Name: In ovo Elektroporation von miRNA-basierte Plasmide in der Entwicklung von Neuralrohr und Beurteilung der Phänotypen von DiI Injection in Open-book Vorbereitungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Lernen Sie die In-ovo-Elektroporation von miRNA-Plasmiden zur gen-spezifischen Genexpression im Neuralrohr von Hühnerembryonen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Axonführungsdefekten.

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Arbeit im Labor von ES wird durch die Swiss National Science Foundation unterstützt. Wir danken Herrn Dr. Beat Kunz für die Unterstützung bei Dreharbeiten zu danken.

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
<li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21(2009).</li>
<li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific%2C+traceable+gene+silencing+for+functional+gene+analysis+during+vertebrate+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development.</a> Nucleic Acids Research. 39, e133(2011).</li>
<li>Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).</li>
<li>Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+lipophilic+dyes+in+studies+of+axonal+pathfinding+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo.</a> Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29, 123-132 (2001).</li>
<li>Kieleczawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+modifications+of+the+standard+DNA+sequencing+protocol+allow+for+sequencing+through+siRNA+hairpins+and+other+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071(2010).</li>
<li>Kim, B. G., Dai, H. -N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li>
<li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate%2C+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li>
<li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese einfache, vektorbasierten künstlichen miRNA Expressionsstrategie kann Knockdown endogenen Genexpression in dem Neuralrohr Huhn verwendet werden. Diese funktionale Tools bieten mehrere Gen-Silencing, zeitliche Steuerung und Zelltyp-Spezifität, die Aufklärung komplexer Entwicklungsverläufe zu erleichtern. Insbesondere haben wir die Brauchbarkeit dieser Plasmide in kommissuralen Axon Führung gezeigt, da die Plasmide können zur Knockdown verschiedenen Genen in kommissuralen Neuronen oder in ihren Zwischenziel, die Bod...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 0,5 mm Glaskapillaren </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Glasnadel puller </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard Silikonelastomer </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Wolframdraht, 0,075 mm </td><td> World Precision Instruments </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Insect Pins, 0,20 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Insect Pins, 0,10 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Frühling Schere </td><td> Fine Science Umols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Zangen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 55 Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Schnelle DiI </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskopen </td><td> Olymp </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

in ovo elektroporation von mirna-basierte plasmide in der entwicklung von neuralrohr und beurteilung der phänotypen von dii injection in open-book vorbereitungen

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Kommissuralen dI1 Neuronen wurden ausführlich untersucht, um die zugrunde liegenden Mechanismen Axon Führung während der Entwicklung 1,2 aufzuklären. Diese Neuronen sind im dorsalen Rückenmark und schicken ihre Axone entlang stereotype Bahnen. Kommissuralen Axone zunächst ventral projizieren Richtung und dann über der Bodenplatte. Nach dem Überqueren der Mittellinie, machen diese Axone eine scharfe rostral Turn und Projekt längs zum Gehirn. Jeder dieser Schritte wird durch die koordinierte Tätigkeit der anziehenden und abstoßenden Signalmoleküle reguliert. Die richtige Interpretation dieser Signale ist entscheidend für die Führung von Axonen entlang ihrer abgegrenzten Weg. Somit wird die physiologische Beitrag eines bestimmten Moleküls zu kommissuralen Axon Führung idealerweise im Rahmen des lebenden Embryo untersucht. Dementsprechend müssen Gen knockdown in vivo exakt gesteuert werden, um sorgfältig zu unterscheiden Axon Führung Aktivitäten von Genen, die spielen möglicherweise mehrereRollen während der Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Knockdown Genexpression im Huhn Neuralrohr in einem Zelltyp-spezifische, nachvollziehbar. Wir verwenden neuartige Plasmidvektoren 3 beherbergen zelltypspezifischen Promotoren / Enhancer, die die Expression eines Fluoreszenzprotein-Marker anzutreiben, direkt gefolgt von einer miR30-RNAi-Transkript 4 (die sich in dem 3&#39;-UTR von der cDNA, die das fluoreszierende Protein) ( Abbildung 1). Wenn in den Entwicklungsbehälter Neuralrohr elektroporiert, hervorzurufen diese Vektoren effiziente Herunterregulation der Genexpression und exprimieren hell fluoreszierenden Marker Proteine ​​ermöglichen die direkte Verfolgung der Zellen erleben Knockdown 3. Mischen verschiedener RNAi-Vektoren vor der Elektroporation erlaubt die gleichzeitige Knockdown von zwei oder mehreren Genen in unabhängigen Bereichen des Rückenmarks. Dies erlaubt komplexen zellulären und molekularen Wechselwirkungen während der Entwicklung untersucht werden, in einer Weise, die schnell, sUmsetzung, präzise und kostengünstig. In Kombination mit DiI Tracing von commissural Axon Trajektorien in Open-book-Präparate 5, ist diese Methode ein nützliches Werkzeug für die in-vivo-Studien der zellulären und molekularen Mechanismen der commissural Axonwachstum und Führung. Im Prinzip könnte jede Promotor / Enhancer verwendet werden, möglicherweise macht die Technik breiter anwendbar für in vivo Studien der Genfunktion während der Entwicklung 6. Dieses Video zeigt, wie zu handhaben und Fenster Eier, die Injektion von DNA-Plasmiden in das Neuralrohr und die Elektroporation Verfahren. Um commissural Axon Führung zu untersuchen, wird das Rückenmark aus dem Embryo als Open-book-Präparation entfernt, fixiert und injiziert mit DiI zu ermöglichen Axon Wege zu verfolgen. Das Rückenmark wird zwischen Deckgläsern montiert und visualisiert mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie.

Ein Verfahren, durch welches die Genexpression in der Neuralrohr sein herunterreguliert kann in einem Zelltyp-spezifische, nachvollziehbar beschrieben. Wir zeigen, wie<em&gt; In ovo</em&gt; Elektroporation von microRNA-basierte Plasmide, raumzeitlich kontrollierten RNA-Interferenz auslösen kann verwendet werden, um commissural Axon Führung in der Entwicklung von Neuralrohrdefekten zu untersuchen.

In ovo Elektroporation von miRNA-basierte Plasmide in der Entwicklung von Neuralrohr und Beurteilung der Phänotypen von DiI Injection in Open-book Vorbereitungen

Kommissurale dI1-Neuronen wurden umfassend untersucht, um die Mechanismen zu klären, die der Axonführung während der Entwicklung zugrunde liegen1,2. Diese Neuronen sind ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Fehlführungen von Axonen im Hühner-Neuralrohr nach einer herunterregulierten Genexpression auf zelltypspezifische, nachvollziehbare Weise zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem befruchtete Hühnereier für eine In-ovo-Elektroporation vorbereitet werden, indem ein Fenster in die Eierschale geschnitten wird. Der zweite Schritt besteht darin, DNA-Konstrukte, die Mikro-RNAs kodieren, in das Neuralrohr zu injizieren und mittels Elektroporation zu übertragen.Anschließend werden die elektrisch stimulierten Rückenmarksgewebe herauspräpariert und in flachen, offenen Buch-Präparaten fixiert. Im letzten Schritt wird ein fluoreszierender Farbstoff injiziert, um die axonalen Projektionen sichtbar zu machen. Schließlich kommt die Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz, um sowohl die Zellen mit Gen-Silenzierung als auch die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Commissura-Axon-Leitung zu zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden ist die zelltypspezifische Stilllegung von Genen. Um die Plasmide herzustellen, überprüfen Sie das schriftliche Protokoll auf Anweisungen. Inkubieren Sie die Eier bei 38,5 Grad Celsius und einer Luftf

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Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt, wie axonale Wege der genetisch definierte Gruppen von Neuronen in der embryonalen chick Rückenmark Nutzung...

Die Entzifferung Axonal Pathways von genetisch definierte Gruppen von Neuronen in der Küken Neuralrohr Verwendung In ovo Elektroporation

In utero Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von neuronalen Vorläuferzellen in vivo. Abhängig von der Platzierung der Elektroden und der Entwicklungspsychologie Zeitpunkt der Elektroporation können bestimmte Teilmengen von kortikalen Zellen ausgerichtet werden. Gezielte Zellen können dann in vivo oder in vitro für die Auswirkungen der genetischen Veränderung untersucht werden.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Diese Studie beschreibt die Entwicklung...

In-vitro-Elektroporation von der Unteren Rhombischer Lip von der Schwangerschaft ab muriner Embryonen

Um die Funktion und die Regulation von Genen während der Entwicklung der dopaminergen Neurone im Mittelhirn zu bewerten, beschreiben wir eine Methode, die...

In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Steuern der Expansion von somatischen Stammzellen ist ein Hauptfaktor, was ihrer Studie und therapeutischen Verwendung. Hier beschreiben wir ein System zur zeitlich steuern Nervenstammzellen Expansion während der Entwicklung und im Erwachsenenalter, die verwendet werden, um die Zahl der Neuronen im Gehirn der Maus erzeugt erhöhen kann.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Ektopische Expression ist eine Technik, um die microRNAs Rolle in der Entwicklung des Gehirns aufzuklären. , Für bestimmte Bereiche mit in ovo Elektroporation ist jedoch eine Herausforderung. Hier zeigen wir einen effizienten Weg, um selektiv elektroporieren ventrale und dorsale Mittelhirn Regionen.

In ovo Expression von microRNA in ventralen Mittelhirn-Küken

Wir präsentieren vorübergehende Transgene und Knock-Down in Schlauchseescheide, eine chordate Schwestergruppe der Wirbeltiere, mit Mikroinjektions und Elektroporation Techniken. Solche Methoden erleichtern die funktionelle Genomik in diesem einfachen wirbellos, die rudimentäre Eigenschaften der Wirbeltiere verfügt, einschließlich notochord und Kopf Sinnesepithelien und viele Orthologe der menschlichen Gene Krankheit.

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Wir haben einen neuartigen Loss-of-Function-Ansatz entwickelt, der die Einführung und genomische Integration künstlicher Mikro-RNA-Sequenzen in Kükenembryonen unter Verwendung der In-ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Diese Technik bietet eine robuste und stabile Gen-Knockdown-Methode für Studien der Genfunktion während der Entwicklung.

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Amnionhöhle der Maus bei E7.5 mit Lentivirus injiziert wird, was zu einer gleichmäßigen Transduktion der gesamten Neuralplatte führt, mit minimalen nachteiligen Auswirkungen auf das Überleben oder die Embryonalentwicklung.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Lernen Sie die In-ovo-Elektroporation von miRNA-Plasmiden zur gen-spezifischen Genexpression im Neuralrohr von Hühnerembryonen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Axonführungsdefekten.

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