Untersuchungen über Veränderungen der hippokampalen Schaltung Funktion Nach Mild Traumatic Brain Injury

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Veränderungen der Netzwerkfunktion in Gehirnarealen zu untersuchen, die von einem experimentellen Modell einer leichten traumatischen Hirnverletzung betroffen sind. Die Experimente beginnen mit der Applikation einer lateralen Flüssigkeitspercussion-Verletzung bei einer Maus, welche sowohl die Pathologie als auch die Symptomatologie einer menschlichen leichten traumatischen Hirnverletzung nachahmt. Als zweiter Schritt wird eine hippocampusabhängige Verhaltensreaktion, die kontextuelle konditionierte Furchtreaktion, verwendet, um die durch die Hirnverletzung verursachte kognitive Beeinträchtigung zu bewerten. Anschließend kommen extrazelluläre und intrazelluläre Ableitungen sowie spannungsabhängige Farbstoffe zum Einsatz, um regionsspezifische Veränderungen im synaptischen Gleichgewicht zwischen exzitatorischer und inhibitorischer synaptischer Übertragung zu ermitteln. In der untersuchten Region, dem Hippocampus, zeigen die Ergebnisse unterbereichsspezifische Veränderungen der netto synaptischen Wirksamkeit im Hippocampus, basierend auf Unterschieden zwischen den Kontroll- und den verletzten Tieren über die drei beschriebenen Ableitungstechniken hinweg.

Der Hauptvorteil dieses Ansatzes liegt in der Möglichkeit, die Auswirkungen sowohl des pathologischen Zustands als auch potenzieller Therapeutika auf mehreren physiologischen Ebenen zu unterscheiden, wodurch ein kohärenteres Bild der Schaltkreisdefizite entsteht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur traumatischen Hirnverletzung zu beantworten, beispielsweise, welche Neuronen spezifisch am anfälligsten für Verletzungen sind und folglich den größten Beitrag zur hippokampalen Dysfunktion nach der Verletzung leisten. Die Implikationen unseres Ansatzes reichen bis hin zur Behandlung traumatischer Hirnverletzungen, da sie es uns ermöglichen, zunächst die zugrundeliegenden Mechanismen abzugrenzen und anschließend potenzielle Therapien zu entwickeln, um eine fehlende Physiologie in Bereichen, die durch die Hirnverletzung geschädigt wurden, wiederherzustellen.

Betäuben Sie die Maus in diesem Verfahren mit einer intraperitoneal verabreichten Mischung aus Ketamin und Xylazin. Führen Sie anschließend eine Kraniotomie am rechten Parietalbereich mit einer Zahnfräse mit drei Millimetern Außendurchmesser durch. Befestigen Sie dann die Nadelspitze der Lure-Lock-Kanüle mit Cyanoacrylat und dentalem Acryl über der Kraniotomie.

24 Stunden später das Tier mittels Inhalation von Isofluran anästhesieren. Sobald die normale Atmung wieder eingesetzt hat, aber bevor die Maus wieder empfindlich auf Reize reagiert, über das Fluid-Percussion-Verletzungsgerät einen 20 Millisekunden dauernden Salzwasserimpuls auf den Schädel applizieren. Den Anschlussverbinder unmittelbar nach der Verletzung entfernen. Danach die Maus erneut mit Isofluran anästhesieren und die Kopfhaut vernähen.

Handhaben Sie die Maus an zwei aufeinanderfolgenden Tagen vor der Trainingseinheit zur konditionierten Furchtreaktion. Am Tag des Trainings stellen Sie die Maus für drei Minuten in die Konditionierungskammer, bevor Sie einen 1,5 mA starken Bodenschlag für zwei Sekunden verabreichen. Anschließend lassen Sie die Maus weitere 30 Sekunden in der Kammer, bevor sie entfernt wird.

Nach einer Wartezeit von 24 Stunden bringt man die Maus für fünf Minuten in die Konditionierungskammer zurück und bewertet anschließend sieben Tage nach der Verletzung die Starre in Fünf-Sekunden-Intervallen. Bereiten Sie einen Liter künstlicher zerebraler Spinalflüssigkeit und 250 Milliliter Zuckerschneidelösung vor. Stellen Sie sicher, dass alle Instrumente und Lösungen, die bei der Hirnschnittpräparation verwendet werden, eiskalt sind und auf Eis liegen.

Betäuben Sie die Maus mit Isofluran schnell und schonend. Entnehmen Sie das Gehirn der Maus und legen Sie es in Saccharose. Anschließend schneiden Sie das Gehirn zurecht.

Platzieren Sie die frisch geschnittene Coddle-Oberfläche des Gehirns auf einen Tropfen Sekundenkleber auf der Vibram-Plattform vor einem Agarblock. Schneiden Sie 350 µm dicke frontale Schnitte. Sie sollten vier oder fünf Schnitte mit intaktem hippokampalem Kreislauf erhalten können.

Anschließend die Schnitte mindestens eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie nun einige zwei bis fünf Megaohm starke Borosilikatglaselektroden vor. Übertragen Sie mithilfe des vertikalen Ziehgeräts einen Schnitt in die Kammer und platzieren Sie anschließend eine Elektrode in den Elektrodenhalter zur Aufzeichnung des extrazellulären Feldpotentials.

Platzieren Sie die Stimulations-Elektrode über dem Axonstrang auf dem Schnitt, beispielsweise über dem perforanten Pfad oder den Schäffer-Kollateralen. Senken Sie anschließend die Ableitelektrode weiter in den Schnitt ein. Geben Sie danach einen einzelnen elektrischen Impuls ab, um das extrazelluläre Feld-Postsynaptische Potential hervorzurufen.

Setzen Sie die Stimulation fort, wobei die Tiefe der Aufnahmeelektrode zwischen den Stimuli variiert wird, sobald die maximale Antwort erreicht ist. Dies deutet darauf hin, dass sich die Elektroden auf derselben Ebene befinden. Die Z-Ebenen-Analyse umfasst typischerweise Messungen, bei denen die Amplitude des Faservolleys sowohl bei verletzten als auch bei sham-operierten Mäusen verglichen wird, um die präsynaptische Aktivierung zu bewerten, sowie den Vergleich der Steigung des F-E-P-S-P, um die postsynaptische Aktivierung zu evaluieren. Führen Sie für die Patch-Clamp-Aufnahme erneut eine Schnitte in die Kammer ein und senken Sie die Aufnahmeelektrode ab.

Nähern Sie sich einer Zelle mit positivem Druck auf der Elektrode, um sicherzustellen, dass die Aufnahmeelektrode nicht verstopft, während sie durch das Gewebe nach unten bewegt wird. Wenn die Elektrode sanft die Zelle berührt, wenden Sie negativen Druck an, um einen Giga-Seal zwischen der Elektrode und der Plasmamembran zu bilden. Anschließend geben Sie kurze Impulse negativen Drucks ab, um die Plasmamembran zu durchbrechen und die Ganzzell-Konfiguration zu erreichen.

Beseitigen Sie den kapazitiven Überschwinger mithilfe des Verstärkers und kompensieren Sie den Serienwiderstand, um genaue Messungen sicherzustellen. Quantifizieren und vergleichen Sie anschließend Geschwindigkeit und Größe spontaner synaptischer Ströme bei Mäusen mit Hirnverletzung und sham-operierten Kontrollen. Bereiten Sie in diesem Schritt den Farbstoffvorrat vor, indem Sie ein Milligramm Farbstoff drei onap DHQ in 50 Mikrolitern Ethanol auflösen.

Geben Sie zwei Mikroliter Aliquote in mit Folie umwickelte Röhrchen und lagern Sie bei minus 20 Grad Celsius. Stellen Sie die Arbeitslösung des Farbstoffs täglich durch eine Verdünnung im Verhältnis 1 zu 200 in A CSF her. Inkubieren Sie dann einen Schnitt auf mit A CSF angefeuchtetem Filterpapier und färben Sie ihn mit 90 Mikrolitern Farbstofflösung für 16 Minuten.

Anschließend spülen Sie es mit und geben Sie es in die Interface-Aufnahmekammer. Bringen Sie die stimulierenden und Ableitelektroden wie in der extrazellulären Feldableitung beschrieben an.

Stellen Sie die Intensität der Lichtstimulation so ein, dass die Antwort in der Mitte der Kamera zentriert ist. Entfernungsbilder werden typischerweise mit einer Rate von 500 bis 1000 Bildern pro Sekunde aufgenommen. Lösen Sie den Verschluss für die Lichtstimulation 200 Millisekunden vor der elektrischen Stimulation aus, um eine Stabilisierung des anfänglichen schnellen Photobleichens zu ermöglichen.

Pausieren Sie 10 Sekunden zwischen den Versuchen. Wechseln Sie abwechselnd zwischen Erwerbsversuchen mit elektrischer Stimulation und solchen ohne elektrische Stimulation, um später die Hintergrundaktivität ohne elektrische Stimulation subtrahieren zu können. Nehmen Sie dann die Ruhe-Lichtintensität vor dem Öffnen des Verschlusses auf.

Jeder VSD-Versuch kann als Film von Fluoreszenzablesungen analysiert werden. Das heißt, jeder Versuch ist eine dreidimensionale Datenmatrix mit Werten in den räumlichen Dimensionen X und Y über die Zeit. Nehmen Sie 10 bis 12 VSD-Versuche unter jeder Testbedingung auf und berechnen Sie die intra-pixelbezogene, auf die Vorbeleuchtung normierte Fluoreszenzänderung gemäß dem begleitenden Manuskript.

Diese Abbildung zeigt ein Beispiel einer F-E-P-S-P-Aufzeichnung im Bereich CA1. Die erste abwärts gerichtete Ablenkung ist das Stimulationsartefakt, gefolgt von der präsynaptischen Faservolle und anschließend dem F-E-P-S-P. Hier sind die Input-Output-Kurven dargestellt, die eine Abnahme der netto synaptischen Wirksamkeit in CA1 nach einer Fluid-Percussion-Verletzung zeigen.

Und hier sind die Input-Output-Kurven, die eine Zunahme der netto synaptischen Wirksamkeit im Gyrus dentatus nach FPI zeigen. Hier sehen Sie ein Beispiel eines spontanen exzitatorischen postsynaptischen Stroms aus einer CA1-parametralen Zelle. Hier ist ein Beispiel für eine Aktionspotentialfolge aus einer CA1-parametralen Zelle und einem schnellfeuernden CA1-Interneuron.

Dies ist ein mit Lucifer Yellow gefüllter inhibitorischer Interneuron im Bereich CA1 ohne dendritische Dornen, und hier ist ein mit Lucifer Yellow gefüllter parakommissuraler Neuron im Bereich CA1 mit dendritischen Dornen. Diese Abbildungen zeigen einen koronalen Hippocampus-Schnitt von einer Maus. Die gelben bis roten Pixel repräsentieren die exzitatorische Aktivität im Bereich CA1, 14 Millisekunden nach der afferenten Stimulation der Schaffer-Kollateralen.

Rot zeigt eine stärkere Depolarisation an, während Gelb eine geringere, aber dennoch signifikante Depolarisation anzeigt. Die blauen Pixel repräsentieren die Stellen inhibitorischer Aktivität im Bereich CA1 56 Millisekunden nach derselben afferenten Schaffer-Kollateral-Stimulation, wobei dunkleres Blau eine stärkere Hyperpolarisation anzeigt. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mehrere ex vivo-Aufzeichnungstechniken kombiniert, um eine klinisch relevante pathologische Erkrankung, die eine Störung von neuronalen Schaltkreisen beinhaltet, zu untersuchen.