Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Die klassische Kommunikation zwischen prä- und postsynaptischen Elementen beinhaltet ein Aktionspotential, das am präsynaptischen Terminal ankommt und durch einen Anstieg des Calciums die Freisetzung von Glutamat auslöst, wodurch postsynaptische Rezeptoren aktiviert werden. Die Beobachtung, dass Astrozyten eng mit Synapsen in Kontakt stehen und Neurotransmitterrezeptoren exprimieren, hat jedoch diese Sichtweise zum Konzept der dreigliedrigen Synapse verändert. Daher wird die andauernde glutamaterge Übertragung auch den Astrozyten aktivieren und durch einen Anstieg des intrazellulären Calciums auslösen.

Die Freisetzung von Gliotransmittern, die anschließend an extrasynaptische oder synaptische Rezeptoren binden können, moduliert prä- und postsynaptische Aktivitäten. Darüber hinaus exprimieren Astrozyten das Hauptaufnahmesystem für synaptisch freigesetztes Glutamat. Außerdem entfernen sie Kalium, das während der Aktionspotenzialfeuerung und der nachfolgenden postsynaptischen Aktivierung von den prä- und postsynaptischen Endigungen über ihre Kaliumkanäle freigesetzt wird.

Dieses Kalium wird anschließend intrazellulär zu Stellen mit niedrigeren extrazellulären Kaliumkonzentrationen transportiert, wo es freigesetzt wird oder über Nexus-Kontakte (Gap Junctions) in benachbarte Astrozyten diffundiert. Auf diese Weise regulieren Astrozyten durch die Kontrolle der extrazellulären Konzentration neuroaktiver Substanzen sowie durch die Freisetzung klarer Transmitter die Stärke synaptischer Aktivität maßgeblich mit. Meine Arbeitsgruppe untersucht die Rolle von Neuroglia-Interaktionen in der zerebralen Pathophysiologie.

Daher haben wir diese Technik umfassend angewandt und verfeinert, um die Rolle der Astrozyten bei der synaptischen Übertragung von Moment zu Moment aufzuklären. Tatsächlich ist diese Technik leistungsstark, da sie die gleichzeitige Online-Überwachung der dynamischen elektrophysiologischen Antworten von Neuronen ermöglicht. Und wie heute im Osteocytes Evap Clinic werden Ash und Jeremy Siebel, Mitglieder des Labors, Ihnen demonstrieren, wie man diese Technik durchführt, und Ihnen erklären, wie sie uns dabei hilft, das enge, intime Gespräch zwischen Neuronen und Astrozyten zu verstehen.

Ich habe die Auswirkungen von Astroglia-Netzwerken auf Neuronen, synaptische Übertragung und Plastizität untersucht, indem ich Doppelaufzeichnungen der neuronale Aktivität sowie des Auftretens von Astroglia-Kalium- und Glutamat-Transport durchgeführt habe, und fand heraus, dass die vernetzte Aktivität der Astroglia die extrazelluläre Entfernung von Kalium und Glutamat während der neuronalen Aktivität fördert. Ich habe die Eigenschaften und die Plastizität des Auftretens von Astroglia im Zusammenhang mit der Neurophysiologie untersucht. Während der Aufzeichnung von Astroglia- und neuronaler Aktivität konnte ich feststellen, dass die Antwort der Astrozyten auf neuronale Aktivierung hauptsächlich durch Kaliumströme vermittelt wird.

Diese Ströme weisen eine eigene elektrische Plastizität auf, die die neuronale Erregbarkeit und Plastizität nicht reguliert. Mit anderen Worten, Astrozytenzählung, die sehr erregte. Neuros. Hier stellen wir eine wichtige Methode vor, um gleichzeitig die Aktivität von Urin und Astroglia in akuten hippocampalen Schnitten zu untersuchen, indem duale Ableitungen astrozytärer Membranströme und urinärer Eingangspotentiale durchgeführt werden, die durch die Stimulation präsynaptischer Fasern hervorgerufen werden.

Außerdem werden wir gepaarte Ableitungen einzelner Neuronen und benachbarter Astrozyten durchführen, um ASTO-Glykogenantworten während der neuronalen Aktivität zu untersuchen. Wir haben das Hippocampus gewählt, da dieses Gebiet eine starke anatomische und funktionelle Kompartimentierung aufweist und hinsichtlich der neuroanatomischen Verschaltung sowie der synaptischen Aktivität und Plastizität gut charakterisiert ist. Beginnen Sie die Experimente mit der Herstellung hippokampaler Hirnschnitte; bereiten Sie hierfür zunächst eisgekühltes, mit Sauerstoff angereichertes Pufferlösung vor.

Künstliches zerebrales Spinalfluid, betäuben Sie Ihre Mäuse tief und trennen Sie schnell den Kopf ab und überführen Sie ihn in A-CSF. Öffnen Sie den Schädel mit drei Schnitten, um nun die beiden Hemisphären zu trennen. Schließlich überführen Sie sie in mit Sauerstoff angereichertes A-CSF.

Lassen Sie es etwa fünf Minuten lang gleichmäßig flechten. Beginnen Sie nun mit einer Hemisphäre. Die Dissektion des Hippocampus beginnt mit der Entfernung des Mittelhirns.

Die detaillierte Hippocampus-Präparation wird in dieser Abbildung nun veranschaulicht. Zuerst wird das getrennte Hemisphäre an seiner kortikalen Seite positioniert, um Zugang zum Mittelhirn zu erhalten. Mithilfe zweier Löffel wird das Mittelhirn entfernt.

Der Hippocampus ist nun sichtbar, wie durch die gestrichelten Linien angezeigt. Dissezieren Sie den Hippocampus mit einem Löffel, beginnend am Fia, das als breite Struktur sichtbar ist. Führen Sie einen Löffel unterhalb des Hippocampus ein und trennen Sie mit Hilfe eines zweiten Löffels den benachbarten Kortex ab.

Übertragen Sie den Hippocampus in eine kleine Kulturschale mit oxygeniertem aCSF und fahren Sie mit der zweiten Hemisphäre fort. Positionieren Sie beide Hippocampi auf einem kleinen AGA-Block mit der alveolaren Seite nach oben. Saugen Sie nun das aCSF ab. Kleben Sie den Hippocampus auf Ihre Schneidkammervorrichtung.

Überführen Sie den Hippocampus in die Schneidekammer und schneiden Sie 300 oder 400 Mikrometer dicke Schnitte. Sammeln Sie die Schnitte in einer mit Sauerstoff belüfteten Lagervorrichtung und lassen Sie sie mindestens eine Stunde vor der Aufzeichnung bei Raumtemperatur ruhen, um umfassende Aufzeichnungen einzelner Astrozyten durchzuführen. Übertragen Sie Ihren Hippocampus-Schnitt auf eine mit Polylysin beschichtete Deckglasunterlage.

Trocknen Sie das überschüssige ACSF leicht ab, um die Anheftung des Hippocampus-Schnitts an die polybeschichtete Deckglaslamelle zu ermöglichen, und geben Sie anschließend erneut ACSF auf den Schnitt. Überführen Sie den Schnitt in Ihre Aufnahmekammer, die kontinuierlich mit oxygeniertem ACSF mit einer Perfusionsgeschwindigkeit von ein bis zwei Milliliter pro Minute durchspült wird. Zur Identifizierung von Astrozyten können Mäuse verwendet werden, die EGFP unter dem astroglia-spezifischen GFAP-Promotor exprimieren, um Patch-Clamp-Aufnahmen durchzuführen.

Füllen Sie eine Glaspipette mit einem Widerstand von vier bis sechs Megaohm mit gefilterter kalter intrazellulärer Lösung, indem Sie eine intrazelluläre Lösung verwenden, die Rodda Dron enthält. So können Sie den gepatchten Astrozyten in Rot und grün visualisieren. Sie sehen die benachbarten Astrozyten, die EGFP exprimieren. Unter dem GFAP-Promotor lassen sich Astrozyten anhand ihrer kleinen Soma-Größe von etwa 10 Mikrometer und ihres Hauptfortsatzes mit Verzweigungen identifizieren, der gewöhnlich drei bis vier Äste aufweist.

Eine Spritze, die über einen Schlauch mit der Pipette verbunden ist, ermöglicht die Anwendung eines positiven Drucks während des Eindringens in das Gewebe. Im Befehlsfenster wird ein Testimpuls von 10 Millivolt ausgelöst und der Haltestrom neu justiert. Anschließend bewegt man die Pipette mithilfe des Mikromanipulators in das Gewebe, um sich der Zelle zu nähern. Wenn die Zelloberfläche erreicht ist, wird die Pipette weiter vorgeschoben, bis eine Delle sichtbar wird, die sich als Lichtablenkung zeigt und darauf hinweist, dass die Zelloberfläche leicht deformiert wird.

Aufgrund der Anwendung eines positiven Drucks wird die Astrozytenzellmembran nun dicht auf der Öffnung der Glaspipettenspitze abschließen, was durch einen ansteigenden Widerstand erkennbar ist, wenn ein Giga-Seal erreicht ist. Führen Sie die Kapazitätskompensation durch und wechseln Sie in die Ganzzellenkonfiguration, indem Sie vorsichtig negativen Druck aufbringen und dabei die Testsignale im Befehlsfenster beobachten. Das Eindringen in die Zelle wird durch einen Stromfluss durch die Membran sichtbar.

Die Anwendung einer Serie von hyperpolarisierenden und depolarisierenden Spannungsschritten ermöglicht die Charakterisierung der Eigenschaften der Zellmembran von Astrozyten. Normalerweise zeigen Astrozyten lediglich passive Stromantworten. Die Strominjektion im Strom-Klemm-Modus führt nicht zu Aktionspotentialen. Dieses Fehlen von Feuern dient als zusätzliche Bestätigung dafür, dass tatsächlich ein Astrozyt angepatcht wurde. Die Zugabe eines Tracers wie Schwefel oder Domäne B zu Ihrem Patch-Pipett ermöglicht die Visualisierung des angepatchten Astrozyten.

Außerdem ermöglicht die passive Diffusion des Tracers während 20 Minuten im Strom-Klemm-Modus die Visualisierung benachbarter, über gap junctions verbundener Astrozyten, um Doppelaufnahmen der neuronalen erregenden Transmission und anschließend ausgelöster astrozytärer Ströme durchzuführen. Zunächst blockieren wir die inhibitorische Transmission mit Precor toin, um Hypererregbarkeit zu verhindern, die im Fehlen der GABAergen Transmission auftritt. Wir durchtrennen die durch Sharf-Kollateralen vermittelten Verbindungen zwischen CS drei und C eins mit einem kleinen Iris-Messer.

Danach positionieren wir eine A-CSF-Feldelektrode zur Stimulation, eine Feldelektrode zur Ableitung sowie die astrozytäre Patch-Clamp-Elektrode. In dem Hippocampus-Schnitt wählen wir einen Astrozyten aus und platzieren die Feldelektrode 5, 200 Mikrometer entfernt von diesem, um sicherzustellen, dass der Astrozyt tatsächlich die mit der Feldelektrode aufgezeichnete Aktivität integriert. Die Stimulation der Schäffer-Kollateralen erzeugt ein exzitatorisches Feldpotential. Dieses Feldpotential setzt sich zusammen aus der Fasenwand, die die Anzahl der stimulierten Axone widerspiegelt, und der anschließenden postsynaptischen Depolarisation, um Doppelaufzeichnungen von neuronalen Eingangspotentialen und Ganzzellstromantworten der Astroglia durchzuführen.

Zunächst platzieren Sie Ihre Feldableitungselektrode etwa 50 Mikrometer entfernt von dem ausgewählten Astrozyten. Danach bewegen Sie die Patch-Elektrode zum somatischen Bereich des Astrozyten und führen eine Patch-Clamp-Aufnahme durch, wobei die Zelle anhand ihrer passiven Membraneigenschaften bestätigt wird, dass es sich tatsächlich um einen Astrozyten handelt. Nun können wir durch Stimulation von Shaer Cs gleichzeitig neuronale Aktivität und einen darauffolgenden astrozytären Strom erfassen, der aufgrund der Netzwerkverbindungen und der Tatsache, dass ein einzelner Astrozyt Synapsen von bis zu 100 Neuronen kontaktiert, eine lang anhaltende Antwort von bis zu 50 Pikoaum aufweist.

Diese Zellen integrieren die Aktivität einer großen Anzahl gleichzeitig aktiver Synapsen, um Doppel-Aufzeichnungen am Ganzzellpräparat einzelner Neuronen und angrenzender Astrozyten durchzuführen, bei denen zwei Patch-Elektroden in den Stratum-Bereich des Hippocampus-Schnitts abgesenkt werden. Identifizieren Sie im Bereich C ein Neuron von Interesse und etwa 20 bis 60 Mikrometer entfernt in der gleichen Tiefenebene einen Astrozyten, und positionieren Sie anschließend beide Pipetten etwa 10 Mikrometer oberhalb der jeweiligen Zelle, wobei positiver Druck aufgebracht wird. Die Aufzeichnungspipette für den Astrozyten sollte so nah wie möglich am Zielastrozyten positioniert werden, um weitere mechanische Bewegungen zu vermeiden.

Zunächst wird die gga-Dichtung am Neuron hergestellt. Danach wird mit der Aufzeichnung aus dem Astrozyten fortgefahren, der in der Regel langsamer abdichtet als Neuronen. Zusammenfassend die wichtigsten Schritte für duale Ganzzell-Aufzeichnungen: Senken Sie zunächst die beiden Aufzeichnungspipetten in das Schnittpräparat ab.

Nähern Sie sich dem Soma des Astrozyten, führen Sie dann die gga-Dichtung am Neuron durch und schließen Sie ab, indem Sie die gga-Dichtung am Astrozyten durchführen. Neuronen weisen normalerweise einen deutlich höheren Membranwiderstand als Astrozyten auf, der bei pyramidalförmigen Neuronen bei etwa 200 bis 500 Mega liegt, wenn beide Zellen vorliegen. Nun im Spannungs-Klemm-Modus T und hyperpolarisierend aktiviert die Membran transiente Natriumströme im Neuron und passive Kaliumantworten im Astrozyten. Wir zeigen hier, dass die Induktion schneller exzitatorischer postsynaptischer Feldpotentiale durch Stimulation von shaa-Kollateralen eine anschließende langanhaltende Stromantwort hervorruft.

Bei der benachbarten Astrozytenhemmung ionotroper Glutamatrezeptoren mit Remic-Säure zeigt sich, dass der Großteil des astrogly-Stroms auf eine exzitatorische postsynaptische Aktivierung zurückzuführen ist. Die verbleibende B-AIC-Antwort setzt sich aus dem schnellen transienten Glutamat-Transportvorgang, der empfindlich gegenüber TBOA ist, und einem kleinen langanhaltenden Strom zusammen, der höchstwahrscheinlich auf die präsynaptische Kaliumfreisetzung während des Aktionspotentials beruht. Der aszitische Strom überwacht die postsynaptische Aktivität sehr zuverlässig, da beide Größen linear anstiegen, während die präsynaptische Aktivität erhöht wurde.

Außerdem zeigen astrozytäre Ströme, ähnlich wie neuronale Antworten, eine Paarimpuls-Fazilitation. Eine moderate Einzelstimulation der Schaffer-Kollateralen induziert im Vergleich zur kleinen evozierten Depolarisation, die in derselben Zelle im Stromklampf-Modus aufgezeichnet wird, einen relativ großen synaptisch evozierten Astroglialstrom. Dies liegt an dem geringen Membranwiderstand der Astrozyten.

Die Aufzeichnung der synaptisch hervorgerufenen TTO-gly-Membranpotenzialdynamik ist eine direkte Messung der lokalen extrazellulären Kaliumkonzentration. Bei paired recordings eines Neurons und eines angrenzenden Astrozyten beobachteten wir keine strommäßige Antwort des Astrozyten, während das Neuron Aktionspotenziale feuerte, was darauf hinweist, dass sie nicht elektrisch gekoppelt waren. In der CA3-Region hervorgerufene exzitatorische postsynaptische Potenziale lösten ebenfalls strommäßige Antworten in Astrozyten aus. Außerdem potenzierte eine einzige tetanische Stimulation die neuronale Antwort in der CA3-Region stark, während die astrozytäre Stromantwort nur moderat anstieg.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie man erfolgreiche duale elektrophysiologische Ableitungen von Neuronen und Zellen aufbaut und durchführt. Mithilfe dieser Technik können Sie die dynamische Signalübertragung zwischen Neuronen und Astrozyten in Echtzeit untersuchen, und zwar bezüglich der für Sie interessanten elektrophysiologischen Antwort. Insbesondere können Sie erforschen, ob neue GL-Interaktionen, die Eisenkanalfunktionen und -modulationen beinhalten, zur Charakterisierung physiologischer oder pathologischer Zustände beitragen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg mit Ihrem Experiment.