarte, nachgeschaltete Gen verwendet schützen. Das verbliebene Bereic...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Namen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalog #</strong</td&gt;<td<strong&gt; Kommentare (optional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Integrated DNA Technologies</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer R2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2p</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P1</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Sequenz: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNA Polymerase</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; Restriktionsenzym</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agar</td&gt;<td&gt; American Bioanalytical</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agarose</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Brain Heart Infusion</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pferdeserum</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; Pferdeserum</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Km</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamycin</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH Brühe</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Todd Hewitt Broth</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 PCR Purification Kit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; QIAquick PCR Purification Kit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Filter</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; 0,22 um Polystyrol-Filter</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anoxomat-System</td&gt;<td&gt; Mart Microbiology bv</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tischzentrifuge</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall Legend RT Plus Mikrotiterplatten Rotors</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gel-Dokumentation</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Incubator</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet die Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet die Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifuge</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Mikrozentrifuge 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mehrkanalpipetten</td&gt;<td&gt; Thermo Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermal Cycler</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Inc.</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR-System 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genomweiten gen-deletionen in<em&gt; streptococcus sanguinis</em&gt; von high throughput pcr

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon-Mutagenese-und Single-Gen-Deletion gibt zwei Methoden in genomweiten Gen-Knockout in Bakterien 1,2 angewendet. Obwohl Transposon-Mutagenese ist weniger zeitaufwendig, weniger kostspielig und erfordert keine abgeschlossene Genom Informationen gibt es zwei Schwachstellen in diesem Verfahren: (1) die Möglichkeit einer unterschiedlichen Mutanten in der gemischten Mutantenbibliothek daß der Zähler-wählt Mutanten mit verminderter Wettbewerb; und (2) die Möglichkeit eines teilweisen Geninaktivierung wobei Gene nicht vollständig verlieren ihre Funktion nach dem Einsetzen eines Transposons. Single-Gen-Deletion Analyse kann für die Nachteile, die mit der Transposon-Mutagenese zu kompensieren. Um die Effizienz der genomweiten einzigen Gen-Deletion zu verbessern, versuchen wir, einen hohen Durchsatz Technik für genomweite einzigen Gen-Deletion mit Streptococcus sanguinis als Modellorganismus zu etablieren. Jedes Gendeletion in S. konstruieren sanguinis Genom soll 1 umfassen-Kb stromaufwärts des Zielgens, das aphA-3-Gen, kodierend Kanamycinresistenz Protein und 1-kb stromabwärts des Zielgens. Drei Sätze von Primern F1/R1, F2/R2 und F3/R3 sind jeweils entworfen und synthetisiert in einer 96-Well-Platte Format für PCR-Amplifikationen von diesen drei Komponenten jedes Deletion konstruieren. Primer R1 und F3 enthalten 25-bp-Sequenzen, die komplementär zu Regionen der aphA-3-Gen an ihrem 5&#39;-Ende sind. Eine große Skala PCR-Amplifikation des aphA-3-Gen wird einmal für die Erstellung aller Single-Gendeletion Konstrukte durchgeführt. Der Promotor aphA-3-Gen wird zunächst ausgeschlossen, um das Potenzial polaren Effekt Kanamycinkassette minimieren. Um die Gendeletion Konstrukte zu erzeugen, werden Hochdurchsatz-PCR-Amplifikation und Reinigung in einem 96-Well-Platten-Format durchgeführt wird. Eine lineare rekombinante PCR Amplikon für jedes Gen Löschung wird nach oben durch vier PCR-Reaktionen mit High-Fidelity DNA-Polymerase erfolgen. Die anfängliche exponential Wachstumsphase S. sanguinis in Todd-Hewitt-Brühe kultiviert, ergänzt mit 2,5% inaktiviertem Pferdeserum wird verwendet, um die Zuständigkeit für die Transformation von PCR-rekombinante Konstrukte zu erhöhen. Unter dieser Bedingung bis zu 20% von S. sanguinis transformierten Zellen können unter Verwendung ~ 50 ng der DNA werden. Basierend auf diesem Ansatz wurden 2.048 Mutanten mit Single-Gen-Deletion letztendlich von den 2.270 Gene in S. erhalten sanguinis außer vier Gen-ORFs, die vollständig innerhalb anderen ORFs in S. sanguinis SK36 und 218 potentielle essentiellen Gene. Die Technik zur Erstellung von Gen-Deletion Konstrukte ist mit hohem Durchsatz und könnte leicht in genomweiten Gen Löschungen für alle transformable Bakterien verwenden.

Nach der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer und R1 F1 und F3 und R3, etwa 1-kb stromaufwärts und stromabwärts jeder S. sanguinis Gen wurden in 96-Well-Format bzw. (2A) erhalten. Unter unserer PCR-Bedingungen und mit entworfenen Primern wurde ein bestimmtes Produkt aus S. verstärkt sanguinis genomischen DNA in jeder PCR-Reaktion. Dieses Ergebnis zeigt die Primer waren sehr spezifisch für die Ziele der S. sanguinis. Durch PCR-Amplifikation mit erneute Primer ...

Eine effiziente genomweiten Gen-Mutation Methode ermittelt worden<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Als Modellorganismus. Diese Methode wurde über einen hohen Durchsatz rekombinanten PCRs und Transformationen erreicht.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Die Transposon-Mutagenese und die Einzelgen-Deletion sind zwei Methoden, die für den genomweiten Gene-Knockout in Bakterien eingesetzt werden 1,2. Obwohl die Transposon-Mutagenese ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittels Hochdurchsatz-PCR genomweite Einzelgen-Deletionen in Streptococcus sanguinis durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst drei Amplifikate mittels Hochdurchsatz-PCR-Amplifikation gewonnen werden, darunter das Antibiotikaresistenzgen sowie die upstream und downstream gelegenen DNA-Sequenzen des Zielgens. Der zweite Schritt besteht darin, das lineare rekombinante PCR-Amplifikat unter Verwendung der drei PCR-Amplifikate als Matrizen zu erhalten.Anschließend werden die kompetenten s sanguine-Zellen vorbereitet. Im letzten Schritt wird der lineare rekombinante PCR-Amplicon in kompetente s sanguineous-Zellen transformiert. Schließlich dienen Kolonie-A-PCR-Amplifikation und DNA-Sequenzierung der Bestätigung der korrekten Mutanten.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber erschöpfenden anderen Methoden wie dem Suizid-Plasmid-Knockout besteht darin, dass mit dieser Methode direkt genomweite Deletionsmutanten im Hochdurchsatzverfahren erzeugt werden können. PCR-Primer können wie in dem schriftlichen Protokoll beschrieben unter Verwendung von hauseigenen Skripten, die auf der Streptococcus sanguinis SK36-Genomsequenz basieren, entworfen und synthetisiert werden. Drei Primer-Sets wurden für die Amplifikation der eintausend Basenpaare upstream liegenden Sequenz des Zielgens, des A PHA drei Gen ENC kodierenden Proteins und des Proteins für Kanamycinresistenz sowie der eintausend Basenpaare downstream liegenden Sequenz des Zielgens entworfen.Gen-spezifische Primer. R one und F three werden basierend auf den 5'- und 3'-Sequenzen des Zielgens entworfen, um den ein Kilobase langen upstream- oder downstream-Bereich der Ziel-s-sanguine-Gene mit hoher Durchsatzkapazität zu amplifizieren. Stellen Sie zunächst eine PCR-Cocktailmischung auf Eis in einem 15-Milliliter-Konischgefäß zusammen.Siehe den Text für die Bestandteile der PCR-Mischung, die genomische DNA von s sanguineous enthält; übertragen Sie 23 Mikroliter der Mischung mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer 96-Loch-PCR-Platte. Für die upstream gelegene Sequenz des Zielgens übertragen Sie jeweils ein Mikroliter von F1 und R1 aus 10-Mikromolar-Arbeitsprimerplatten auf die PCR-Platte, und zwar ebenfalls mit der Mehrkanalpipette. Wiederholen Sie dies mit den Primern F3 und R3, um die downstream gelegene Sequenz des Zielgens zu amplifizieren. Versiegeln Sie die PCR-Platte und führen Sie die Amplifikation bei 94 Grad Celsius für eine Minute durch, gefolgt von 30 Zyklen à 94 Grad Celsius für 30 Sekunden.54 Grad Celsius für 30 Sekunden und 68 Grad Celsius für 1,5 Minuten. Nach der Amplifikation ein 1 %iges Agarosegel mit Bromid, das für eine 48-Loch-Platte geeignet ist und das Beladen mit einer Mehrkanalpipette ermöglicht, vorbereiten. Vier Mikroliter des PCR-Produkts mit einem Mikroliter 5× DNA-Ladepuffer mischen.Auf einer 96-Well-Platte die Proben mit einer 10-µL-Multikanalpipette auf ein Aros-Gel auftragen. Elektrophorese 30 Minuten lang bei 135 Volt durchführen. Die Bande im Gel mit einem UVP-Dokumentations- und Analysesystem untersuchen.Reinigen Sie die PCR-Produkte mithilfe des Pure Link 96 PCR-Reinigungs-Kits durch Zentrifugation gemäß den Herstelleranweisungen zur Elution von DNA. Geben Sie 40 Mikroliter steriles, doppelt destilliertes Wasser in jedes Loch der Bindungsplatte. Wählen Sie zufällig mehrere gereinigte Amplikone auf der Platte aus, um die DNA-Konzentrationen zu überprüfen.Passen Sie mithilfe eines NanoDrop-Spektrophotometers die Konzentration der Amplifikate in der Platte auf etwa 10 Nanogramm pro Mikroliter an. Verdauen Sie anschließend mit eco R one ein Plasmid, das die Kanamycin-Resistenz gisette enthält, damit es als PCR-Vorlage dienen kann. Reinigen Sie das geschnittene Plasmid mit dem kayak quick PCR-Reinigungs-Kit und stellen Sie die endgültige DNA-Konzentration der linearen Plasmid-DNA auf 10 Nanogramm pro Mikroliter ein.Stellen Sie eine 25-Mikroliter-PCR-Mischung für das Kanamycin-Resistenz-Cassette-Amplicon her, einschließlich der in der schriftlichen Anleitung aufgeführten Primer F zwei und R zwei. Begleitend zu diesem Video führen Sie die PCR-Amplifikation wie hier beschrieben durch. Um das PCR-Produkt zu untersuchen, führen Sie eine Gelelektrophorese auf einem 1%-Agarosegel durch.Anschließend werden die Amplifikate der Kanamycin-Resistenzkassette aus 10 PCR-reinigten Individuen gesammelt. Die Amplikonkonzentration wird auf 10 Nanogramm pro Mikroliter eingestellt. Der schwierigste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, das endgültige linear kompetente PCR-Amplifikat aus seinen drei PCR-Amplifikat-Vorläufern zu erhalten.Um den Erfolg sicherzustellen, werden die drei PCR-Ansatzter auf nahezu gleiche Mengen eingestellt. Kombinieren Sie je einen Mikroliter der drei 10 Nanogramm pro Mikroliter PCR-Aons in einer PCR-Platte sowie die PCR-Vorlage. Bereiten Sie anschließend die PCR-Mischung vor, einschließlich der in der schriftlichen Anleitung aufgeführten F1- und R-Drei-Primer.Führen Sie als Nächstes die PCR-Amplifikation der Proben durch. Untersuchen Sie die PCR-AMPLICONS nach Reinigung und Quantifizierung der PCR-Amplicons in einem Agarosegel. Wie zuvor frieren Sie die rekombinierten PCR-Amplicons bei minus 20 Grad Celsius ein.Bereiten Sie zunächst Todd-Hewitt-Medium mit Pferdeserum gemäß der schriftlichen Anleitung vor, die diesem Video beiliegt. Aliquotieren Sie zwei Milliliter Medium und zehn Milliliter Medium in zwei 15-Milliliter-Konischgefäße. Inokulieren Sie fünf Mikroliter aufgetauten Stamm s. sanguinis SK 36, der bei minus 80 Grad Celsius eingefroren war, in zwei Milliliter Medium. Inkubieren Sie die fest verschlossene Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius.Brüten Sie auch das 10-Milliliter-Mediumröhrchen unter den gleichen Bedingungen nach einer Übernacht-Inkubation vor. Übertragen Sie 50&nbsp;Mikroliter der Kultur in das 10-Milliliter-Mediumröhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37&nbsp;°C für drei Stunden.Nach der Inkubation sofort zwei Mikroliter einer 70 Nanogramm pro Milliliter enthaltenden sanguinen SK-36-Kompetenz-stimulierenden Peptidlösung und zwei Mikroliter des linearen rekombinanten PCR-Amplicons zu den Röhrchen in einem 96-Loch-Block geben und bei 37 Grad Celsius vorwärmen. 330 Mikroliter der dreistündigen inkubierten SK-36-Kultur in jedes Röhrchen überführen. Als Kontrolle die DNA durch steriles, doppelt destilliertes Wasser ersetzen.Die Röhrchen nach der Inkubation eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Den Block auf Eis stellen und 100 Mikroliter jeder Transformation auf Brain-Heart-Infusion- oder BHI-Agarplatten mit 500 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin auftragen. Die Platten zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius unter mikroaeroben Bedingungen inkubieren. Für jeden Replacements-Mutanten zufällig zwei einzelne Kolonien auswählen und jede Kolonie in fünf Milliliter BHI mit 500 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin impfen. Jeden Inokulum über Nacht bei 37 Grad Celsius unter mikroaeroben Bedingungen inkubieren.Jede Kultur in 30 % Glycerin bei minus 80 Grad Celsius kryokonservieren. Um zu überprüfen, ob der Mutant die erwartete Genersetzungen enthält, Kolonien-PCR für jeden Mutanten unter Verwendung der Primer F1 und R3 in einer 96-Loch-PCR-Platte durchführen.Verwenden Sie etwa ein Mikroliter Übernachtkultur von jeder einzelnen Kolonie als DNA-Vorlage in einer 25-Mikroliter-PCR-Amplifikationsreaktion. Führen Sie anschließend die PCR-Amplifikation durch, um den mutierten Genersatz zu bestätigen und Doppelband-Mutanten oder kontaminierende PCR-Amplifikate genau zu identifizieren. Untersuchen Sie das PCR-Amplifikat vier Stunden lang mittels Gelelektrophorese auf einem Gel, das länger als 12 Zentimeter ist.Bei dieser Agarose-Gelelektrophorese-Bedingung zeigt ein 2 %iges Agarose-Gel mit Bromid-Färbung. Amplifikate mit einer Differenz von größer oder gleich 100 Basenpaaren können eindeutig identifiziert werden. Alternativ, wenn erwartet wird, dass die Banden, die aus der Amplifikation der Kanamycin-Resistenzkassette und des Wildtyp-Gens resultieren, sich um weniger als 100 Basenpaare unterscheiden, verwenden Sie einen internen T1-Primer des Zielgens, um zu bestimmen, ob das Wildtyp-Gen mittels PCR nachgewiesen werden kann.Um die Deletion weiter zu bestätigen, reinigen Sie die Amplikone mit dem Pure Link 96 PCR-Reinigungs-Kit und sequenzieren Sie diese unter Verwendung des P-one-Primers, der an die Kanamycin-Resistenzkassette bindet. Behalten Sie nur die korrekten Mutanten, die nach PCR-Amplifikation mittels der Primer F1 und R1 für die upstream gelegene Sequenz sowie F3 und R3 für die downstream gelegene Sequenz durch Sequenzierung bestätigt wurden. Etwa ein Kilobasenpaar upstream und downstream jedes s. sanguinis-Gens wurde im 96-Well-Format unter den PCR-Bedingungen und unter Verwendung der entworfenen Primer erhalten.Ein spezifisches Produkt wurde aus s-sanguineoser genomischer DNA in jeder PCR-Reaktion amplifiziert, was darauf hindeutet, dass die Primer durch PCR-Reamplifikation unter Verwendung der Primer F1 und R3 hochspezifisch für die Ziele in s sanguinis waren, wobei drei Amplikone als DNA-Vorlagen dienten. Lineare rekombinante PCR-Konstrukte wurden mit hoher Ausbeute erzeugt. Auf einer 96-Well-Platte, bestehend aus einem Bereich upstream jedes Zielgens, einer cany-Kassette und einem Bereich downstream jedes Zielgens in dieser Reihenfolge, wurden die rekombinanten PCR-Konstrukte anschließend in s sanguinis SK36 transformiert und durch cany auf BHI-Agarplatten ausgewählt.Für die meisten Transformationen wurden auf jeder Platte über 1000 Kolonien nach einer zweitägigen Inkubation unter mikroaeroben Bedingungen erhalten. Wenn diese Kolonien mittels PCR mit den Primern F1 und R3 amplifiziert wurden, zeigte die Gelelektrophorese ein einzelnes DNA-Band, das der erwarteten Mutantengröße entsprach, beim Versuch, potenziell essentielle Gene zu löschen. Bei der Deletion einiger essentieller Gene sollten bei den meisten Transformationen keine Kolonien erhalten werden.Jedoch wurden nach der Transformation noch immer Kolonien erhalten, und nach PCR-Amplifikation dieser Kolonien mit den Primern F1 und R erschienen zwei DNA-Banden im Gelelektrophoresebild, die der erwarteten Mutanten- und der Wildtyp-Größe entsprachen. Bei einigen Mutanten lagen die erwartete Mutanten- und die Wildtyp-Größe des PCR-Amplikons zu eng beieinander, um sie durch ein langes Agarosegel voneinander zu trennen. In diesem Fall wurde ein interner T1-Primer des Zielgens basierend auf der Wildtyp-Gensequenz entworfen.Die PCR wurde unter Verwendung des internen T-one-Primers und des F1-Primers durchgeführt. Der Wildtyp SK 36 wurde als positiver Kontrollstamm für diese PCR verwendet. Wenn ein Band mit der erwarteten Größe aus dem Mutanten mit dem internen Primer amplifiziert wurde, galt das Gen als essentielles Gen.Da das Vorhandensein der Kanamycin-Kassette im Mutanten zuvor durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung des P-one-Primers bestätigt wurde, wurden gemäß diesem Protokoll 2048 Mutanten von nicht essentiellen S.-sanguineus-Genen gesammelt. Vier offene Leserahmen, die vollständig innerhalb anderer offener Leserahmen liegen, wurden ausgeschlossen.218 Gene, die unter den experimentellen Bedingungen für das Überleben von s sanguine essentiell sind, wurden identifiziert. Nachdem Sie sich diese Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das gesamte Genom erfasst. Genabschnitte werden mittels Hochdurchsatz-PCR analysiert.

genome-wide-gene-deletions-streptococcus-sanguinis-high-throughput

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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