Isolieren Primäre Melanozyten-ähnlichen Zellen aus der Maus Herz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, lebensfähige kardiale Melanozyten-ähnliche Zellen aus dem Mausherz zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Herzen von euthanasierten Mäusen entnommen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Herzen zu zerkleinern und die Zellen durch enzymatische Verdauung und mechanische Bewegung zu dissoziieren.

Als nächstes wird die Aufschlämmung der Zellen zentrifugiert und das Pellet, das die Kardiomyozyten und melanozytenähnlichen Zellen enthält, wird reanimationssuspendiert. Der letzte Schritt ist das Anrichten und Kulturen. Die Zellen, die schließlich isoliert wurden, können für Patch-Studien oder Microarray-Analysen als Reaktion auf pathophysiologische Stressoren verwendet werden, um die zelluläre Erregbarkeit oder den Status des Transkriptoms zu beurteilen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Verfahren zur Isolierung und Kultivierung der Kardiomyozyten besteht darin, dass sie zur Isolierung vieler tragbarer kardialer Melanozyten wie Zellen führt. Nun, die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir eine neue Zellpopulation, das Mausherz, entdeckten und wir ihre Physiologie untersuchen wollten. Bereiten Sie zunächst zwei Sätze sterilisierter chirurgischer Instrumente vor, eines zum Präparieren des Herzens und eines zum Zerkleinern des Gewebes.

Bereiten Sie als Nächstes die Medienzusätze vor, aber warten Sie mit der Zugabe zu den Nährmedien bis kurz vor dem Plattieren der Zellen. Lagern Sie das Medium nach der Vorbereitung des Nährmedienfilters zur Sterilisation der Lösung, während Sie in einer Gewebekulturhaube arbeiten, bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie die eine DNA-Lösung vor, indem Sie 0,05 Gramm DNA, ein bis 100 Milliliter DPBS mit 10% FBS plus Antibiotika hinzufügen.

Bereiten Sie als Nächstes eine 0,5%ige Tryinlösung vor, indem Sie 0,5 Gramm Trypsin zu 100 Millilitern DPBS plus Antibiotika hinzufügen. Stellen Sie schließlich weitere Geräte zusammen, die für den Abschluss des Verfahrens erforderlich sind, darunter Petrischale, konische 50-Milliliter-Röhrchen, 40-Mikron-Zellsiebe, DPBS plus Antibiotika, 60-Millimeter- und 35-Millimeter-Kulturschalen. Nachdem Sie P null auf P zwei neugeborene Mäusewelpen eingeschläfert haben, wischen Sie ihre Brust mit Alkohol ab und legen Sie sie in eine 10 Zentimeter große P Zwei-Schale. Mit DPBS arbeiten Sie unter einem Stereomikroskop, öffnen Sie vorsichtig die Brusthöhle und entfernen Sie das gesamte Herz mit den daran befestigten Vorhöfen.

Waschen Sie die Herzen in DPBS und geben Sie sie in eine neue 10 Zentimeter große Petrischale. Schieben Sie die Petrischale mit den herausgeschnittenen Herzen in eine Gewebekulturhaube und befolgen Sie die sterile Technik für die folgenden Schritte. Waschen Sie die Herzen zunächst dreimal in sterilem DPBS plus Antibiotika.

Legen Sie die Herzen in eine 60-Millimeter-Kulturschale und fügen Sie sechs bis acht Milliliter 0,5%-Trips in Lösung hinzu. Als nächstes schneidest du die Herzen in kleine Stücke und brütest sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, ziehen Sie die resultierende Lösung aus der Schale in ein steriles konisches 10-Milliliter-Röhrchen.

Mit einer sterilen 10-Milliliter-Pipette die Lösung schnell, aber schonend 30 bis 50 Mal neu bewerten, filtrieren Sie die resultierende Suspension durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein neues, sauberes konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Nach der Zentrifugation wird das Supinat vorsichtig abgesaugt und das verbleibende Pellet in sechs bis acht Millilitern sterilem DPBS resuspendiert. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Mal.

Nach dem dritten Spülgang nach der Zentrifugation die Waschlösung vorsichtig abtropfen lassen oder absaugen und das Pellet in sechs Millilitern supplementiertem Nährmedium resuspendieren. Anschließend ziehen Sie die resuspendierte Lösung in eine sterile Transferpipette und geben die Zellen in eine 35-Millimeter-Schale. Ziehen Sie die isolierten Herzzellen von drei neugeborenen Mäusen nach einer Inkubation über Nacht, aspirieren Sie das Nährmedium zusammen mit allen nicht angeschlossenen Zellen und spülen Sie die Platten dann einmal mit DPBS aus, fügen Sie den Platten frisches Medium hinzu und ersetzen Sie das Medium.

Alle zwei Tage können Zellen, die aus neonatalen oder embryonalen Herzen isoliert wurden, bis zu drei Wochen in Kultur aufbewahrt werden, während Zellen, die aus adulten Herzen isoliert wurden, bis zu 10 Tage in Kultur aufbewahrt werden können. Um melanozytenähnliche Zellen aus einem erwachsenen Mausherz zu isolieren, waschen Sie die herausgeschnittenen Herzen zunächst in sterilen DPBS, die Antibiotika enthalten, in einer Gewebekulturhaube. Drücken Sie das Herz mit einer gebogenen Präparierzange leicht zusammen, um das restliche Blut zu entfernen, und spülen Sie das Herz dann noch einmal mit DPBS aus.

Entfernen Sie anschließend die Vorhöfe und den atrialen ventrikulären Ring von den Herzen und legen Sie die Proben des Verbrauchsgewebes in eine 35-Millimeter-Schale. Schneide die Herzen mit einer gebogenen Schere und Pinzette in kleine Stücke. Geben Sie sechs bis acht Milliliter 0,5%-Trips in Lösung in die Schale und inkubieren Sie sie 45 bis 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Wiederholen Sie nach der Inkubation die zuvor gezeigten Schritte, um eine Suspension von adulten Herzzellen und Thrombozyttieren zu erhalten. In diesem Beispiel kennzeichnet der weiße Pfeil den kardialen Melanozyten in beiden Feldern. Beachten Sie, dass ohne die Hilfe des Fluoreszenzmarkers die kardialen Melanozyten schwer zu identifizieren und von den atrialen Myozyten zu unterscheiden sind, die hellblaue Pfeilspitze zeigt auf Vorhofzellen, die nicht gut an die hier gezeigte Schale gebunden sind, gesunde kardiale Melanozyten, die aus einem neonatalen Mausherz isoliert wurden.

Sie haben ausgedehnte dendritische Prozesse entwickelt und ähneln stark den kutanen Melanozyten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lebensfähige Melanozytenzellen aus dem Herzen isoliert

Das eignet sich für physiologische und molekulare Analysen.