In ovo Elektroporation von miRNA-basierte Plasmide in der Entwicklung von Neuralrohr und Beurteilung der Phänotypen von DiI Injection in Open-book Vorbereitungen

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Fehlführungen von Axonen im Hühner-Neuralrohr nach einer herunterregulierten Genexpression auf zelltypspezifische, nachvollziehbare Weise zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem befruchtete Hühnereier für eine In-ovo-Elektroporation vorbereitet werden, indem ein Fenster in die Eierschale geschnitten wird. Der zweite Schritt besteht darin, DNA-Konstrukte, die Mikro-RNAs kodieren, in das Neuralrohr zu injizieren und mittels Elektroporation zu übertragen.

Anschließend werden die elektrisch stimulierten Rückenmarksgewebe herauspräpariert und in flachen, offenen Buch-Präparaten fixiert. Im letzten Schritt wird ein fluoreszierender Farbstoff injiziert, um die axonalen Projektionen sichtbar zu machen. Schließlich kommt die Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz, um sowohl die Zellen mit Gen-Silenzierung als auch die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Commissura-Axon-Leitung zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden ist die zelltypspezifische Stilllegung von Genen. Um die Plasmide herzustellen, überprüfen Sie das schriftliche Protokoll auf Anweisungen. Inkubieren Sie die Eier bei 38,5 Grad Celsius und einer Luftfeuchtigkeit von etwa 45 %, bis der gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist. Um die Axonführung von kommissuralen Neuronen zu untersuchen, inkubieren Sie die Embryonen für ungefähr drei Tage, bis sie den Hamburger-und-Hamilton-Stadium 17 bis 18 erreichen.

Sobald der gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist und bevor das Protein von Interesse im Embryo angereichert wird, nehmen Sie die Eier aus dem Inkubator und legen Sie sie 20 Minuten lang in eine stabile horizontale Position, um den Embryo an die Oberseite des Dotters auf der oberen Seite des Eis zu verlagern. Nachdem sich die Embryonen an die Oberseite des Dotters verlagert haben, nehmen Sie die Eier aus dem Inkubator und wischen Sie sie mit 70 % Ethanol ab. Bringen Sie anschließend einen Streifen Klebeband entlang der Längsachse des Eis an und verwenden Sie ein Skalpell, um ein kleines Loch am stumpfen Ende des Eis und ein weiteres an der Ecke des Bereichs, der geöffnet werden soll, zu machen.

Danach eine Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel im 45-Grad-Winkel in das Loch am stumpfen Ende des Eies einführen und etwa drei Milliliter Albumin absaugen, wobei darauf geachtet werden muss, das Eigelb nicht zu beschädigen. Mit horizontal gehaltenen kleinen Scheren das Fenster in das Ei schneiden, ohne den Embryo zu verletzen. Anschließend das Fenster mit dem Klebeband verschließen.

Verwenden Sie abschließend einen Pinsel, um geschmolzenes Paraffin aufzutragen und damit das Loch am stumpfen Ende des Eis sowie eventuelle Risse im Ei auf die gleiche Weise abzudichten. Danach bringen Sie das Ei wieder in den Inkubator zurück. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Eiern, die elektroporiert werden sollen.

Entfernen Sie das Klebeband von einem der fenestrierten Eier und bestimmen Sie das Entwicklungsstadium des Embryos gemäß Hamburger und Hamilton. Heben Sie dann mit einer Pinzette die extraembryonalen Membranen von der kordalen Hälfte des Embryos im Bereich der großen rechten und linken Vitellinvenen an. Dringen Sie vorsichtig in den Rumpf ein, reißen oder schneiden Sie die Membranen mit einer Feder-Schere auf und klappen Sie sie in Richtung Schwanzende um.

Verwenden Sie nun sanfte Absaugung, um die DNA-Mischung, die elektroporiert werden soll, in eine Glas-Mikrokappe mit angeschlossenem Schlauch zu laden. Führen Sie die Mikrokappe in das zentrale Kanal des Neuralrohrs direkt oberhalb der Hintergliedmaßen ein und injizieren Sie die DNA-Lösung, wobei Sie das Injektionsvolumen über den Mund kontrollieren. Die blaue Farbe sollte sich von der Flossenspitze bis zum Ventrikel des sich entwickelnden Gehirns ausbreiten.

Geben Sie einige Tropfen sterile PBS auf das Embryo und platzieren Sie die Elektroden parallel zur anterioren-posterioren Achse des Embryos, ohne das Embryo oder Blutgefäße zu berühren. Halten Sie dann die Elektroden stabil und führen Sie die Elektroporation durch. Entfernen Sie nach der Elektroporation die Elektroden und spülen Sie schnell mit steriler Wasser, um denaturierte Proteine aus dem Eiweiß zu entfernen.

Schließlich geben Sie etwas mehr sterile PBS auf das Embryo und verschließen das Ei erneut mit Klebeband. Wie zuvor ist ein sorgfältiger Verschluss entscheidend, um eine Austrocknung des Embryos zu vermeiden. Danach bringen Sie das Embryo in den Inkubator zurück, bis der gewünschte Entwicklungsstadium erreicht ist.

Sobald das Embryo das Hamburger-Hamilton-Stadium 25 bis 26 erreicht hat, das Embryo mit einer Pinzette aus dem Ei entnehmen und in eine mit Silgard-Elastomer beschichtete Petrischale geben. Mit der Pinzette die extraembryonalen Membranen entfernen und das Embryo mit der dorsalen Seite nach unten legen. Anschließend mit 0,2 Millimeter dicken Insektennadeln das Embryo vorsichtig über Hals und Schwanz auszurren und fixieren.

Dann befestigen Sie die Gliedmaßen des Embryos, wobei die Nadeln schräg eingeführt werden, um eine Beeinträchtigung der anschließenden Dissektion zu vermeiden. Beleuchten Sie die Schale mit dem Embryo von unten, sodass die Gewebedichte wahrgenommen werden kann. Öffnen Sie mit Feder-Scheren die Bauchhöhle und entfernen Sie das Herz und die inneren Organe durch vorsichtiges Abkratzen mit einer Pinzette.

Wenn alle Organe vollständig entfernt wurden, sind die segmentierten Wirbel und das Rückenmark sichtbar. Drehen Sie danach das Embryo um 180 Grad und verwenden Sie eine Feder-Schere, um einen flachen Schnitt durch die Wirbel über dem Rückenmark im Nackenbereich zu führen. Führen Sie anschließend zwei kurze longitudinale Schnitte durch die Wirbel auf beiden Seiten des Rückenmarks vom Nacken bis zum Schwanz aus.

Heben Sie mit einer Pinzette die Deckelwirbel von dem Rückenmark weg und ziehen Sie die Wirbel dann in einem Stück in Richtung Schwanz ab. Dehnen Sie anschließend das Embryo vorsichtig und heften Sie es erneut durch Schwanz und Gliedmaßen fest. Identifizieren Sie nun die Meningen des Rückenmarks, die als dunkle, dichte Gewebelinie zwischen dem Neuralrohr und den dorsalen Wurzelganglien erscheinen sollten, und schneiden Sie mithilfe einer sterilen Nadel oder eines feinen mikrochirurgischen Skalpells die Meningen entlang jeder Seite des Rückenmarks von Hals bis Schwanz in Längsrichtung auf.

Die Meningen sollten sich aufgrund der Dehnung des fixierten Embryos leicht vom Rückenmark lösen. Schließlich das Rückenmark auf der Höhe des Flügelanleges und kaudal zum Gliedmaßenanlage durchtrennen. Anschließend mit einer Pinzette das Rückenmark in einer rostral-kaudalen Bewegung anheben, wobei sichergestellt werden muss, dass das Rückenmark stets in der PBS First eingetaucht bleibt.

Verteilen Sie das isolierte Rückenmark auf einem Spatel und überführen Sie es in eine frische, mit Sylgard beschichtete Schale, die 4 % Paraformaldehyd in PBS enthält. Danach fixieren Sie das Rückenmark vorsichtig mittels 0,1 Millimeter Insektennadeln medial und vierteljährig, um eine flache Präparation herzustellen, und inkubieren es im Paraformaldehyd 30 Minuten bis eine Stunde lang. Achten Sie darauf, eine Überfixierung zu vermeiden.

Dadurch erhöht sich die Hintergrundfärbung und die Diffusionseffizienz von Diod wird verringert. Gießen Sie anschließend das Paraldehyd vorsichtig ab und ersetzen Sie es durch PBS. Bereiten Sie danach eine schnelle Diod-Lösung mit fünf Milligramm pro Milliliter in Ethanol vor, brechen Sie die Spitze einer Glas-Mikropipette mit kleinem Durchmesser, die an eine Kunststoffschlauchleitung angeschlossen ist, ab und ziehen Sie die Lösung in die Pipette ein.

Setzen Sie die gefüllte Nadel in eine Schale mit PBS ein und prüfen Sie, ob die Farbe aus der Nadel austritt. Falls dies der Fall ist, ist der Durchmesser zu groß und es sollte eine neue Nadel vorbereitet werden. Stellen Sie sicher, dass die „Open-Book“-Präparation von unten beleuchtet wird und suchen Sie den dichteren, längs verlaufenden Streifen des Gewebes, der sich etwa ein Fünftel der Breite des Hemi-Book vom lateralen Rand entfernt befindet. Die Zellkörper der kommissuralen Neurone liegen direkt dorsal zu dieser dunklen Linie.

Führen Sie die Spitze der Glas-Mikropipette in das Gewebe ein, und während die Nadel zurückgezogen wird, geben Sie mithilfe einer Mundpipette schnell eine kleine Menge D-Auge frei. Wiederholen Sie den Vorgang alle 0,5 Millimeter entlang der Länge des offenen Buches. Sobald die Injektionen abgeschlossen sind, aspirieren und entsorgen Sie mit einer Transferpipette jeglichen Überschuss. Andernfalls kommt es zu einer hohen Hintergrundfärbung.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle Open-Book-Präparationen. Anschließend stellen Sie die Schale mit den injizierten Präparationen für etwa drei Tage bei vier Grad Celsius, damit sich der Farbstoff entlang der Axone ausbreiten kann. Danach montieren Sie die Präparationen gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll.

Querschnitte und Fächerpräparate wurden aus Hamburger-Hamilton-Entwicklungsstadium-25-bis-26-Hühnerembryonen gewonnen, die im Hamburger-Hamilton-Entwicklungsstadium 18 elektroporiert worden waren. Wie hier im Querschnitt zu sehen ist, bewirkt der Beta-Aktin-Promotor eine ubiquitäre Expression. Der Pfeil zeigt die dorsoventrale Richtung an.

Dieses Bild zeigt ein Beispiel für Muster der Expression fluoreszierender Proteine nach der Elektroporation der Plasmidvektoren. Hier ist eine ubiquitäre Expression aus dem Beta-Aktin-Promotor in einer offenen Buch-Präparation zu sehen. Der Pfeil zeigt die rostrale Richtung des Rückenmarks an.

Dieses Bild zeigt einen Querschnitt nach einer Elektroporation mit einem Konstrukt, das einen math one-Enhancer enthält. Dieser vermittelt die Expression in di one-Neuronen. Hier ist die Expression aus dem math one-Enhancer-Konstrukt in einer offenen Buch-Präparation zu sehen.

Dieser Querschnitt zeigt die Expression des Hawk-A1-Enhancers nach bilateraler Elektroporation des Konstrukts. Der Hawk-A1-Enhancer aktiviert die Expression spezifisch in der Bodenplatte. Diese „Open-Book“-Präparation zeigt das Expressionsmuster des Hawk-A1-Konstrukts in der Bodenplatte.

Dieses Bild zeigt eine Hellfeldaufnahme der Anwendung von Dai-Injektionsstellen. Bei einer „Open-Book“-Präparation wurde Dai in einem punktförmigen Muster nahe dem lateralen Rand des offenen Buchs injiziert. Auf der elektrisch stimulierten Seite zeigt dieses Bild die Visualisierung der GFP-Expression in derselben Präparation, und hier wird Dai sichtbar gemacht.

Nach drei Tagen Diffusion sollten Kommissurenverläufe unter fluoreszenzmikroskopischer Betrachtung sichtbar sein. Normale Axonverläufe wachsen in Richtung Bodenplatte, überqueren die Bodenplatte und biegen dann ab, um weiterzuwachsen, wie hier zu sehen ist.

Abnorme Phänotypen, die durch eine Gen-Reduktion entstehen, wie hier gezeigt, können mit der archetypischen Bahnverlaufskurve verglichen werden. Im Beispiel verharren einige Axone im Bodenplattenbereich oder treffen fehlerhafte Richtungsentscheidungen auf der kontralateralen Seite. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, während der feinen Injektions- und Dissektionsschritte stets sorgfältig und geduldig vorzugehen.

Dies erfordert etwas Übung. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RNAi-Plasmide injiziert, um die Genfunktion während der Neuralrohrentwicklung in einer zelltypspezifischen Weise zu untersuchen.