Eine neue Methode für die Kultur und polarisierte Stimulation der menschlichen Darmschleimhaut Explantate

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die in-vivo-Situation zur Stimulierung der menschlichen Darmschleimhaut nachzuahmen. Dies wird erreicht, indem ein Caver-Zylinder auf der apikalen Seite des Gewebes verklebt wird, um zu verhindern, dass der Stimulus mit der basolateralen Seite in Kontakt kommt. In einem zweiten Schritt wird der Stimulus appliziert, was die Analyse der ausgelösten Immunantwort ermöglicht.

Anschließend wird der Reiz von der apikalen Seite des Gewebes entfernt, um es 24 bis 36 Stunden lang lebensfähig zu erhalten. Die erhaltenen Ergebnisse können unterschiedliche Wirkungen verschiedener probiotischer Stämme anhand von Daten der Immunhistochemie, der Zytokinausschüttung, der Profilanalyse und dergleichen zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der ASIC-Kammer besteht darin, dass die Analyse von bis zu 20 Bedingungen gleichzeitig ermöglicht wird.

Es ermöglicht eine Verlängerung der Kulturzeit auf bis zu 36 Stunden und liefert zudem ausreichend Material für verschiedene Analysemethoden wie D-N-A-R-N-A-Analysen, Immunhistochemie, Zytokinfreisetzung und dergleichen. Obwohl dieses Verfahren Erkenntnisse im Bereich der Probiotika liefern kann, ist es ebenfalls für andere Technologien geeignet und zur Untersuchung der Wirkung weiterer Immunmodulatoren wie Biopharmazeutika, entzündungshemmende Arzneimittel und ähnliches einsetzbar. Gewebe der Darmschleimhaut von gesunden Personen oder von Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen muss während eines chirurgischen Eingriffs gewonnen werden.

Nachdem das Präparat exzidiert wurde, schnell in das Labor überführen und es dabei gekühlt in HBSS mit Penicillin-Streptomycin halten. Anschließend das Gewebe durch Waschen mit Puffer säubern und jegliches mesenteriale Material entfernen. Danach die Mukosaschicht unter Verwendung steriler Scheren und Pinzetten vom Submukosa-Gewebe trennen, wobei das Gewebe stets im HBSS-Puffer verbleibt.

In einer Petrischale ist es nicht notwendig, das Gewebe vollständig untergetaucht zu halten, berühren Sie die Mukosaoberfläche jedoch mit der Pinzette so wenig wie möglich. Schneiden Sie die Mukosa anschließend in Streifen, die mindestens einen Zentimeter breit und so lang wie möglich sind, und verwenden Sie dabei zwei sterile Skalpelle in einer Weise, die dem Zuschneiden von Lebensmitteln ähnelt. Spülen Sie die Mukosa danach vorsichtig aus und reinigen Sie sie in kalzium- und magnesiumfreiem HBSS.

Schließlich die Schleimhautstreifen auf einer Petrischale mit den apikalen Seiten nach oben ausbreiten. Zunächst frisches TIS-DMEM herstellen. Danach eine 10 cm große Petrischale mit etwa 30 Milliliter des F-B-S-N-A füllen und ein Eisengitter vollständig in die Lösung eintauchen.

Halten Sie die Platte offen und platzieren Sie Plastikzylinder auf der Platte. Abdecken. Saugen Sie nun drei Mikroliter chirurgischen Klebstoff in eine Pipette und tragen Sie den Klebstoff vorsichtig auf eine der Kanten eines Plastikzylinders auf, während Sie diesen mit der Pinzette festhalten. Setzen Sie danach den Zylinder vorsichtig auf die apikale Seite der Schleimhaut so nah wie möglich an einen der Streifenränder, während der Klebstoff trocknet.

Geben Sie 850 bis 1000 Mikroliter Medium in das mittlere Loch der Gewebekulturplatte und stützen Sie das Eisengitter an den Rändern des zentralen Lochs ab. Mit zwei Skalpellen schneiden Sie nun das überschüssige Gewebe an den Rändern des Zylinders ab. Heben Sie anschließend den Zylinder mit dem daran haftenden Gewebe vorsichtig an und legen Sie die basolaterale Seite des Gewebes auf das Eisengitter in der Mitte der Platte.

Als Nächstes mit der Gewebestimulation fortfahren. Die gewünschten Stimuli in der gewünschten Konzentration in der Mitte des Plastikzylinders auftragen. Den Zylinder oder die Mukosaloberfläche mit der Pipettenspitze nicht stören und die Oberfläche innerhalb des Zylinders gleichmäßig bedecken.

Jetzt das Gewebe bis zu drei Stunden inkubieren. Eine Inkubation von mehr als drei Stunden ist ebenfalls unter Verwendung eines geringeren Volumens an Stimulationslösung möglich. Nach der Inkubation die Stimuli von der apikalen Oberfläche des Gewebes entfernen, sie jedoch nicht durch frisches Medium ersetzen.

Das Hinzufügen von Medium würde das Gewebe ersticken. Füllen Sie nun den Sauerstoffbehälter mit einem Atmosphärendruck von 100 % Sauerstoff für eine Kulturzeit von 24 Stunden. Seien Sie stets vorsichtig beim Umgang mit der Sauerstoffflasche und vergewissern Sie sich, dass sie nach Gebrauch ordnungsgemäß verschlossen ist.

Nach der 24-Stunden-Stimulationskultur entfernen Sie den Zylinder mithilfe eines Skalpells vorsichtig vom Gewebe, indem Sie den Kleber sanft abkratzen. Anschließend fixieren Sie das Gewebe für IHC- oder Immunfluoreszenzanalysen. Für die Genexpression oder Proteinanalyse gefrieren Sie das Gewebe sofort in flüssigem Stickstoff ein.

Als Nächstes das basolaterale Medium zur Zytokinfreisetzung-Profilierung gewinnen. Danach das Medium in ein Zentrifugenröhrchen überführen und den Zelltrümmerpellet gemäß des beschriebenen Protokolls abzentrifugieren. Gesundes und IBD- menschliches Darmepithel wurde mindestens 24 Stunden lang kultiviert, wobei das Wohlbefinden des Gewebes erhalten blieb.

Dies war nur möglich, wenn mindestens 85 % der Kulturzeit in einer sauerstoffreichen Umgebung stattfand. Konventionell kultivierte Mukosa schneidet nicht so gut ab. Das gesunde Gewebe wurde anschließend mit proinflammatorischen, invasiven Salmonellen stimuliert.

Zwei Stunden nach der Inokulation war bereits ein Zerfall der oberen Epithelschicht im Vergleich zu den Kontrollen erkennbar. Nach 24 Stunden hatte sich die Degeneration deutlich ausgeprägt. Eine ausführlichere Diskussion experimenteller Anwendungen mit veröffentlichten Ergebnissen findet sich in der schriftlichen Manuskriptfassung nach deren Erstellung.

Diese Technik hat den Weg für Forscher im Bereich der Gastroenterologie geebnet, die Interaktion zwischen Wirt und Mikrobe im Magen-Darm-Trakt zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine humane Darmschleimhaut in Kultur hält und oberflächlich stimuliert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Proben äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens stets die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.