Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) mit Auditive Stimulation in Singvögel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen optimierten Protokollablauf zur erfolgreichen Visualisierung der Schallwahrnehmung und -verarbeitung in auditorischen und Gesangssteuerungsregionen des Gehirns von Singvögeln mittels funktioneller MRT darzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst hochwertige akustische Reize vorbereitet werden, die in ein Ein-Aus-Block-Paradigma integriert werden können, um dem Vogel während der funktionellen MRT- oder FMRI-Aufnahme präsentiert zu werden. Der zweite Schritt besteht darin, den Vogel auf die Aufnahme vorzubereiten, indem er zunächst anesthesiert und anschließend auf einer angepassten Tierliege positioniert wird, die danach in die Öffnung des MRT-Geräts eingeschoben wird. Anschließend können während der auditorischen Stimulation FMRI-Bilder aufgenommen werden.

Der letzte Schritt besteht darin, die gewonnenen MRT-Daten vorzuverarbeiten, einschließlich der Normalisierung der Bilder auf den Zebrafinken-Atlas. Schließlich wird eine statistische voxelbasierte Analyse verwendet, um die erhaltenen Ergebnisse zu visualisieren und die durch die akustischen Reize hervorgerufenen Hirnaktivierungen zu lokalisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen, in der Sunbird-Forschung häufiger verwendeten Methoden wie Elektrophysiologie, Histologie und molekularen Kartierungstechniken besteht darin, dass die funktionelle MRT eine nichtinvasive in-vivo-Methode ist, die es ermöglicht, denselben Probanden über die Zeit zu untersuchen und das gesamte Gehirn gleichzeitig und hypothesenunabhängig hinsichtlich der Lokalisation der an dem untersuchten Prozess beteiligten neuronalen Substrate zu analysieren.

Personen, die mit dieser Methode neu sind, könnten Schwierigkeiten haben, da die Durchführung einer funktionellen MRT bei Vögeln sehr unterschiedlich und weitaus anspruchsvoller ist als bei Menschen oder Nagetieren. Dies liegt nicht nur an der geringen Größe ihres Gehirns, sondern auch daran, dass ihr Schädel aus zahlreichen Luftkavitäten besteht, was Suszeptibilitätsartefakte verursacht. Durch die Verwendung einer Spin-Echo-Sequenz, die weniger anfällig für diese Artefakte ist als eine Gradientenecho-Sequenz, können wir eine ganzheitliche funktionelle Bildgebung des Gehirns von Singvögeln mit sehr guter räumlicher Spezifität durchführen. Die Öffnung des Scanners ist ein beengter Raum, der die akustischen Reize verzerren kann.

Daher zur Vorbereitung dieses Protokolls die Schallreize aufnehmen, während sie innerhalb des Bohrlochs des 7-T-MR-Systems mit einem faseroptischen Mikrofon abgespielt werden, und die Verzerrungen für das verwendete MRT-System überprüfen. Hier sehen wir die verstärkten und unterdrückten Frequenzen, wie sie durch die Aufnahmen von weißem Rauschen außerhalb des Scanners und an der Position des Vogelkopfes innerhalb des Magnetbohrlochs gezeigt werden. Um diese künstliche Verstärkung auszugleichen, wenden Sie eine Equalizer-Funktion auf jeden Stimulus unter Verwendung der Wave-Lab-Software für die dargestellte Versuchsanordnung an.

In diesem Protokoll besteht die Funktion aus einem Gaußschen Kern mit den auf dem Bildschirm angezeigten Parametern. Hierbei sollten die akustischen Stimuli aus mehreren einzelnen Gesangsmotiven eines bestimmten Vogels bestehen, die mit Phasen der Stille abwechseln; passen Sie die Dauer dieser stillen Phasen an, um die Gesamtmenge an Schall und Stille über alle Stimuli hinweg identisch zu halten. Die Gesamtlänge jedes Stimulus beträgt 16 Sekunden, was der Aufnahmedauer von zwei fMRT-Bildern entspricht.

Normalisieren Sie mit Vorbereitungssoftware die Intensität jedes Musikstücks hinsichtlich des gleichen Effektivwerts (root mean square) und verwenden Sie einen Hochpassfilter bei 400 Hertz, bevor Sie es in den vollständigen Stimulus integrieren. Das Experiment kann mit Präsentationssoftware unter Verwendung eines Ein-Aus-Block-Designs konzipiert werden, bei dem sich Phasen auditorischer Stimulation mit Ruhephasen abwechseln. Jeder Block sollte 16 Sekunden dauern, was der Aufnahmedauer von zwei Bildern entspricht; jeder Stimulus-Typ wird 25-mal präsentiert, was zur Aufnahme von 50 Bildern pro Stimulus und Proband führt.

Die Reihenfolge der Bedingungen sollte innerhalb und zwischen den Probanden randomisiert werden. Richten Sie außerdem das experimentelle Paradigma so ein, dass es Trigger vom Scanner empfängt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Scanner-Software während des Scannens bei jeder Wiederholung innerhalb der fMRT-Sequenz einen Trigger an die Audiopräsentations-Software sendet, die daraufhin die Scan-Nummer registriert und den entsprechenden Befehl ausführt.

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das speziell für die Verwendung erwachsener Zebrafinken angepasst ist. Zebrafinken sollten in Volieren unter einem 12-Stunden-Licht-, 12-Stunden-Dunkel-Photoperiode gehalten werden und während der gesamten Studie jederzeit Zugang zu Futter und Wasser haben. Die minimale Anzahl an Tieren pro Experiment beträgt 15.

Diese Zahl berücksichtigt die Empfindlichkeit der Spin-Echo-fMRT und die natürliche interindividuelle Variabilität der in dem Experiment gemessenen biologischen Phänomene. Um sich auf das Experiment vorzubereiten, verbinden Sie zuerst die Schnabelmaske mit dem Gasreglergerät mittels Kunststoffschläuchen und montieren Sie sie auf dem MRT-Bett eines 7-T-MR-Systems. Öffnen Sie beide Sauerstoff- und Stickstoffgasflaschen und schalten Sie das Gasreglergerät ein.

Schalten Sie außerdem das rückgekoppelte System und die Warmluftströmungsvorrichtung ein. Betäuben Sie anschließend den Zebrafinken mit 3 % Isofluran in einer Mischung aus Sauerstoff und Stickstoff, indem Sie dessen Schnabel in die Maske einführen und den Kopf festhalten, bis der Vogel vollständig anästhesiert ist. Dies kann überprüft werden, indem man sanft an der Pfote zieht.

Wenn der Vogel vollständig sediert ist, wird die Klaue nicht zurückgezogen. Außerdem werden die Augen des Vogels geschlossen sein. Führen Sie eine kloakale Temperatursonde ein, um die Körpertemperatur während des gesamten Experiments zu überwachen, und legen Sie einen pneumatischen Sensor unter den Bauch, um die Atemfrequenz zu überwachen.

Dann setzen Sie eine Jacke an, um den Körper des Vogels während des gesamten Experiments zu fixieren. Halten Sie die Atemfrequenz zwischen 40 und 100 Atemzügen pro Minute und die Körpertemperatur konstant bei 40 Grad. Falls der Atembereich zu niedrig oder zu hoch ist, passen Sie die Anästhesietiefe entsprechend an.

Wenn das Problem weiterhin besteht, sollte das Experiment abgebrochen und das Tier aus der Versuchsanordnung entfernt werden. Um die Erholung zu fördern, positionieren Sie nichtmagnetische dynamische Lautsprecher auf beiden Seiten des Kopfes des Zebrafinken und schließen Sie diese an den Verstärker an. Achten Sie darauf, dass die Kabel der Lautsprecher vom Temperaturfühler weggeführt werden, da dies die Temperaturmessung beeinflussen kann.

Wenn zu nah, platzieren Sie die Oberflächen-HF-Spule auf dem Kopf des Zebrafinken. Positionieren Sie dann den Zebrafinken in der Mitte des Magneten. Verringern Sie abschließend die Anästhesietiefe auf 1,5 % ISO-Fluoran, bevor Sie mit der Aufnahme beginnen.

Um mit der Aufnahme zu beginnen, bestimmen Sie zunächst die Position des Gehirns im Magnetfeld. Erhalten Sie einen Satz einzelner Schicht-Gradienten-Echo-Scout-Bilder in sagittaler, horizontaler und koronarer Ebene sowie Multischicht-Scout-Bilder, die anschließend zur Positionierung der funktionellen Aufnahmen verwendet werden. Danach verringern Sie das Rauschen der Gradienten, indem Sie deren Anstiegszeiten auf 1000 Mikrosekunden erhöhen.

Bereiten Sie anschließend eine schnelle Akquisitions-Relaxationsverstärkung, auch bekannt als rare T2-gewichtete fMRT-Sequenz, vor. Verschreiben Sie dann 15 sagittale Schichten, die nahezu das gesamte Gehirn abdecken. Wählen Sie nun das auditorische Protokoll in der Präsentationssoftware aus, um sicherzustellen, dass die auditorische Präsentationssoftware keinen Trigger vom Scanner verpasst.

Starten Sie zuerst das auditorische Protokoll. Sobald das Protokoll vollständig geladen ist, beginnen Sie die FMRI-Sequenz. Jeder FMRI-Versuch sollte durch die Aufnahme von 10 Platzhalterbildern vorangestellt werden, um dem Signal zu ermöglichen, einen stationären Zustand zu erreichen, bevor die auditorische Stimulation beginnt.

Nach Abschluss der Erfassung nullen Sie die Daten auf 64 durch 64 auf, um die Datenqualität zu bestimmen. Werfen Sie einen vorläufigen Blick auf die Ergebnisse, indem Sie das funktionelle Werkzeug verwenden.

Berechnen Sie in der ParaVision-Software die differentielle BOLD-Antwort zwischen allen „on“-Blöcken und der Grundlinie. Wenn in den primären auditorischen Arealen keine Aktivierung zu sehen ist, hat der Vogel die auditorischen Reize wahrscheinlich aufgrund technischer Probleme oder des Anästhesieniveaus nicht gehört oder verarbeitet. Die Versuchsanordnung sollte überprüft und die Messung wiederholt werden.

Nach der funktionellen Erfassung führen Sie eine anatomische 3D seltene T2-gewichtete Sequenz in derselben Orientierung wie die vorherigen fMRT-Aufnahmen durch. Danach nullen Sie auf. Füllen Sie diese Daten auf 256 × 256 × 256 auf.

Entfernen Sie schließlich den Zebrafinken vom MRT-Bett und lassen Sie ihn die Narkose in einem Käfig unter einer Wärmelampe ausklingen. Normalerweise dauert die Erholung eines Zebrafinken nach der Isofluran-Narkose weniger als fünf Minuten. Bereits nach wenigen Minuten wird der Vogel versuchen, sich aufzurichten, und sobald er sich vollständig erholt hat, wird er sich statt auf dem Käfigboden auf einem Ast niedersetzen, um mit der Datenauswertung zu beginnen.

Zunächst müssen die MR-Daten in das Analyze- oder NIfTI-Format konvertiert werden. Vor Beginn der Datenverarbeitung in SPM ist es dann erforderlich, die fMRT-Songbird-Daten anzupassen, indem die Voxelgröße mit 10 multipliziert wird. Da die fMRT-Analysesoftware zur Verarbeitung von fMRT-Daten beim Menschen entwickelt wurde, ist der einfachste Ansatz, die Voxelgröße der Vogel-fMRT-Daten künstlich mittels der MRI-Crow-Software zu vergrößern.

Beachten Sie, dass diese Anpassung die Daten selbst nicht beeinflusst. Es erfolgt keine erneute Stichprobenentnahme oder sonstige Modifikation der Daten. Anschließend werden die erfassten Daten vorverarbeitet.

Mit SPM8 zuerst die fMRT-Daten rejustieren und den anatomischen 3D-Datensatz mit der fMRT-Zeitreihe ko-registrieren. Anschließend die 3D-Daten und die KO-REGISTRIERTE fMRT-Zeitreihe auf den Zebrafinken-Hirn-MRT-Atlas normalisieren.

Wenden Sie die Transformationsmatrix auf den FMRI-Datensatz an und glätten Sie die Daten mit einem 0,5 Millimeter großen Gauß-Kernel. Führen Sie anschließend eine statistische voxelbasierte Analyse in SPM 8 durch, zunächst auf Ebene der einzelnen Vögel, gefolgt von einer Analyse auf Gruppenebene. Visualisieren Sie abschließend die Ergebnisse und lokalisieren Sie die funktionellen Aktivierungen, indem Sie die statistische parametrische Karte auf den Zebrafinken-Atlas, den hochauflösenden 3D-Zebrafinken-Hirn-Atlas, projizieren. Die im beschriebenen Ansatz zur Analyse der Zebrafinken-FMRT-Ergebnisse verwendeten stereotaktischen Koordinaten wurden für dieses Experiment im Bioimaging-Labor entworfen, der MRI-Atlas-Datensatz.

Die Abgrenzungen des Gehirns und der Kerne sind über die hier gezeigte Website frei verfügbar. Hier ist eine Seitenansicht einer 3D-Darstellung der linken Hemisphäre zu sehen, mit abgegrenzten Strukturen aus dem Atlas, die auf ihrer mittelsagittalen Schnittfläche projiziert sind. Hier können wir ein Beispiel für eine fMRT-BOLD-Antwort im primären auditorischen Feld L sowie benachbarter sekundärer auditorischer Regionen sehen, die durch verschiedene auditorische Reize im Vergleich zur Ruhebedingung hervorgerufen wurden.

Die T-Werte sind gemäß der in der Abbildung dargestellten Skala farbkodiert, und es werden nur Voxel angezeigt, bei denen der T-Test als signifikant befunden wurde. Dies ist ein weiteres Beispiel für ein FMRT-Experiment an Zebrafinken. Die Bilder zeigen selektive Reaktionen auf den eigenen Gesang des Vogels in den Gehirnarealen XMLD und HVC.

Die Zahlen unter den Abbildungen geben Koordinaten in Millimetern von der Mittellinie an. Das positive Vorzeichen zeigt an, dass die Schnitte und statistischen Ergebnisse aus der rechten Hemisphäre stammen. Das in diesem Video beschriebene Protokoll kann leicht für Anwendungen bei anderen Singvögeln, wie beispielsweise Staren, angepasst werden.

Dies ist ein Beispiel für die Ergebnisse eines solchen fMRT-Experiments. Bei einer Stieglitz zeigt die Abbildung Aktivierungen, die durch akustische Reize im Vergleich zur Ruhephase im selben Individuum über verschiedene Jahreszeiten hinweg hervorgerufen werden. Die Durchführung und Optimierung der funktionellen MRT bei Singvögeln eröffnet neue Forschungsmöglichkeiten im Bereich der Singvogelforschung.

Es hat sich bereits als wertvolle Technik für die experimentelle Analyse komplexer sensorisch-motorischer und kognitiver Prozesse erwiesen, die der vokalen Kommunikation in diesen Tiermodellen zugrunde liegen. Darüber hinaus kann fMRT dank ihres nichtinvasiven Charakters und des ganzheitlichen Ansatzes als ergänzende Methode eingesetzt werden, um gängigere lokale und invasive Methoden zu ergänzen. Die zunehmende Zahl fMRT-Experimente an SUNBIRDS zeigt ihre Anwendbarkeit für kognitive Forschungsfragen auf, ein zukünftiger Ansatz, der unternommen werden sollte, um die MRT-Experimente weiter auszuweiten. Ein Prozess, der unter Anästhesie aktiv bleibt, ist die Nutzung wacher Versuchstiere, die an den Bildgebungsprotokoll gewöhnt sind.

Dies könnte neue Forschungsmöglichkeiten eröffnen, bei denen Vögel aktiv an EMI-Experimenten teilnehmen können und bei denen die Aufmerksamkeit der Vögel experimentell gesteuert werden kann.