Name: Isolieren Primäre Melanozyten-ähnlichen Zellen aus der Maus Herz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung primärer melanozytenähnlicher Zellen aus dem Mäuseherz durch enzymatische Verdauung und Zentrifugation. Diese Methode ermöglicht Studien zur Zellerregbarkeit und Arrhythmieforschung.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Award R01 HL105734 zu VVPMDL gelagert ist, zum Teil, von der National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. VVP ist eine innovative Forscher von der American Heart Association von Grant 11IRG900384 unterstützt.

1. Vorbereitung die notwendigen Lösungen und Anlagen <ol><li> Erstens, die chirurgischen Instrumente zu sterilisieren (gerade Form einer Pinzette, gebogene Form einer Pinzette, Schere gerade Form und gekrümmter Form einer Schere) durch Autoklavieren sie für 15 min. bei 121 ° C aufweist. Bereiten Sie 2 Sets von Instrumenten, wo ein Satz zum Präparieren Sie sich die Herzen und den anderen Satz verwendet wird, zum Zerkleinern das Gewebe verwendet werden. </li><li> Lösen Sie 1 Päckchen MCDB153 Kulturmedien in 900 ml sterilisiertem, gefiltertem Wasser und langsam rühren, bis das Pulver aufgelöst hat. Fügen Sie 1,2 g Natriumbicarbonat, oder 15,7 ml Natriumhydrogencarbonat-Lösung [7,5% w / v], für jeden Liter Gesamtvolumen von Medium vorbereitet und rühren bis gelöst. Den pH-Wert auf 7,2 durch Zugabe von entweder 1 N HCl oder 1 N NaOH, dann gießen Sie das Medium durch einen 0,2 um Flasche Top-Filter unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube (Biosicherheitswerkbank). Dann sammeln die Medien und speichern sie bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie die Ergänzungenin den Kulturmedien (Materialliste). Die Zuschläge sollen die Medien unmittelbar vor der Datenträger für die Plattierung der Zellen benötigt hinzugefügt werden. </li><li> Vorbereitung DPBS mit 10% FBS und Antibiotika (Penicillin und Streptomycin). </li><li> Als nächstes bereiten 0,25% Trypsin-Lösung durch Zugabe von 0,25 g Trypsin (Rinderpankreas, Aktivität&gt; 2500 USP Einheiten / mg, hochreines, USB) und 100 ml DPBS und Antibiotika (Penicillin und Streptomycin). </li><li> Weitere benötigte Ausrüstung benötigt, um dieses Verfahren abschließen gehören ein Stereomikroskop, Petrischalen (10 cm), 50 ml konischen Röhrchen, 40-um-Zelle Siebe, DPBS sowie Antibiotika, 60-mm-Kulturschalen und 35-mm-Kulturschalen. </li></ol> 2. Trenn Herzen von Neugeborenen Maus Pups <ol><li> Erstens erhalten P0 bis P2 neonatalen Maus Jungtieren (n = 6 bis 8). Es wird empfohlen, Welpen durch Züchtung Dct-Cre homozygote Weibchen mit Männchen, die heterozygot für entweder die R26R erzeugt verwenden: EYFP Allel oder der Z / EG-Allel, das EtikettMelanozyten-ähnlichen Zellen. Sowohl R26R: EYFP und Z / EG Mäuse sind von Jackson Laboratories (Lager Zahlen 006.148 und 003.920, beziehungsweise). </li><li> Als nächstes einschläfern der Neugeborenen-Maus Welpen, wischen ihre Brust mit einem Alkoholtupfer und legen Sie dann die Welpen in einer 10 cm Petrischale mit DPBS. </li><li> Schneiden Sie die Haut über der Brust und das Brustbein mit sterilisierten Pinzette und Schere und öffnen Sie dann die Brust sorgfältig unter einem Stereomikroskop. Die Herzen der neonatalen Maus Welpen sind sehr klein, so vorsichtig sein, um sicherzustellen, dass die gesamte Herz mit den Vorhöfen angebracht entfernen. </li><li> In DPBS waschen die Herzen und übertragen Sie sie auf einem neuen 10-cm-Petrischale. </li></ol> 3. enzymatische Verdauung <ol><li> Bringen Sie die Petrischale mit den ausgeschnittenen Herzen, um eine Gewebekultur Kapuze (Biosicherheitswerkbank) und folgen Sie dann die folgenden Schritte unter Verwendung von sterilen Techniken in der Kapuze. </li><li> Zunächst dreimal waschen die Herzen in sterilen DPBS und Antibiotika. </li><li> Legen Sie die Herzen (n = 6-8) in ein60-mm-Kulturschale und fügen 6-8 ml 0,5% Trypsin-Lösung in die Schale. </li><li> Weiter schneiden die Herzen in kleine Stücke (von weniger als 1 mm in der Größe) und inkubieren bei 37 ° C für 30 min in einer 5% CO 2 Atmosphäre. </li><li> Nach der Inkubationszeit beendet ist, gieße die resultierende Lösung von Herzgewebe und Trypsin von der Schale in eine sterile 50-ml konischen Röhrchen. </li><li> Dann, mit einem 10-ml sterile Pipette, schnell, aber sanft, verreiben Sie die Lösung in der 50-ml konischen Röhrchen 30-50 mal. </li><li> Filtern der resultierenden Lösung durch ein 40 um-Sieb Zelle auf einem neuen, sauberen 50 ml konischen Röhrchen, um das Filtrat zu sammeln. </li><li> Weiter Zentrifugation der 50-ml-Röhrchen bei 240 x g in einer Tischzentrifuge 5 min bei Raumtemperatur. Dann vorsichtig den Überstand absaugen und Pellet resuspendieren übrigen in 6-8 ml steriler DPBS. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male. Dieser Schritt Holzpellets die Vorhofmyozyten und Herz Melanozyten aber nicht bringen den fiDa Fibroblasten Fibroblasten sind kleiner und werden im Überstand verbleiben. </li></ol> 4. Auflage Herz Melanozyten-ähnlichen Zellen <ol><li> Nach der dritten Spülung nach der Zentrifugation vorsichtig ablassen oder absaugen der Waschlösung (DPBS) und das Pellet in 6 ml MCDB Kulturmedien, denen die Ergänzungen wurden hinzugefügt. </li><li> Nun ziehen die resuspendierten Lösung in einem sterilen Transferpipette und legen Sie die Zellen in einer 35-mm-Schale oder in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte, und bündeln die isolierten Herzzellen von neugeborenen Mäusen 3 in einem 35-mm-Schale oder auch. </li><li> Geschirr Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre, absaugen dem Kulturmedium zusammen mit allen anhaftende Zellen und dann die Platten einmal gründlich mit DPBS. Dann fügen Sie frisches Medium zu den Platten und ersetzen die Medien alle 2 Tage. Zellen, die aus embryonalen oder neonatalen Herzen isoliert in Kultur für bis zu 3 Wochen beibehalten werden, während Zellen aus erwachsenen hören isoliertts in Kultur für bis zu 10 Tage gehalten werden. </li></ol> 5. Trennherz Melanozyten-ähnlichen Zellen aus adulten Maus Herz <ol><li> Entfernen Sie zunächst die Herzen von reifen Mäuse (3-4 Wochen alt, n = 3) durch eine Mittellinie Sternotomie nach Verabreichung von Heparin 100 U intraperitoneale den Mäusen und dann euthanizing ihnen. Es wird empfohlen, Pentobarbital verwenden, um Mäuse für dieses Verfahren einschläfern, aber dieses Medikament ist nicht an allen Standorten verfügbar. </li><li> Nächsten, waschen Sie die ausgeschnitten Herzen in sterilen DPBS Antibiotika enthalten in einer Gewebekultur Haube (Biosicherheitswerkbank). Drücken Sie die Herzen leicht mit geschwungenen Dissektionszangen, um alle verbleibenden Blut aus ihnen zu entfernen und dann spülen Sie die Herzen in DPBS noch einmal. </li><li> Entfernen Sie den Vorhöfen und AV-Ringraum von den Herzen (diese Strukturen enthalten die Melanozyten-ähnlichen Zellen) und legen Sie die ausgeschnittenen Gewebeproben in einem 35-mm-Schale. </li><li> Schneiden Sie die Herzen in kleine Stücke mit einer gebogenen Schere und Kraftps und fügen 6-8 ml 0,5% Trypsin-Lösung in die Schale. Dann brüten die Gerichte bei 37 ° C für 45-60 min. </li><li> Nun führen Sie die Schritte aus dem oben beschriebenen Verfahren ab Schritt 3.6 ab. </li></ol>

<ol><li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li>
<li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li>
<li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li>
<li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Cardiovasc.+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li>
<li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li>
<li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li>
<li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoblasts+in+culture%3A+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2%2C+stem+cell+factor%2C+and+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li>
<li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li>
<li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Herz Melanozyten sind in anatomischen Stellen innerhalb des Herzens, die häufig Anlass zu Vorhofarrhythmie Trigger vorhanden. Diese Regionen umfassen die Lungenvenen, den atrioventrikulären Annulus, das hintere linke Atrium und das Foramen ovale (Abbildung 4). Um die Rolle dieser Zellen in Arrhythmogenese spielen verstehen, entwickeln wir Techniken, um sie zu isolieren und studieren ihre Physiologie. Jedoch haben wir erkannt, daß eine Verbesserung dieser Technik ergeben gesünder und größeren Mengen von ...

Wir haben vor kurzem identifiziert eine neuartige Zellpopulation im Herzen von Mäusen und Menschen, die Melanin-Synthese Enzyme zu exprimieren und morphologisch ähneln kutanen Melanozyten. Wir als &quot;Herz Melanozyten&quot; Diese Zellen und fanden sie in anatomischen Stellen, an denen Vorhofarrhythmie löst häufig bei Menschen stammen vorhanden sind. Wir fanden auch, Herz Melanozyten dazu beitragen, Vorhofrhythmusstörungen bei Mäusen mit Keimbahn Löschung von DCT. Herz Melanozyten dünn gesamten Maus Vorhof, wo sie weniger als 0,1% aller atrialen Zellen umfassen verteilt. Um die elektrischen und biologischen Eigenschaften von Herz Melanozyten untersuchen wir ein Verfahren, um sie von der Maus mit Herz Cre-induzierbare Melanozyten spezifische Marker zu isolieren entwickelt. Unsere ersten Verfahren wurde von denen zur neonatalen Kardiomyozyten murinen und ergab sehr kleine Zahl von geeigneten für Patch-Clamp-Aufnahmen oder PCR-Analyse entwickelt, Zellen zu isolieren. Jedoch zur Verbesserung der heilenten und die Lebensfähigkeit von Herz Melanozyten, für tiefer gehende Analyse elektrophysiologische oder biochemische Studien entwickelten wir ein verfeinertes Verfahren entwickelt, um von den Melanozyten der Haut zu isolieren. Die beschriebene und in diesem Beitrag gezeigt, Vorgehensweise hat den Vorteil, gesündere Herz Melanozyten, die als reine Population oder mit Kardiomyozyten beschichtet werden können.

<table><tbody><tr><td>MCDB 153</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403</td><td>In Wasser lösen</td></tr><tr><td>DPBS, ohne Calcium und Magnesium</td><td>Invitrogen</td><td>14190136</td><td>Lagerkonzentration: 1x&lt;br/&gt; Arbeitskonzentration: 1x</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>Lagerkonzentration: 100x&lt;br/&gt; Arbeitskonzentration: 1x</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Life Technology</td><td>Zertifiziert</td><td>Arbeitskonzentration: 4 %</td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td>In DMSO lösen&lt;br/&gt;Lagerkonzentration: 3,2 &amp;mu;M&lt;br/&gt;Arbeitskonzentration: 32 nM</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td>In DPBS lösen&lt;br/&gt;Lagerkonzentration: 0,1 mg/ml&lt;br/&gt;Arbeitskonzentration: 1 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Dibutyryl-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>In DPBS lösen&lt;br/&gt;Lagerkonzentration: 0,5 mM&lt;br/&gt;Arbeitskonzentration: 5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>In 10 mM Essigsäure lösen&lt;br/&gt;Lagerkonzentration: 1 mg/ml&lt;br/&gt;Arbeitskonzentration: 5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Grundlegender FGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td>In Wasser lösen&lt;br/&gt;Lagerkonzentration: 4 ng/&amp;mu;l&lt;br/&gt;Arbeitskonzentration: 4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

isolieren primäre melanozyten-ähnlichen zellen aus der maus herz

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

Wir identifizierten eine neue Population von Melanozyten-ähnlichen Zellen (auch als Herz Melanozyten) in den Herzen von Mäusen und Menschen, die an Vorhofrhythmusstörungen Trigger in Mäusen bei. Um die elektrischen und biologischen Eigenschaften von Herz Melanozyten untersuchen wir ein Verfahren, um sie von Mäuseherzen, die wir von denen zur neonatalen Kardiomyozyten Maus zu isolieren abgeleitet isolieren entwickelt. Um gesünder Herz Melanozyten geeignet für umfangreichere Patch-Clamp-oder biochemische Untersuchungen zu erhalten, ein raffiniertes Verfahren entwickelt, die wir für die Isolierung und Beschichtung Herz Melanozyten basierend auf den ursprünglich entwickelt, um Haut-Melanozyten zu isolieren. Die raffinierte Vorgehensweise wird in diesem Beitrag gezeigt und produziert eine größere Anzahl von gesunden Melanozyten-ähnlichen Zellen, die als reine Population oder mit Kardiomyozyten beschichtet werden können.

Die in diesem Artikel beschriebene Protokoll ist eine verbesserte Technik im Vergleich zu der, die wir zuvor für die Isolierung Herz Melanozyten von murinen Herz veröffentlicht. Dieses Verfahren setzt die Verwendung von Fluoreszenzmarkern durch Melaninsynthese enzymspezifische Cre-Rekombinase angetriebenen Herz Melanozyten-ähnlichen Zellen zu markieren. Es ist wichtig, um einen Marker zu verwenden, um Herz Melanozyten Etikett beim Arbeiten mit frisch isolierten embryonalen oder neonataler Zellen, da die morphologischen ...

In diesem Protokoll w e identifiziert eine neue Population von Melanozyten-ähnlichen Zellen (auch als Herz Melanozyten) in den Herzen von Mäusen und Menschen, die an Vorhofrhythmusstörungen löst bei Mäusen bei.

Isolieren Primäre Melanozyten-ähnlichen Zellen aus der Maus Herz

Wir haben eine neue Population melanozytenähnlicher Zellen (auch bekannt als Herzmelanozyten) in den Herzen von Mäusen und Menschen identifiziert, die zu atrialen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lebensfähige, kardiale, melanocytenähnliche Zellen aus dem Mausherzen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Herzen von euthanasierten Mäusen entnommen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Herzen zu zerkleinern und die Zellen durch enzymatische Verdauung und mechanische Rühren zu dissoziieren.Anschließend wird die Zellsuspension zentrifugiert und das Pellet, das die Kardiomyozyten und melanocytenähnlichen Zellen enthält, resuspendiert. Der letzte Schritt besteht im Ausplattieren und Kultivieren. Die letztlich isolierten kardialen melanocytenähnlichen Zellen können für Patch-Clamp-Untersuchungen oder Mikroarray-Analysen als Reaktion auf pathophysiologische Stressfaktoren verwendet werden, um die zelluläre Erregbarkeit oder den Zustand des Transkriptoms zu bewerten.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Kardiomyozyten liegt darin, dass sie zur Isolierung zahlreicher tragbarer, kardialer Melanozyten-ähnlicher Zellen führt. Unsere erste Idee zu dieser Methode entstand, als wir eine neue Zellpopulation im Mausherzen entdeckten und deren Physiologie untersuchen wollten. Bereiten Sie zunächst zwei Sätze steriler chirurgischer Instrumente vor, einen zum Herausschneiden der Herzen und einen anderen zum Zerkleinern des Gewebes.Bereiten Sie anschließend die Mediumszusätze vor, fügen Sie diese jedoch erst unmittelbar vor dem Ansäen der Zellen dem Kulturmedium hinzu. Nach der Herstellung filtern Sie das Kulturmedium zur Sterilisation der Lösung im Gewebekulturwerkbank und lagern das Medium bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie die DNA-Lösung her, indem Sie 0,05 Gramm DNA in 100 Milliliter DPBS mit 10 % FBS sowie Antibiotika geben.Bereiten Sie anschließend eine 0,5 %ige Trypsin-Lösung vor, indem Sie 0,5 Gramm Trypsin zu 100 Milliliter DPBS mit Antibiotika hinzufügen. Sammeln Sie schließlich die weiteren Geräte, die für den Ablauf des Verfahrens benötigt werden, einschließlich Petrischalen, 50-Milliliter-Konischen Röhrchen, 40-Mikron-Zellsiebe, DPBS mit Antibiotika, 60-Millimeter- und 35-Millimeter-Kulturschalen. Nach der Tötung von P null bis P zwei neugeborenen Mäusewelpen wischen Sie deren Brust mit Alkohol ab und legen sie in eine 10-Zentimeter-P-zwei-Schale mit DPBS. Unter einem Stereomikroskop arbeitend, öffnen Sie vorsichtig die Brusthöhle und entfernen das gesamte Herz mit den anhängenden Vorhöfen.Spülen Sie die Herzen in DPBS und überführen Sie sie in eine neue 10 cm große Petrischale. Bringen Sie die Petrischale mit den entnommenen Herzen in eine Gewebekulturhaube und befolgen Sie für die folgenden Schritte die sterilen Techniken. Waschen Sie die Herzen zunächst dreimal in steriler DPBS mit Antibiotika.Legen Sie die Herzen in eine 60 Millimeter große Kulturschale und geben Sie sechs bis acht Milliliter einer 0,5 %igen Trips-Lösung hinzu. Schneiden Sie anschließend die Herzen in kleine Stücke und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach Beendigung der Inkubation ziehen Sie die entstandene Lösung aus der Schale in ein steriles 10-Milliliter-Konischgefäß auf.Unter Verwendung einer sterilen 10-Milliliter-Pipette die Lösung schnell, aber vorsichtig 30 bis 50 Mal umpipettieren und die resultierende Suspension durch einen 40-Mikron-Zellfilter in ein neues, sauberes 50-Milliliter-Konischgefäß filtrieren. Nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand abpipettieren und das verbleibende Pellet in sechs bis acht Milliliter sterilem DPBS resuspendieren. Diesen Schritt noch zweimal wiederholen.Nach der dritten Spülung nach der Zentrifugation sorgfältig die Waschlösung abgießen oder abpipettieren und das Pellet in sechs Milliliter ergänztem Kulturmedium resuspendieren. Anschließend die resuspendierte Lösung in eine sterile Transferpipette aufziehen und die Zellen in eine 35-Millimeter-Schale geben. Isolierte Herzzellen von drei neugeborenen Mäusen nach einer Übernachtsinkubation gewinnen, das Kulturmedium zusammen mit eventuell nicht angehefteten Zellen abpipettieren und die Schalen dann einmal mit DPBS spülen, frisches Medium hinzufügen und das Medium ersetzen.Jede zwei Tage können Zellen, die aus neugeborenen oder embryonalen Herzen isoliert wurden, bis zu drei Wochen lang in Kultur gehalten werden, während Zellen, die aus erwachsenen Herzen isoliert wurden, bis zu 10 Tage in Kultur gehalten werden können. Um melanocytenähnliche Zellen aus einem Herzen einer erwachsenen Maus zu isolieren, spülen Sie zunächst die entfernten Herzen in steriler DPBS, die Antibiotika enthält, in einer Zellkulturwerkbank. Drücken Sie das Herz leicht mit einer gebogenen anatomischen Pinzette zusammen, um verbleibendes Blut zu entfernen, und spülen Sie das Herz anschließend noch einmal in DPBS.Entfernen Sie anschließend die Vorhöfe und den atrioventrikulären Ring von den Herzen und legen Sie die entnommenen Gewebeproben in eine 35 Millimeter große Petrischale. Schneiden Sie die Herzen mit einer gebogenen Schere und einer Pinzette in kleine Stücke. Geben Sie sechs bis acht Milliliter einer 0,5 %igen Trypsinlösung zur Schale hinzu und inkubieren Sie diese bei 37 Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten.Nach der Inkubation die zuvor gezeigten Schritte wiederholen, um eine Suspension von adulten Herzzellen und Platten vorher zu erhalten. In diesem Beispiel identifiziert der weiße Pfeil das Herzmelanocyten in beiden Darstellungen. Beachten Sie, dass das Herzmelanocyten ohne die Hilfe des fluoreszierenden Markers schwer zu erkennen und von den an die Schale angehefteten atrialen Myozyten zu unterscheiden ist; der hellblaue Pfeil zeigt auf atriale Zellen, die hier dargestellt nicht gut an der Schale befestigt sind, gesunde Herzmelanocyten, die aus dem Herzen einer neugeborenen Maus isoliert wurden.Sie weisen umfangreiche dendritische Fortsätze auf und ähneln stark kutanen Melanozyten. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie lebensfähige Melanozytenzellen aus dem Herzen isoliert werden können.Das eignet sich für physiologische und molekulare Analysen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Eine antegrade Perfusionsmethode zur Kardiomyozytenisolation von Mäusen

Der Goldstandard in der Kardiologie für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente sind Kardiomyozyten. Dieser Artikel beschreibt Anpassungen an die Nicht-Langendorff-Technik zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten.

Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

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Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

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Erfahren Sie die Isolierung primärer melanozytenähnlicher Zellen aus dem Mäuseherz durch enzymatische Verdauung und Zentrifugation. Diese Methode ermöglicht Studien zur Zellerregbarkeit und Arrhythmieforschung.

Isolieren Primäre Melanozyten-ähnlichen Zellen aus der Maus Herz

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