₁ F _O ATPase Vesicle Vorbereitung und Technik für Darstellende Patch-Clamp-Recordings von submitochondrialen Vesikelmembranen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, F1 F null APAs-Vesikel aus dem Rattengehirn zu isolieren, um Patch-Clamp-Aufzeichnungen durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zuerst das Gehirn einer Ratte entnommen und homogenisiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die synaptischen Zonen durch Druck zu stören.

Als nächstes werden die Synaptosomen auf die Fläschchengradienten geschichtet. Der letzte Schritt besteht darin, mit den Fingern Toin und L zu inkubieren, um die endgültigen Vesikel für die Patch-Clamp-Aufzeichnung zu erhalten. Eine wichtige Funktion der Mitochondrien ist die TP-Produktion durch oxidative Phosphorylierung.

Das Enzym, das für die Produktion einer TP verantwortlich ist, ist die A-TP-Synthase, die sich an der inneren Membran der Mitochondrien befindet. Um die Funktion der A-TP-Synthase im Detail zu untersuchen, isolieren wir spezielle submitochondriale Vesikel, die wir SMVs nennen. Sie enthalten das Synthase-Enzym A TP in einer Inside-Out-Konfiguration.

Diese SMVs nehmen wir dann mit einer Patch-Clamp-Elektrode auf und bestimmen die Undichtigkeit ihrer Membran. Das sagt uns etwas über die Effizienz einer TP-Produktion durch die Mitochondrien. Heute wird Sylvia Ti, eine Postdoktorandin in meinem Labor an der Yale University, dieses Verfahren demonstrieren.

Bei diesem Verfahren schneidet man, nachdem man den Kopf einer Ratte durch Enthauptung erhalten hat, die Haut ab, um den Schädel freizulegen, und öffnet dann den Schädel vorsichtig, indem man ihn mit einer Schere oder einem Rons schneidet. Entfernen Sie anschließend das Gehirn, zerkleinern Sie das Gehirn ohne das Kleinhirn schließlich in Isolation, puffern Sie es und übertragen Sie es dann auf einen Fünf-Milliliter-Glas-Teflon-Homogenisator, um das Gewebe 10 Mal sanft zu homogenisieren, insgesamt etwa fünf Minuten. Danach zentrifugieren Sie die Probe bei 1.500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in einer Tischzentrifuge.

Bewahren Sie den Überstand mit Mitochondrien und Synaptosom auf und entsorgen Sie das Pellet. Dann zentrifugieren Sie es erneut bei 16.000 Mal, G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in einer Tischzentrifuge. Als nächstes verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie den Gaumen In 500 Mikrolitern Isolationspuffer brechen Sie das Synaptosom mit einem Zellaufschlussgefäß auf, indem Sie einen Druck von 1.200 PSI für 10 Minuten ausüben, gefolgt von einer schnellen Dekompressionsschicht die zerstörten Synap-Zonen auf die Zentrifugenröhrchen mit zwei verschiedenen Konzentrationen von Fial, die zwei Schichten bilden.

Anschließend werden die Röhrchen in einen SW 50.1 Rotor gelegt und 20 Minuten bei vier Grad Celsius bei 126, 500 mal G zentrifugiert. Bei einer Ultrazentrifuge besteht der Gaumen aus den gereinigten Mitochondrien. Die Schicht zwischen den verschiedenen Dichten von fial ist das ungestörte Synaptosom.

Waschen Sie anschließend das Pellet, indem Sie isoliert zentrifugieren. Puffern Sie 10 Minuten lang bei 16.000 g bei vier Grad Celsius in einer Tischzentrifuge. Nun Resus, suspendieren Sie die Mitochondrien in 200 Mikrolitern Isolationspuffer, kombiniert mit einem gleichen Volumen von 1%digit toin.

15 Minuten auf Eis legen. Als nächstes wird mehr Isolierung hinzugefügt, gepuffert und 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 16.000 G zentrifugiert. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, suspendieren Sie dann den Gaumen in 200 Mikrolitern Isolationspuffer und fügen Sie zwei Mikroliter 10%Lu bra, PX hinzu, mischen Sie es und legen Sie es 15 Minuten lang auf Eis.

Danach die Mischung isoliert schichten und in den Zentrifugenröhrchen puffern. Legen Sie die Röhrchen in einen SSW 50.1 Rotor und zentrifugieren Sie ihn eine Stunde lang bei 182.000 mal G bei vier Grad Celsius. Nach einer Stunde.

Waschen Sie die endgültige Palette, indem Sie sie 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius in einem Isolationspuffer bei 16.000 G zentrifugieren. Ein typisches Elektrophysiologie-Rig besteht aus einem Verstärker, einem PC-Computer, der mit einem Digi Data 1, 440, einer Analog-Digital-Wandlerschnittstelle in Verbindung mit der P-Klemme, 10.0-Softwaremanipulatoren, einem Mikroskop, einem Schwingungsisolationstisch und einem Faradayschen Käfig ausgestattet ist. Ziehen Sie zuerst eine Pipette aus einem Kapillarrohr aus Boros-Silikatglas in einen flammenden braunen Mikropipettenzieher.

Der optimale Widerstand der Pipette sollte zwischen 80 und 100 Megaohm liegen. Die submitochondrialen Vesikel in eine physiologische intrazelluläre Lösung geben. Füllen Sie dann eine Patch-Clamp-Pipette mit der gleichen Lösung.

Visualisieren Sie die Vesikel unter Phasenkontrast. Mikroskopie nach dem Patchen von SMVs bei Raumtemperatur. Zeichnen Sie die Aktivität auf, wenn das Membranpotential für jeweils 10 Sekunden auf einer Spannung von minus 100 Millivolt bis plus 100 Millivolt gehalten wird.

Die aufgezeichneten Daten werden mit Hilfe der Verstärkerschaltung bei fünf Kilohertz gefiltert und mit der Software clamp fit 10.0 analysiert. Diese Abbildung zeigt den Blot von Lysat, der aus Cytosol und Mitochondrien hergestellt wurde. Das obere Bild zeigt einen Immunblot mit einem Antikörper gegen das zytosolische Protein GA dh.

Das untere Bild zeigt einen Blot mit einem Antikörper gegen das mitochondriale innere Membranprotein. Cox vier: Hier sind zwei repräsentative Patch-Clamp-Aufnahmen vor und nach der Zugabe von einem Millimolar a TP. Das Haltepotenzial beträgt positive 70 Millivolt. Die gestrichelte Linie stellt null Picoampere dar.

Jede Ablaufverfolgung wird 10 Sekunden lang aufgezeichnet und zwischen den Ablaufverfolgungen und der Anzeige liegen 10 Sekunden. Hier sind die Beispielspuren der Änderungen der Fluoreszenzintensität des A CMA-Indikators im Laufe der Zeit in Gegenwart von SMVs und in Abwesenheit und Gegenwart eines TP. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mitochondrien isoliert, ein Vesikel unterhalb der Mitochondrien, das F1 FO 80 TP Synthes enthält. Darüber hinaus sollten Sie unsere Form I resistente Dichtung mit einer Elektrode auf der Membran des Vesikels verstehen, um die Kanalaktivität des A TP Syntase Komplexes zu analysieren.