Die synergistische Wirkung von sichtbarem Licht und Gentamycin auf

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, experimentell nachzuweisen, dass die Wirksamkeit von Gentamicin gegen Pseudomonas aeruginosa in Lösung durch sichtbares Licht verstärkt wird. Dies wird erreicht, indem zunächst die experimentelle Bakterienkultur angezüchtet wird. Im zweiten Schritt werden die Bakterien in Gegenwart oder Abwesenheit einer antibiotischen Behandlung mit Licht bestrahlt.

Schließlich werden die Proben über einen Zeitraum von 24 Stunden aus der Kultur gewonnen, und anschließend werden die koloniebildenden Einheiten in der Zellkultur zu jedem Zeitpunkt quantifiziert. Letztendlich kann so der Einfluss der Beleuchtung auf die bakterielle Empfindlichkeit gegenüber der Eliminierung durch eine antibiotische Behandlung bewertet werden. Die Bedeutung dieser Methode reicht bis hin zur in-vivo-Behandlung von Infektionen, da die Beleuchtung die Wirksamkeit der antibiotischen Therapie erhöht.

Die Demonstration des Verfahrens wird von Anna Resnick durchgeführt, einer Masterstudentin in meinem Labor. Beginnen Sie mit dem Anzüchten der gewünschten Bakterienkultur im geeigneten Nährmedium. Hier wird der gramnegative Stamm P. aeruginosa PAO1 in Luria-Bouillon bei 37 °C über Nacht kultiviert.

Als Nächstes die Zellen fünf Minuten lang bei etwa 3.145 ×g und Raumtemperatur zentrifugieren. Anschließend den Überstand entfernen und die Bakterien in 10 % Lauria-Bouillon resuspendieren. Die Zellen weitere zwei Stunden in Lauria-Bouillon bei 37 Grad Celsius weiterwachsen lassen, damit die Kultur erneut in die stationäre Phase eintreten kann. Danach die bakterielle Suspension in zwei Gruppen aufteilen und einer der Gruppen Gentamycin hinzufügen.

Stellen Sie nun jede der Kulturen auf magnetische Rührer und schalten Sie diese ein. Teilen Sie als Nächstes entweder einen Dauerstrich-ND:YAG-Laser oder alternativ einen Q-geschalteten gepulsten ND:YAG-Laser in zwei optische Strahlengänge auf, um die Kulturen zu beleuchten, sobald die Beleuchtung beginnt. Entnehmen Sie etwa alle zwei Stunden über einen Zeitraum von 24 Stunden hinweg jeweils 20 Mikroliter-Proben aus den Kontroll- und antibiotikabehandelten Gruppen.

Am nächsten Tag verdünnen Sie die gewonnenen Proben seriell. Beispielsweise wurden die Bakterien in diesem Experiment achtmal um den Faktor 10 in Inokulationsvolumina von 200 µL verdünnt. Anschließend pipettieren Sie die Verdünnungen auf Lysogen-Brühe-Agarplatten und inkubieren die Proben über Nacht bei 37 °C am folgenden Morgen.

Bestimmen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten oder CFU pro Platte für jede Behandlung und berechnen Sie anschließend die Log-Reduktion an CFU, wie hier dargestellt. Beachten Sie, dass Sie die Werte der koloniebildenden Einheiten zu jedem Zeitpunkt genau zum Zeitpunkt der Messung bezeichnet. CFU bezeichnet die koloniebildende Einheit und C bezeichnet die in der Kontrollprobe zum Startzeitpunkt gefundenen CFU.

Weiterhin entspricht die Einheit der Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter der Anzahl der Kolonien multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor, dividiert durch das Inokulationsvolumen. Hier ist eine schematische Darstellung der laserbasierten Anordnung gezeigt, bei der entweder ein Dauerstrich-NDA-Laser oder ein Q-geschalteter Laser mithilfe eines optischen 50-50-Strahlteilers in zwei Pfade aufgeteilt wird. Beide Proben sind auf einem Rührer positioniert.

Dieses Bild zeigt den experimentellen Aufbau, bei dem der Laserstrahl auf zwei Reagenzgläser aufgeteilt wird, um beide Gläser unter identischen Bedingungen zu behandeln. Eine Kultur wird mit Antibiotika behandelt, die andere dient als unbehandelte Kontrolle. Anschließend werden die Bakterien 24 Stunden lang den Laserstrahlen ausgesetzt.

Dieses Diagramm zeigt die wirksame Beleuchtung beim Wachstum von p aerogen unter Verwendung von Dauerwellen-Laserlicht bzw. Q-geschaltetem Laserlicht in Gegenwart oder Abwesenheit einer antibiotischen Behandlung in den Kontrollproben ohne Lichteinwirkung. Es zeigte sich keine Verringerung der Zellviabilität, unabhängig davon, ob die Kulturen Antibiotika erhielten oder nicht, was darauf hindeutet, dass die Bakterien resistent gegen Gentamicin sind; auch die Behandlung mit dem Laser allein beeinflusste das Zellwachstum nicht. Allerdings wurde bei den Kulturen, die sowohl mit dem Laser als auch mit dem Antibiotikum behandelt wurden, die bakterielle Viabilität um mehrere Größenordnungen reduziert.

Der ausgeprägteste Effekt wurde nach 24 Stunden gemessen, wobei die Kombination aus Dauerstrich- oder Q-Switch-Laser die Lebensfähigkeit der Bakterienzellen im Vergleich zu den Kontrollgruppen mit alleinigem Antibiotikum oder alleinigem Licht um acht Größenordnungen verringerte. Diese Daten legen eine Lösung für die Behandlung von antibiotikaresistenten Bakterien nahe. Die Punkte in dieser Abbildung stellen daher die Lichtstreuungspunkte dar, die eine gleichzeitige Anwendung diffuser Laserbestrahlung und Antibiotikabehandlung über einen in das bakterienbefallene Gewebe eingebrachten Katheter ermöglichen.

Die endgültige Darstellung des Absorptionsspektrums um 532 nm zeigt eindeutig, dass sowohl der Bakterienstamm p aerogen als auch das Antibiotikum Gentamicin bei dieser Wellenlänge durchlässig sind, wodurch diese Wellenlänge eine geeignete Wahl für die Kombinationsbehandlung darstellt. Die vorgestellte Technik ebnete den Weg dafür, dass Forscher im Bereich der Mikrobiologie und Medizin die Wirksamkeit dieser Methode untersuchen können, ebenso für Biofilme und Organsysteme. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Pseudomona orgen-Mikroorganismen äußerst gefährlich sein kann; daher sollten stets korrekte sterile Techniken sowie sterilisierte Umgebung und Ausrüstung während der Durchführung dieses Verfahrens verwendet werden.