Isolieren Primäre Melanozyten-ähnlichen Zellen aus der Maus Herz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lebensfähige, kardiale, melanocytenähnliche Zellen aus dem Mausherzen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Herzen von euthanasierten Mäusen entnommen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Herzen zu zerkleinern und die Zellen durch enzymatische Verdauung und mechanische Rühren zu dissoziieren.

Anschließend wird die Zellsuspension zentrifugiert und das Pellet, das die Kardiomyozyten und melanocytenähnlichen Zellen enthält, resuspendiert. Der letzte Schritt besteht im Ausplattieren und Kultivieren. Die letztlich isolierten kardialen melanocytenähnlichen Zellen können für Patch-Clamp-Untersuchungen oder Mikroarray-Analysen als Reaktion auf pathophysiologische Stressfaktoren verwendet werden, um die zelluläre Erregbarkeit oder den Zustand des Transkriptoms zu bewerten.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Kardiomyozyten liegt darin, dass sie zur Isolierung zahlreicher tragbarer, kardialer Melanozyten-ähnlicher Zellen führt. Unsere erste Idee zu dieser Methode entstand, als wir eine neue Zellpopulation im Mausherzen entdeckten und deren Physiologie untersuchen wollten. Bereiten Sie zunächst zwei Sätze steriler chirurgischer Instrumente vor, einen zum Herausschneiden der Herzen und einen anderen zum Zerkleinern des Gewebes.

Bereiten Sie anschließend die Mediumszusätze vor, fügen Sie diese jedoch erst unmittelbar vor dem Ansäen der Zellen dem Kulturmedium hinzu. Nach der Herstellung filtern Sie das Kulturmedium zur Sterilisation der Lösung im Gewebekulturwerkbank und lagern das Medium bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie die DNA-Lösung her, indem Sie 0,05 Gramm DNA in 100 Milliliter DPBS mit 10 % FBS sowie Antibiotika geben.

Bereiten Sie anschließend eine 0,5 %ige Trypsin-Lösung vor, indem Sie 0,5 Gramm Trypsin zu 100 Milliliter DPBS mit Antibiotika hinzufügen. Sammeln Sie schließlich die weiteren Geräte, die für den Ablauf des Verfahrens benötigt werden, einschließlich Petrischalen, 50-Milliliter-Konischen Röhrchen, 40-Mikron-Zellsiebe, DPBS mit Antibiotika, 60-Millimeter- und 35-Millimeter-Kulturschalen. Nach der Tötung von P null bis P zwei neugeborenen Mäusewelpen wischen Sie deren Brust mit Alkohol ab und legen sie in eine 10-Zentimeter-P-zwei-Schale mit DPBS. Unter einem Stereomikroskop arbeitend, öffnen Sie vorsichtig die Brusthöhle und entfernen das gesamte Herz mit den anhängenden Vorhöfen.

Spülen Sie die Herzen in DPBS und überführen Sie sie in eine neue 10 cm große Petrischale. Bringen Sie die Petrischale mit den entnommenen Herzen in eine Gewebekulturhaube und befolgen Sie für die folgenden Schritte die sterilen Techniken. Waschen Sie die Herzen zunächst dreimal in steriler DPBS mit Antibiotika.

Legen Sie die Herzen in eine 60 Millimeter große Kulturschale und geben Sie sechs bis acht Milliliter einer 0,5 %igen Trips-Lösung hinzu. Schneiden Sie anschließend die Herzen in kleine Stücke und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach Beendigung der Inkubation ziehen Sie die entstandene Lösung aus der Schale in ein steriles 10-Milliliter-Konischgefäß auf.

Unter Verwendung einer sterilen 10-Milliliter-Pipette die Lösung schnell, aber vorsichtig 30 bis 50 Mal umpipettieren und die resultierende Suspension durch einen 40-Mikron-Zellfilter in ein neues, sauberes 50-Milliliter-Konischgefäß filtrieren. Nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand abpipettieren und das verbleibende Pellet in sechs bis acht Milliliter sterilem DPBS resuspendieren. Diesen Schritt noch zweimal wiederholen.

Nach der dritten Spülung nach der Zentrifugation sorgfältig die Waschlösung abgießen oder abpipettieren und das Pellet in sechs Milliliter ergänztem Kulturmedium resuspendieren. Anschließend die resuspendierte Lösung in eine sterile Transferpipette aufziehen und die Zellen in eine 35-Millimeter-Schale geben. Isolierte Herzzellen von drei neugeborenen Mäusen nach einer Übernachtsinkubation gewinnen, das Kulturmedium zusammen mit eventuell nicht angehefteten Zellen abpipettieren und die Schalen dann einmal mit DPBS spülen, frisches Medium hinzufügen und das Medium ersetzen.

Jede zwei Tage können Zellen, die aus neugeborenen oder embryonalen Herzen isoliert wurden, bis zu drei Wochen lang in Kultur gehalten werden, während Zellen, die aus erwachsenen Herzen isoliert wurden, bis zu 10 Tage in Kultur gehalten werden können. Um melanocytenähnliche Zellen aus einem Herzen einer erwachsenen Maus zu isolieren, spülen Sie zunächst die entfernten Herzen in steriler DPBS, die Antibiotika enthält, in einer Zellkulturwerkbank. Drücken Sie das Herz leicht mit einer gebogenen anatomischen Pinzette zusammen, um verbleibendes Blut zu entfernen, und spülen Sie das Herz anschließend noch einmal in DPBS.

Entfernen Sie anschließend die Vorhöfe und den atrioventrikulären Ring von den Herzen und legen Sie die entnommenen Gewebeproben in eine 35 Millimeter große Petrischale. Schneiden Sie die Herzen mit einer gebogenen Schere und einer Pinzette in kleine Stücke. Geben Sie sechs bis acht Milliliter einer 0,5 %igen Trypsinlösung zur Schale hinzu und inkubieren Sie diese bei 37 Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten.

Nach der Inkubation die zuvor gezeigten Schritte wiederholen, um eine Suspension von adulten Herzzellen und Platten vorher zu erhalten. In diesem Beispiel identifiziert der weiße Pfeil das Herzmelanocyten in beiden Darstellungen. Beachten Sie, dass das Herzmelanocyten ohne die Hilfe des fluoreszierenden Markers schwer zu erkennen und von den an die Schale angehefteten atrialen Myozyten zu unterscheiden ist; der hellblaue Pfeil zeigt auf atriale Zellen, die hier dargestellt nicht gut an der Schale befestigt sind, gesunde Herzmelanocyten, die aus dem Herzen einer neugeborenen Maus isoliert wurden.

Sie weisen umfangreiche dendritische Fortsätze auf und ähneln stark kutanen Melanozyten. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie lebensfähige Melanozytenzellen aus dem Herzen isoliert werden können.

Das eignet sich für physiologische und molekulare Analysen.