Name: 1 F O ATPase Vesicle Vorbereitung und Technik für Darstellende Patch-Clamp-Recordings von submitochondrialen Vesikelmembranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von F1FO-ATPase-Vesikeln aus Rattenhirn für Patch-Clamp-Aufnahmen. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse der mitochondrialen ATP-Synthase-Aktivität in Neuronen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Mitochondrien-Isolation (Angepasst von Braun MR et al. 9) <ol><li> Sacrifice die Ratte unter Verwendung von Methoden der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen. </li><li> Schneiden Sie den Kopf des Tieres durch Enthauptung, schneiden Sie die Haut und setzen den Schädel. </li><li> Öffnen Sie den Schädel sanft durch Schneiden mit einer Schere oder Zange. Entfernen Sie das Gehirn. </li><li> Mince fein das Gehirn ohne Kleinhirn in Isolation Buffer (siehe Tabelle 1) und überträgt es auf eine 5-ml-Glas / Teflon-Homogenisator (siehe Geräteliste). </li><li> Homogenisieren Gewebe sanft 10 mal (keine Blasen), ca. 5 min. </li><li> Zentrifuge Probe bei 1.500 × g für 10 min bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge. </li><li> Speichern Sie den Überstand (Mitochondrien und Synaptosome) und entsorgen Sie die Pellet (Kernmaterial und Zelltrümmer). Zentrifuge bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge. </li><li> VerwerfenÜberstand und resuspendieren Pellet in 500 ul Isolation Buffer. Stören Synaptosome mit einem Zellaufschluss Schiffes (siehe Geräteliste). Anwenden eines Druck von 1200 psi für 10 min, gefolgt von schnellen Dekompression. </li><li> Schicht der Mischung auf Ficoll-Gradienten (siehe Tabelle 2), in SW-50.1 Rotor und Zentrifuge bei 126.500 × g für 20 min bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge (siehe Geräteliste). Das Pellet wird das gereinigte Mitochondrien, ist die Ebene zwischen den unterschiedlichen Dichten von Ficoll ungestörten Synaptosomen. </li><li> Waschen Pellet durch Zentrifugation in Isolation Puffer bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge. </li></ol> 2. Submitochondrialen Vesikel (SMV) Isolation (Angepasst von Chan et al. 10) <ol><li> Re-suspend in 200 ul Isolation Buffer mit einem gleichen Volumen von 1% Digitonin kombiniert Mitochondrien und damit auf Eis für 15 min sitzen. </li><li> Fügen Sie mehr Isolation Buffer und Zentrifuge bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge. Tun Sie dies zweimal. </li><li> Re-suspend Pellet in 200 ul Isolation Buffer und fügen 2 ul 10% Lubrol PX (C12E9). Mische und lasse auf Eis für 15 min sitzen. </li><li> Layer-Mischung auf Isolation Buffer, in SW-50.1 Rotor und Zentrifuge bei 182.000 × g bei 4 ° C für 1 Stunde. </li><li> Waschen Endpellet durch Zentrifugieren in einer Tischzentrifuge in Isolation Puffer bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C. </li></ol> 3. Elektrophysiologische Recording <ol><li> Eine typische Elektrophysiologie rig einen Verstärker, einen PC mit einer Digidata 1440A Analog-zu-Digital-Wandler-Schnittstelle in Verbindung mit pClamp10.0 Software Manipulatoren, ein Mikroskop, eine Schwingungsisolation Tabelle Faraday-Käfig ausgestattet. </li><li> Borosilikatglas Kapillaren werden in einem Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung Modell P-87 eingesetzt. Eine Pipette-Abzieher Programm wird optimierterzeugen Pipetten mit Widerständen zwischen 80 bis 100 MOhm. </li><li> SMVS in einer physiologischen intrazellulären Lösung (ATP wird zu einem geeigneten Zeitpunkt während der Aufzeichnung hinzugefügt) (Tabelle 3) angeordnet ist. Patch-Clamp-Pipetten mit der gleichen Lösung (ohne ATP) gefüllt. Aufnahmen werden durch Bildung eines Giga-Ohm-Dichtung auf SMVS bei Raumtemperatur durchgeführt. Vesikel werden visualisiert durch Phasenkontrast-Mikroskopie mit einer Nikon oder Zeiss inversen Mikroskop. </li><li> Das Membranpotential bei Spannungen im Bereich von -100 mV bis +100 mV für die Dauer von 10 Sekunden aufrechterhalten. Aufnahmen werden bei 5 kHz über die Verstärkerschaltung filtriert. Niveau von streunenden elektrische oder unspezifische Rauschen von weniger als 1 pA sind wünschenswert für eine erfolgreiche Aufnahme. </li><li> Die Daten werden mit 10,0 Clampfit Software beispielsweise in Frequenz und Amplitude der Einkanal Ereignisse zu bestimmen analysiert. Spannung Abhängigkeit wird durch Auftragen einer Strom-Spannungs-Beziehung bestimmt. </li></ol>

<ol><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis%2C+autophagy+and+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).</li>
<li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li>
<li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+ATP+synthase%3A+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li>
<li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl-2+family%3A+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+proteins%3A+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li>
<li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li>
<li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li>
<li>Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+Synthasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen die Gewinnung von reinem Mitochondrien am Ende von Schritt 1 und submitochondrialen Vesikel (SMVS) nach Schritt 2 aus ganzen Gehirn ohne Unterschied der Zelle durch dieses Verfahren phenotypes.SMVspurified im wesentlichen frei von Verunreinigung durch andere subzelluläre Organellen, wie in Abbildung 1 und unserer bisherigen Arbeit (Alavian KN et al. 8) und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität vor dem Einfrieren. Nach Ei...

<table><tbody><tr><td>Potter-Elvehjem-Gewebemörser mit PTFE-Stößel</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Zentrifuge 5424 </td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>4639 Zellzerstörungsgefäß</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>SW-50.1-Rotor </td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L8-70M Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9) </td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B </td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A </td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas-Kapillare</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown-Mikropipetten-Ziehgerät Modell P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<sub&gt; 1</sub&gt; f<sub&gt; o</sub&gt; atpase vesicle vorbereitung und technik für darstellende patch-clamp-recordings von submitochondrialen vesikelmembranen

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondrien sind in vielen wichtigen zellulären Funktionen wie Stoffwechsel, Überleben 1, Entwicklung und Calcium-Signalgebung 2 beteiligt. Zwei der wichtigsten mitochondrialen Funktionen sind auf die effiziente Produktion von ATP, die Energie Währung der Zelle, die durch oxidative Phosphorylierung und die Vermittlung von Signalen für den programmierten Zelltod 3 bezogen. Das Enzym in erster Linie verantwortlich für die Produktion von ATP ist die F1FO-ATP-Synthase, auch als ATP-Synthase 4-5. In den letzten Jahren hat sich die Rolle der Mitochondrien in apoptotischen und nekrotischen Zelltod erhebliche Aufmerksamkeit erhalten. In apoptotischen Zelltod, geben Bcl-2-Proteine ​​wie Bax äußeren Mitochondrienmembran, Oligomerisierung und Permeabilisierung der äußeren Membran, die Freigabe pro-apoptotische Faktoren in das Cytosol 6. In der klassischen nekrotischen Zelltod, wie die durch Ischämie oder Exzitotoxizität in Neuronen eine größ produzierte, schlecht reguliert Erhöhung Matrix Calcium trägt zur Öffnung der inneren Membran Poren, die mitochondriale Permeabilität Übergang Pore oder mPTP. Diese depolarisiert die innere Membran und verursacht osmotischen Verschiebungen, einen Beitrag zur äußeren Membran Ruptur, die Freisetzung von pro-apoptotischen Faktoren und Stoffwechselstörungen. Viele Proteine ​​einschließlich Bcl-xL 7 interagieren F1FO ATP-Synthase, stetig seine Funktion. Bcl-xL interagiert direkt mit der beta-Untereinheit der ATP-Synthase F1FO, und diese Interaktion vermindert ein Leck Leitwert innerhalb der F1FOATPasecomplex, die Erhöhung der Netto-Transport von H + durch F1FO während F1FO ATPase Aktivität 8 und wodurch mitochondrialen Effizienz. Um die Aktivität und Modulation der ATP-Synthase studieren isolierten wir aus Nagergehirn submitochondrialen Vesikel (SMVS) enthält F1FO ATPase. Die SMVS behalten die strukturelle und funktionelle Integrität des F1FO ATPase nach Alavian et al. Hier beschreiben wir eine Methodedass wir erfolgreich für die Isolierung von SMVS aus Rattenhirn verwendet und wir Abgrenzung der Patch-Clamp-Technik, um Kanal-Aktivität zu analysieren (ion Leck Leitwert) der SMVS.

Der erste Schritt der Protokoll ermöglicht für die Isolierung von Mitochondrien gereinigt, wie durch Western-Blot in Fig. 1 gezeigt. In Abbildung 2 ist ein Beispiel für einen brain-derived submitochondrialen Vesikel Patch Aufnahme gezeigt. Mit der inside-out Patch Konfiguration zeigen wir Kanalaktivität moduliert durch ATP. Die Steuerung (CTL) die Aufnahme (links) zeigt Multi-Kanal-Aktivität Leitfähigkeit mit einem Spitzenwert Leitfähigkeit von 600 pS im Durchschnitt. das wurde unmittel...

Eine Methode, um submitochondrialen Vesikel in F1FO ATP-Synthase-Komplexe aus Rattenhirn angereichert isolieren beschrieben. Diese Vesikel erlauben das Studium der Aktivität von F1FO ATPase-Komplex und dessen Modulation unter Verwendung der Technik der Patch-Clamp-Aufnahme.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vesicle Vorbereitung und Technik für Darstellende Patch-Clamp-Recordings von submitochondrialen Vesikelmembranen

Mitochondrien sind an vielen wichtigen zellulären Funktionen beteiligt, darunter der Stoffwechsel, das Überleben1, die Entwicklung und die Calcium-Signalisierung2. Zwei der wichtigsten ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, F1 F zero APAs-Vesikel aus Rattenhirn zu isolieren, um Patch-Clamp-Aufzeichnungen durchführen zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn einer Ratte entfernt und homogenisiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, synaptische Zonen durch Anlegen von Druck zu disruptieren.Anschließend werden die Synaptosomen auf die Phial-Gradienten aufgeschichtet. Der letzte Schritt besteht darin, mit Digitonin und L zu inkubieren, um die endgültigen Vesikel für die Patch-Clamp-Aufzeichnung zu erhalten. Eine wichtige Funktion der Mitochondrien ist die ATP-Produktion durch oxidative Phosphorylierung.Das Enzym, das für eine TP-Produktion verantwortlich ist, ist die A TP-Synthase, die sich in der inneren mitochondrialen Membran befindet. Um die Funktion der A TP-Synthase detailliert zu untersuchen, isolieren wir spezielle submikrosomale Vesikel, die wir SMVs nennen. Diese enthalten das Enzym A TP-Synthase in einer umgestülpten Konfiguration.Anschließend nehmen wir diese SMVs mit einer Patch-Clamp-Elektrode auf und bestimmen die Undichtigkeit ihrer Membran. Das liefert uns Informationen über die Effizienz der TP-Produktion durch die Mitochondrien. Sylvia Ti, eine Postdoktorandin in meinem Labor an der Yale University, wird dieses Verfahren heute demonstrieren.Bei diesem Verfahren wird nach der Gewinnung des Kopfes einer Ratte durch Enthauptung die Haut durchtrennt, um den Schädel freizulegen, anschließend wird der Schädel vorsichtig durch Aufschneiden mit einer Schere oder Rons geöffnet. Danach wird das Gehirn entfernt, das Kleinhirn ausgeschlossen, das Gehirn fein zerkleinert, gepuffert und dann vorsichtig in einen fünf Milliliter fassenden Glas-Teflon-Homogenisator überführt, wo das Gewebe zehnmal homogenisiert wird, insgesamt etwa fünf Minuten lang. Anschließend wird die Probe in einer Tischzentrifuge bei 1.500 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.Speichern Sie das Überstand mit Mitochondrien und Synaptosomen und verwerfen Sie das Pellet. Zentrifugieren Sie anschließend erneut mit 16.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in einer Tischzentrifuge. Danach verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet in 500 Mikrolitern Isolierpuffer. Stören Sie das Synaptosom mit einem Zellzerreißgefäß, indem Sie einen Druck von 1.200 PSI für 10 Minuten anwenden, gefolgt von einer schnellen Entspannung. Schichten Sie die zerstörten Synaptosomen auf die Zentrifugenröhrchen mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen von Ficoll, die zwei Schichten bilden werden.Als Nächstes die Röhrchen in einen SW 50.1-Rotor geben und bei vier Grad Celsius 20 Minuten lang mit 126.500 ×g zentrifugieren. In einem Ultrazentrifugat stellt das Pellet die gereinigten Mitochondrien dar. Die Schicht zwischen den unterschiedlichen Dichten der Fial ist der ungestörte Synaptosom. Anschließend wird das Pellet durch Zentrifugation in Isolationspuffer bei 16.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in einer Tischzentrifuge gewaschen. Nun resuspendieren Sie die Mitochondrien in 200 Mikrolitern Isolationspuffer, kombiniert mit einem gleichen Volumen von 1 % Digitonin.Stellen Sie es 15 Minuten lang auf Eis. Fügen Sie anschließend mehr Isolierungspuffer hinzu und zentrifugieren Sie bei 16.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, lösen Sie das Pellet dann in 200 Mikrolitern Isolierungspuffer auf und geben Sie zwei Mikroliter 10 % Laemmli-Puffer hinzu, mischen Sie gründlich und stellen Sie es 15 Minuten lang auf Eis.Danach die Mischung in Isolationspuffer in die Zentrifugenröhrchen schichten. Die Röhrchen in einen SSW 50.1-Rotor geben und eine Stunde lang bei 182.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach einer Stunde.Waschen Sie die endgültige Probe durch Zentrifugation im Isolationspuffer bei 16.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Eine typische Elektrophysiologie-Anlage umfasst einen Verstärker, einen PC mit einer Digi Data 1.440, einer Analog-Digital-Wandler-Schnittstelle in Verbindung mit P-Clamp 10.0, Software-Manipulatoren, ein Mikroskop, einen vibrationsisolierten Tisch und eine Faraday-Käfig. Ziehen Sie zunächst eine Pipette aus einer Borosilikat-Glaskapillare mit einem Flaming-Brown-Mikropipettenzieher. Der optimale Widerstand der Pipette sollte zwischen 80 und 100 Megaohm liegen. Geben Sie die submikrosomalen Vesikel in eine physiologische intrazelluläre Lösung. Füllen Sie dann eine Patch-Clamp-Pipette mit derselben Lösung.Die Vesikel im Phasenkontrast sichtbar machen. Mikroskopie nachdem SMVs bei Raumtemperatur gepatcht wurden. Die Aktivität aufzeichnen, wenn das Membranpotenzial für jeweils 10 Sekunden im Bereich von minus 100 Millivolt bis plus 100 Millivolt gehalten wird.Die aufgezeichneten Daten werden mit der Verstärkerschaltung bei fünf Kilohertz gefiltert und mit der Clampfit-10.0-Software analysiert. Diese Abbildung zeigt die Aufarbeitung eines Lysats, der aus Zytoplasma und Mitochondrien hergestellt wurde. Das obere Feld zeigt eine Immunoblot-Analyse unter Verwendung eines Antikörpers gegen das zytosolische Protein GA dh.Das untere Panel zeigt eine Blot-Aufnahme mit einem Antikörper gegen das Protein der mitochondrialen Innenmembran. Cox vier Hier sind zwei repräsentative Patch-Clamp-Aufnahmen vor und nach der Zugabe von einem Millimolar aTP. Das Haltepotential beträgt positiv 70 Millivolt. Die gestrichelte Linie stellt null Pikoampere dar.Jede Spur wird 10 Sekunden lang aufgezeichnet, und es liegen 10 Sekunden zwischen den Spuren. Hier sind Beispielkurven der zeitlichen Änderungen der Fluoreszenzintensität des CMA-Indikators in Gegenwart von SMV sowie in Abwesenheit und Gegenwart eines TP. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mitochondrien und submikrosomale Vesikel, die F1-F0-ATP-Synthase enthalten, isoliert. Außerdem sollten Sie verstehen, wie man mit einer Elektrode eine widerstandsfähige Dichtung an der Membran des Vesikels bildet, um die Kanalaktivität des ATP-Synthase-Komplexes zu analysieren.

f1fo-atpase-vesicle-preparation-technique-for-performing-patch-clamp

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dies ist als eine Einführung in die Klemme Aufnahme von Xenopus laevis Oozyten Patch soll. Es deckt Dotterhaut Entfernung, Bildung einer Gigaohm Dichtung (Gigaseal) und die optionale Konvertierung der Patch auf die outside-out-Topologie.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Ionenstrom von BK-Kanälen aufgezeichnet wird mit Patch-Clamp-Techniken. BK-Kanäle sind in...

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik namens Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, die eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Mauthner-Neuronen und anderen retikulospinalen Zellen in Zebrafischembryonen ist.

Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie: Eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen

Wir haben ein intaktes Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung über Patch-Clamp-Aufzeichnung von den Mauthner Neuronen und anderen Zellen retikulospinale in Zebrafischembryonen zu erfassen und überwachen elektrische Aktivität entwickelt. So sind wir in der Lage, erregende und hemmende synaptische Ströme, spannungsgesteuerte Kanalaktivität und Aktionspotentiale von wichtigen Nervenzellen im sich entwickelnden Embryos aufzeichnen.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Um häufigsten verwendeten Methoden, um zu studieren TRPV4 ergänzen, werden zwei Methoden beschrieben: Seine Mechanosensitivität kann durch Ca 2 +-Aequorin Luminometrie in transgenen Hefe auf hypo-osmotischen Herausforderung untersucht werden. Es kann auch in TRPV4-RNA untersucht werden injizierten Xenopus Oocyten durch Ganzzell-Zweielektroden-Spannungsklemmen-oder Patch-Clamp in Ein-Zelle oder entfernten Modus.

Hefe und luminometrischer Xenopus Eizelle Elektrophysiologische Untersuchungen des Molecular Mechanosensitivität von TRPV4

Elektroformation, und Gel-unterstützte Schwellung - Die Wiederherstellung der Transmembranprotein, KvAP, in riesige unilamellare Vesikel (GUVs) ist für zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden nachgewiesen. In beiden Verfahren werden kleine unilamellare Vesikel, die das Protein enthält, zusammengeschmolzen, um GUVs die dann durch Fluoreszenzmikroskopie und Patch-Clamp-Elektrophysiologie untersucht werden können zu bilden.

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Dieser Methodenartikel beschreibt die wichtigsten Schritte bei der Messung des H + -Lecks über die innere mitochondriale Membran mit der Patch-Clamp-Technik, einem neuen Ansatz zur Untersuchung der thermogenen Kapazität von Mitochondrien.

Die Verwendung der Patch-Clamp-Technik zur Untersuchung der thermogenen Kapazität von Mitochondrien

Trotz der jüngsten Fortschritte bleiben viele mitochondriale Hefeproteine mit ihren Funktionen völlig unbekannt. Dieses Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung der submitochondrialen Lokalisation von Proteinen, die für die Aufklärung ihrer molekularen Funktionen von grundlegender Bedeutung war.

Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Diese Methode nutzt den Beitrag der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore zum Protonenleck mit niedriger Leitfähigkeit, um die Spannungsschwelle für die Porenöffnung bei neonatalen Fragile-X-Syndrom-Mäusen mit erhöhtem mitochondrialem Coenzym-Q-Gehalt im Vergleich zur Wildtypkontrolle zu bestimmen.

Beurteilung der offenen Wahrscheinlichkeit der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore im Setting des Coenzym-Q-Überschusses

Mitochondriale Kontaktstellen sind Proteinkomplexe, die mit mitochondrialen inneren und äußeren Membranproteinen interagieren. Diese Stellen sind essentiell für die Kommunikation zwischen den mitochondrialen Membranen und damit zwischen dem Zytosol und der mitochondrialen Matrix. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung von Kandidaten, die sich für diese spezifische Klasse von Proteinen qualifizieren.

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur direkten Messung der Ionenkanalaktivität auf intrazellulären Vesikeln unter Verwendung eines manuellen endolysosomalen Patch-Clamp-Systems. Wir veranschaulichen die Methode, bei der Endolysosomen vergrößert und diese Vesikel manuell isoliert werden. Dieser Ansatz stellt sicher, dass die Forscher das Verfahren genau replizieren und anwenden können.

Patch-Clamp-Techniken für die Analyse einzelner endolysosomaler Vesikel

Lernen Sie die Isolierung von F1FO-ATPase-Vesikeln aus Rattenhirn für Patch-Clamp-Aufnahmen. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse der mitochondrialen ATP-Synthase-Aktivität in Neuronen.

Weitere Videos entdecken