Dissection, Kultur und Analyse der

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine primäre Zellkultur von Xenopus-Retinazellen herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst das umgebende Gewebe entfernt wird, um die Retina freizulegen. Der zweite Schritt besteht darin, das Retinagewebe zu exzidieren.

Anschließend wird das Netzhautgewebe in Einzelzellen dissoziiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Netzhautzellen auf einer UnCloned-Schale zu platzieren und Fluoh 4:00 AM für die Kalzium-Bildgebung hinzuzufügen. Abschließend wird mittels konfokaler Mikroskopie die Kalziumaktivität in der Netzhautzellkultur detektiert.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Entwicklungsbiologie, Neurobiologie und Zellbiologie zu beantworten, beispielsweise die Rolle von Kalzium und elektrischer Aktivität bei der Netzhautentwicklung sowie die Genexpression auf einzelner Zellebene. Im Allgemeinen haben Personen, die mit diesem Verfahren neu sind, Schwierigkeiten, da feinmotorische Bewegungen für eine zeitnahe und präzise Dissektion erforderlich sind. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Dissektionsschritte schwierig sind und komplexe koordinierte Hand-Auge-Bewegungen notwendig sind.

Um dieses Verfahren in der Haube zu beginnen, bereiten und beschriften Sie Folgendes: eine 60 Millimeter große Kunststoff-Petri-Schale, die 10 Milliliter Zellkulturmedium enthält, das als Dissektionsplatte verwendet wird. Optional können 10 Milligramm Kollagenase B zur Dissektionsplatte hinzugefügt werden, um eine Endkonzentration von 1,0 Milligramm pro Milliliter zu erreichen, was die Trennung der Gewebeschichten bei der Dissektion von Embryonen im Stadium 25 oder jünger erleichtert.

Bereiten Sie außerdem eine 35-Millimeter-Langzeitkulturschale mit zwei Milliliter Zellkulturmedium als Kulturplatte, eine leere 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenprobe als Gewebetrennschlauch und eine 15-Milliliter-kegelförmige Falcon-Röhrchen mit 15 Milliliter vor.

Zellkulturmedium. Bereiten Sie dann zwei 35-Millimeter-Kunststoff-Petri-Schalen vor, die jeweils zwei Milliliter CMF für die Dissektion enthalten, wobei eine als Platte zur Explan-Dissoziation und die andere als X-Explan-Spülplatte außerhalb des Sicherheitswerks verwendet wird. Bereiten Sie zwei 60-Millimeter-Kunststoff-Petri-Schalen mit je 10 Milliliter vor.

0,1 XMMR, eine als Halteplatte und eine als Schwesternplatte, sowie eine weitere 60 Millimeter große Kunststoff-Petri-Schale mit 10 Milliliter 0,1 XMMR plus 0,5 Milligramm pro Milliliter MS 2 22. Danach 40 Mikroliter 5 %iges Trypsin in CMF zur Explanten-Dissociationsplatte hinzufügen.

Vorsichtig wirbeln, um zu mischen, dann beiseite stellen. Danach fortfahren mit der Dissektion unter dem Stereomikroskop unter Verwendung von zwei Paar feiner Pinzetten. Führen Sie einen mittig sagittalen Schnitt auf der ventralen Seite des Embryos aus, beginnend am hinteren Ende und fortlaufend durch die Zementdrüse im vorderen Bereich des Embryos.

Öffnen Sie das Embryo vorsichtig, indem Sie beide Seiten des Schnitts auseinanderziehen. Dadurch liegt die dorsale Seite des Embryos der Dissektionsplatte zugewandt. Anschließend öffnen Sie das ventrale Ektoderm, um das Entoderm und Mesoderm freizulegen.

Als Nächstes entfernen Sie das Endoderm und Mesoderm, die erste und größte Schicht dieses Gewebes. Das Endoderm erscheint sehr flaumig mit großen Zellen und wenig offensichtlicher Organisation. Nach dem Entfernen dieser Schicht werden die Somiten und der Noor sichtbar.

Um einen besseren Kontrast zu erzielen, überführen Sie das Embryo in eine separate 60 Millimeter große Kunststoff-Petri-Schale, die 10 Milliliter Zellkulturmedium und 100 Mikroliter einer 1 %igen Lösung von Nile blue sulfate enthält, und inkubieren Sie es zwei bis drei Minuten lang. Anschließend bringen Sie es zurück auf die Präparierschale. Dadurch werden Ektoderm, Somiten und Noor angefärbt, was die Identifizierung und Orientierung erleichtert.

Im Fokus auf den vorderen Bereich des Embryos entfernen Sie vorsichtig die Noor und jegliches verbleibende Mesoderm, um das Gehirn und die optischen Vesikel freizulegen. Sobald das Gehirn und die optischen Vesikel vollständig freigelegt sind, trennen Sie mit der Pinzette das Neuralrohr und das darunterliegende Ektoderm unmittelbar hinter dem Gehirn ab. Drehen Sie dieses Präparat um, sodass das Ektoderm nach oben zeigt.

Seien Sie vorsichtig, um die darunterliegenden Augenbläschen nicht zu beschädigen, und entfernen Sie vorsichtig das Ektoderm. Trennen Sie abschließend die Augenbläschen mit der Pinzette vom Gehirn, um einen Embryo, der älter als Stadium 25 ist, zu dissezieren. Entfernen Sie zuerst den ventralen Teil des Embryos mit der Pinzette in der Anästhesieplatte.

Für einen besseren Kontrast das Embryo in eine 60 Millimeter große Plastik-Petri-Schale überführen, die 10 Milliliter 0,1 XMMR und 100 Mikroliter 1 %iger Nile-Blau-Sulfat-Lösung enthält, und zwei bis drei Minuten lang das Ektoderm anfärben lassen. Anschließend das Embryo auf die Präparationsplatte übertragen. Danach das Embryo vorsichtig fixieren und die direkt unter dem überlagernden Ektoderm liegende Retina oder das Optikvesikel entfernen.

Nachdem die Optic Vesicle oder Netzhaut präpariert wurde, überführen Sie sie vorsichtig mit einer P-100-Mikropipette und einer aerosolresistenten Spitze in die X-explan-Spülplatte. Achten Sie darauf, dass sie keine Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen berührt. Anschließend lässt man das Explantat 30 Sekunden lang ruhen.

Als Nächstes überführen Sie 80 Mikroliter 0,1 %iger Trypsinlösung in CMF von der Explantat-Dissociationsplatte in das Explantat-Dissociationsröhrchen. Danach überführen Sie die Netzhaut oder das Optikvesikel von der Explantat-Spülplatte in das Explantat-Dissociationsröhrchen, wobei die Übertragung der Explantat-Spüllösung vermieden werden sollte.

Anschließend das Gewebe eine Stunde lang bei Raumtemperatur in der Explant-Dissociationsröhrchen dissociieren lassen. Falls während des gesamten Experiments mehrere Bilder der Zellen aufgenommen werden sollen, befestigen Sie ein Gitter mit kleinen Tropfen Sekundenkleber an der Unterseite der Kulturplatte. Dies ermöglicht es, zu verschiedenen Zeitpunkten des Verfahrens Bilder identischer Zellen in identischer Ausrichtung aufzunehmen, um die Zellen auszusäen.

Entfernen Sie zunächst langsam 40 Mikroliter der Lösung aus dem Explan-Dissociationsröhrchen und entsorgen Sie diese. Verwenden Sie dann den P 100 mit einer aerosolresistenten Spitze, um die Zellen langsam in die Kulturplatte zu überführen. Saugen Sie die Zellen langsam auf und halten Sie diese in einem kleinen Bereich in der Mitte der Platte.

Diese Abbildung zeigt ein Beispiel der Kalziumaktivität einer einzelnen Zelle über einen Zeitraum von einer Stunde Aufnahmezeit. Diese Abbildungen liefern repräsentative Ergebnisse von Kalzium-Bildgebungsexperimenten in embryonalen Netzhautzellen, die zu verschiedenen Entwicklungsstadien analysiert wurden. Kurz gesagt zeigen die Ergebnisse, dass Kalzium in seiner Expression entwicklungsreguliert ist und bezüglich der korrelierenden Kalziumaktivität bei Zellen, die positiv für eine bestimmte Sonde sind, bei Entwicklungsstadium 35 Spitzen aufweist.

Bei Fischexperimenten zeigte sich, obwohl keine statistisch signifikanten Unterschiede vorlagen, ein Trend dahingehend, dass Zellen, die positiv für einen GABAergen Marker waren, höhere Kalzium-Spiking-Aktivitäten aufwiesen als Zellen, die positiv für einen glutamatergen Marker oder für die Genkodierung von PT F1 A.A – einem Transkriptionsfaktor, der mit der Förderung des GABAergen Phänotyps assoziiert ist – waren. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung für eine Platte innerhalb von etwa drei Stunden und 30 Minuten abgeschlossen werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Zellkultur, C zwei-Hybridisierung oder elektrophysiologische Ableitungen angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu klären, beispielsweise, welche Zellen bestimmte phänotypische Marker exprimieren, oder um elektrophysiologische Ableitungen zu analysieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man retikulares Gewebe disseziert, retikulares Gewebe dissoziiert und retikuläre Zellen aufplatziert.