Optical Trapping von Nanopartikeln

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Apertur-Optikfallenanordnung zu erstellen, um Partikel mit einer Größe von etwa 20 Nanometern einzufangen. Dazu wird einem bestehenden optischen Laserfallensystem ein Detektor hinzugefügt, um Messungen zu ermöglichen. Anschließend wird die zu messende Nanopartikellösung in eine mikrofluidische Kammer mit der Doppelnanolochfalle abgegeben, und die Kammer wird in die optische Fallenanordnung eingelegt.

Wenn ein Teilchen in die beleuchtete Öffnung eintritt, erhöht sich die Lichttransmission stark aufgrund der dielektrischen Beladung. Wenn das Teilchen versucht, die Öffnung zu verlassen, führt die verringerte Transmission zu einer Impulsänderung nach außen weg von der Öffnung, was gemäß dem dritten Newtonschen Gesetz eine Kraft bewirkt, die das Teilchen zurück in die Öffnung zieht und es so festhält. Das Teilchen verursacht eine Rotverschiebung der Transmissionskurve, die überwacht werden kann.

Daher kann die Falle zu einem Sensor werden. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Fangereignisse von Nanopartikeln zeigen, einschließlich der Entfaltung der gefangenen Proteine, wie durch Änderungen der Laserintensität durch das doppelte Nanoloch angezeigt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der optischen Falle mit Gradientenkraft liegt darin, dass sie kleinere Nanopartikel bei niedrigeren Laserintensitäten einfangen kann.

Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen der Biochemie beantworten, beispielsweise wie einzelne Proteine falten und miteinander wechselwirken, und wie Viruspartikel lebende Zellen infizieren. Im Allgemeinen werden Personen bei dieser Methode Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, das doppelte Nanoloch in ein bestehendes Laserspangensystem zu integrieren. Der Aufbau für die optische Bindung basiert auf einem optischen Pinzettenset von Thor Labs, das mit einem Kraftmessmodul ausgestattet ist.

Ein Avalanche-Photodioden-Detektor wird verwendet, um den Quadrantendetektor im Kraftmessmodul zu ersetzen. Beim Aufbau des optischen Fallen-Systems sollte immer dann, wenn der Laser eingeschaltet ist, Augenschutz getragen werden. Stellen Sie sicher, dass der Strahl innerhalb eines sicheren Bereichs verbleibt, indem das System in einem geschlossenen Raum betrieben wird und der Strahl so weit wie möglich innerhalb der Fallenanordnung begrenzt bleibt; reflektierender Schmuck sollte vermieden werden.

Es werden Latexhandschuhe getragen. Um die Sauberkeit der Optik sicherzustellen, richten Sie das optische Pinzettenset und das Kraftmessmodul ein. Gemäß den Herstelleranweisungen weist das montierte optische Pinzettenset eine invertierte Lichtmikroskop-Konfiguration auf und besteht aus folgenden Komponenten: einem Fanglaser, einem 100x-Ölimmersionsobjektiv, einer dreidimensionalen Probennanpositionierbühne und einer CCD-Kamera.

Bitte beachten Sie, dass beim Umgang mit Laserdioden ein Schutz vor elektrostatischer Entladung empfehlenswert ist. Das Kraftmessmodul ermöglicht die Kalibrierung der optischen Pinzetten mittels positionsbasierter Detektion der hinteren Brennebene des Kondensors. Anstelle der Kraftmessmodule wird eine silikonbasierte Lawinen-Fotodiode (DDE) oder eine Fotodiode (PD) verwendet.

Der Quadrant-Positionsdetektor fügt außerdem einen Widerstands-Kondensator- oder RC-Filter mit einem 200-Kiloohm-Widerstand und einem 100-Pikofarad-Kondensator ein. Dieser dient dazu, hochfrequentes Rauschen zu reduzieren und das Beobachten von Einfangereignissen auf dem Oszilloskop zu erleichtern. Verwenden Sie ein Koaxialkabel, um den RC-Filter nach dem A PD anzuschließen. Anschließend verwenden Sie Koaxialkabel und einen T-Adapter, um das Oszilloskop und das Datenerfassungsmodul mit dem RC-Filter zu verbinden.

Das System ist nun bereit für das Beladen von Proben. Die Doppelnanolochblende besteht aus zwei Nanolöchern, die mittels eines fokussierten Ionenstrahls in eine Goldschicht eingebracht wurden. Die Schicht ist 100 Nanometer dick und wird von einem Glas-Substrat getragen.

Die Nanolöcher überlappen sich, wodurch zwei scharfe Spitzen entstehen. Nanopartikel werden mittels Laserlicht in dem Spalt zwischen diesen Spitzen eingefangen, das auf das Doppelnanoloch trifft.

Große Justiermerkmale sollten ebenfalls in den Metallfilm eingefräst werden, um die Identifizierung der Position der doppelten Nanolöcher im optischen Mikroskop zu erleichtern. Diese Merkmale sollten etwa 100 Mikrometer von der doppelten Nanolochstruktur entfernt angeordnet sein. Geben Sie 10 Gramm Polydimethylsiloxan oder PDMS-Basis und ein Gramm Härter in einen Einwegbecher und mischen Sie einige Minuten lang.

Entziehen Sie dann die Mischung in einer Vakuumkammer, bis alle Blasen verschwunden sind. Gießen Sie anschließend 1,5 Gramm PDMS in eine Petrischale mit einem Durchmesser von neun Zentimetern. Beschichten Sie das PDMS durch Aufdampfen auf den Boden der Petrischale bei 950 U/min für 65 Sekunden gemäß dem Schleuderverfahren.

Die Dicke ist nicht kritisch, solange sie unter 80 Mikrometern liegt. Legen Sie vorsichtig drei bis fünf Deckgläser Nummer 1,5 auf das PDMS, sodass sie sich nicht überlappen, und evacuieren Sie für 30 Minuten.

Falls sich die Deckgläser während der Evakuierung bewegt und übereinander gestapelt haben, schieben Sie sie vorsichtig auseinander. Achten Sie darauf, dass die PDMS-Schicht unter den Deckgläsern dünn und gleichmäßig bleibt. Evakuieren Sie die Petrischale anschließend erneut für 30 Minuten.

Nehmen Sie die Petrischale aus der Vakuumkammer und erhitzen Sie sie 20 Minuten lang auf einem Heizblock bei 85 Grad Celsius, um das PDMS zu aushärten. Sobald das PDMS erstarrt ist, schneiden Sie mit einer Rasierklinge entlang der Ränder einer der Deckgläser. Heben Sie dann vorsichtig mit einer feinen Pinzette oder einer Klinge das Deckglas an. Eine dünne PDMS-Schicht bleibt am Deckglas haften.

Legen Sie das Deckglas mit PDMS in eine neue Petrischale. Schneiden Sie dann mit einer Rasierklinge ein drei Millimeter mal drei Millimeter großes Fenster in das PDMS aus. Dieses Fenster bildet die Kammer, in der die Nanopartikellösung aufbewahrt wird.

Verwenden Sie einen Laserschneider, um einen Acryl-Mikroskopobjektträgerhalter mit einem Loch von drei Viertel Zoll Durchmesser in der Mitte herzustellen. Kleben Sie den Umfang des Lochs mit doppelseitigem Klebeband ab. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge jegliches überschüssige Klebeband ab.

Platzieren Sie den hergestellten Objektträger auf einer der vorbereiteten mit PDMS beschichteten Deckgläsern, sodass das PDMS zwischen Glas und Acryl eingeschlossen ist. Geben Sie mithilfe einer Mikropipette einige Tropfen einer 0,05 %igen (Gewicht pro Volumen) Polystyrol-Nanosphären-Lösung auf das PDMS-Fenster.

Geben Sie einen Tropfen auf den Goldfilm, an der Stelle, wo sich die Nanolöcher befinden. Legen Sie die Goldprobe auf Deckgläser, sodass sich die Nanolöcher innerhalb des PDMS-Fensters befinden. Achten Sie darauf, dass keine Blasen in der Kammer vorhanden sind.

Drücken Sie dann die Goldprobe gegen die Decke. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, da ein Öl-Immersion-Objektiv verwendet wird. Geben Sie einen Tropfen Öl auf die andere Seite des Deckglases, oberhalb des PDMS-Fensters.

Beachten Sie die Position der Nano-Öffnungen. Führen Sie das Mikroskop ein. Legen Sie den Objektträger mit der Ölseite nach unten in den Objektträgerhalter ein und senken Sie anschließend den Objektträgerhalter so weit ab, bis das Immersionsöl mit dem Mikroskop in Kontakt kommt.

Objektiv, justieren Sie grob die Objektbühne so, dass sich die in den Goldfilm eingebrannten Registrierungsmarken unterhalb des Objektivs befinden. Nutzen Sie eine Bildakquisitions-Software wie Thor site, die als Teil des Fang-Kits beigefügt ist. Suchen Sie die Registrierungsmarken auf dem Goldfilm und folgen Sie den Anzeigelinien bis zu den Nano-Öffnungen.

Platzieren Sie den Objektträger so, dass die Kennmarkierungen und andere freie Bereiche vom Zentrum des Bildschirms freigegeben sind. Eine übermäßige Lichtdurchlässigkeit kann die A PD beim Einschalten des Lasers beschädigen. Da der dichroitische Spiegel nicht perfekt ist, sollte ein Fleck in der Nähe der Bildschirmmitte vom Laserstrahl sichtbar sein.

Verwenden der Piezo-Stage-Steuerungssoftware. Verfeinern Sie die Ausrichtung auf allen drei Achsen weiter. Wenn die Ausrichtung korrekt ist, wird eine maximale Spannung am Photodetektor beobachtet, was die höchste Transmission durch die Nanoöffnung anzeigt.

Nun, da das System eingerichtet ist und die Probe geladen wurde, können optische Fangdaten aufgezeichnet werden. Mithilfe der Markierungshilfen positionieren Sie den Fleck nahe einer bekannten Nanolochposition. Die Doppelnanolöcher sind zu klein, um klar aufgelöst zu werden, und erscheinen auf dem Bildschirm als kleine Punkte.

Die Lichtdurchlässigkeit durch die Probe wird durch den Signalpegel auf dem Oszilloskop angezeigt. Richten Sie die Probe weiter aus, um die Lichtdurchlässigkeit zu maximieren. Achten Sie auf Markierungen sowie sichtbare und unsichtbare Kratzer, da die Lichtdurchlässigkeit in diesen Bereichen hoch sein wird; Nanolöcher zeigen plötzliche Sprünge in der Lichtdurchlässigkeit, während Kratzer dies nicht tun.

Zeigen Sie mit der Wellenplatte allmählichere Änderungen an. Stellen Sie die Lichtpolarisation so ein, dass die höchste Lichtdurchlässigkeit erreicht wird, wenn die doppelte Nanolochstruktur polarisiert ist. Um Daten zu gewinnen, nehmen Sie die Spannung der APDs über das Datenakquise-Modul für die gewünschte Zeit auf.

Die Aufnahmezeiten liegen typischerweise im Bereich von mehreren hundert Sekunden. In diesem Fall wird eine benutzerdefinierte Software für die Datenaufnahme verwendet, und die Spannung wird 2000-mal pro Sekunde abgetastet. Filtern Sie die aufgezeichneten Daten mithilfe von MATLAB mit einem KY-Gole-Filter und stellen Sie sie in einem Diagramm in Abhängigkeit von der Zeit dar, um das Einfangen von 20 Nanometer großen Polystyrol-Nanopartikeln zu zeigen; dabei wurde die Transmission durch die doppelte Nanolochstruktur als Funktion der Zeit gemessen.

Mithilfe der PD-Optik wurde anschließend die Transmission aufgetragen. Im Zeitverlauf ist das Einschließungsereignis charakteristischerweise plötzlich und weist eine scharfe Kante auf, die einen deutlichen Übergang zwischen zwei Transmissionsleistungsstufen zeigt, wie in diesem Beispiel dargestellt. Im eingeschlossenen Zustand tritt häufig eine Zunahme des Signalrauschens auf. Diese Rauschzunahme resultiert aus der Brownschen Bewegung des eingefangenen Teilchens.

Beachten Sie, dass diese Rauschquelle ohne das eingefangene Teilchen nicht vorhanden ist. Es können Artefakte in den Ergebnissen auftreten, die keine Hinweise auf Fangereignisse darstellen. Ergebnisse, die ein Driften zeigen – erkennbar als langsame Änderungen der Transmission über einen Zeitraum von mehreren Minuten, wie hier dargestellt –, sollten verworfen werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Raman- und Fluoreszenzspektroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Natur des eingefangenen Nanopartikels nach seiner Entwicklung zu beantworten.

Diese Technik hat es Forschern ermöglicht, biologisch relevante Nanopartikel auf Ebene einzelner Moleküle zu untersuchen. Beispielsweise, um Proteinbindung zu detektieren und Virusinfektionen jeweils auf Ebene einzelner Moleküle zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Doppel-NGO-Optikfalle in ein Invertmikroskop-Laser-T-System integriert, um einzelne Nanopartikel einzufangen.