Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Krebs Fibroblasten (CAF) zu erleichtern Tumorinitiation, Wachstum und die Progression durch signalisiert, dass es fördert die Proliferation, Angiogenese und Entzündung. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um reine Populationen normalen Fibroblasten und CAF aus frischen Maus und menschlichen Geweben isolieren durch Zellsortierung unter Verwendung PDGFRα als Oberflächen-Marker.

Ziel dieses Verfahrens ist es, normale und krebsassoziierte Fibroblasten aus frischem Gewebe zu isolieren. Dazu werden zunächst die Brustdrüsen präpariert. Der zweite Schritt besteht darin, Brustdrüsen, Einzelzellsuspensionen, die nächste Zelle, die mit Fibroblasten aufrechterhalten wird, spezifische Antikörper sowie Antikörper, die für andere Zellpopulationen spezifisch sind, vorzubereiten.

Der letzte Schritt besteht darin, eine fluoreszenzaktivierte Zellbeschaffung oder Fakten durchzuführen. Letztendlich wird die Q-R-T-P-C-R-Expressionsprofilierung spezifischer Marker, die in den sortierten Zellpopulationen exprimiert werden, verwendet, um die Reinheit der sortierten Zellpopulationen zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Isolierung von Fibroblasten besteht darin, dass sie die Isolierung der Mehrheit der Gewebefibroblasten mit minimaler Kontamination durch Immunzellen oder Epithelzellen ermöglicht, während ein Gewebekulturschritt vermieden wird, der das Genexpressionsprofil der Fibroblasten verändern könnte.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf alle Brustkrebstherapien, da das Verständnis und die Identifizierung molekularer Ziele einen neuartigen Combinator-Ansatz zur Bekämpfung des Fortschreitens von Brustkrebs bieten können, das Überleben der Patientinnen verlängern und letztendlich dazu beitragen können, individualisierte Therapieoptionen zu verbessern und anzupassen. Neben Ihrem Auge wird Dr. Lena allein, der Laborleiter, das Verfahren demonstrieren, um mit diesem Verfahren zu beginnen. Legen Sie die euthanasierte weibliche Maus auf den Rücken auf eine Styroporoberfläche und stecken Sie mit 25-Gauge-Nadeln alle vier Gliedmaßen fest fest.

Besprühen Sie die Maus großzügig mit 70% Ethanol mit einer Pinzette. Ziehen Sie die Bauchhaut an der Mittellinie nach oben und machen Sie mit einer scharfen Schere einen kleinen Schnitt, beginnend mit dem Schnitt. Schneiden Sie die Haut bis zum Hals des Tieres ab und vermeiden Sie dabei eine Punktion der Bauchhöhle.

Schneiden Sie die Haut an den Hinterbeinen vom Mittellinienschnitt zum Bein hin ab, was zu einer Y-Form führt. Ziehen Sie als Nächstes die Haut vom Mauskörper weg und legen Sie die Brustdrüsen frei, die an der Unterseite der Haut befestigt sind. Eines der problematischsten Dinge bei diesem Verfahren ist die Vermeidung der Entnahme von Muskelgewebe.

Um dieses Problem zu vermeiden, werde ich nur die vierte und fünfte Brustdrüse nehmen und nicht die zweite, die sich in unmittelbarer Nähe des Muskelgewebes befindet. Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Gedächtnisdrüse vorsichtig von der Haut zu trennen, während Sie das Bindegewebe mit einer kleinen, scharfen Schere schneiden, um die Gedächtnisdrüse in Richtung der Wirbelsäule der Maus zu trennen, und entfernen Sie alle gefundenen nekrotischen Regionen. Platzieren Sie die präparierten Gedächtnisdrüsen in PBS auf Eis.

Der einfachste Weg, Hautgewebe zu gewinnen, ohne sich mit der Haarentfernung befassen zu müssen, ist die Verwendung von Mausohren. Schneide mit einer scharfen Schere beide Ohren von der euthanasierten Maus ab. Legen Sie die Ohren sofort in ein Verdauungsglas mit einer kleinen Menge PBS auf Eis.

Zur Herstellung einer einzelligen Suspension der Brustdrüse werden die Brustdrüsen mit einer gebogenen Schere gründlich in einem Verdauungsgefäß mit einem kleinen Volumen PBS auf Eis zerkleinert, und 20 Milliliter Kollagenaselösung zum Hackgewebe gegeben. Diese Menge an Kollagenaselösung dissoziiert effizient etwa fünf Gramm Gedächtnis- oder Tumorgewebe und Ohren von bis zu 15 Mäusen. Sofort auf eine Rührplatte in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad legen und 15 Minuten lang unter mittlerem Rühren inkubieren, um die Reaktion bei 30 Millilitern kaltem DMEM plus 10 % FCS zu stoppen.

Als nächstes passieren Sie das Gewebe- und Mediengemisch durch ein 70-Mikron-Zellsieb, das auf ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gelegt wird. Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen fünf Minuten lang bei 450 mal G bei vier Grad Celsius. Wenn die Mäuse vor der Tötung nicht mit PBS durchblutet wurden, müssen die roten Blutkörperchen in der Probe vor der Immunfärbung Lügen sein.

Zellen müssen vor der Markierung von Fibroblasten und anderen Zellpopulationen für endogene FC blockiert werden. Resus suspendieren Sie die Zellen in einem bis drei Milliliter Faxpuffer und fügen Sie dann den FC-Block mit einer Verdünnung von 1 bis 50 hinzu und inkubieren Sie 10 bis 20 Minuten lang auf Eis. Es ist nicht erforderlich, die 100-Mikroliter-Zellaliquote des FC-Blocktransfers abzuwaschen, um Orph-Röhrchen zu eendieren, die als ungefärbte Kontrolle und einfarbige Kontrollen verwendet werden sollen.

Abhängig von der Anzahl der fluoreszierenden Antikörper, die in dieser Demonstration verwendet werden, werden zwei fluoreszierende Antikörper verwendet, um Fibroblasten am Anti-PDGF-Rezeptor alpha zu markieren. Das wird direkt an ein Fluor in einer Verdünnung von eins bis 50 an die Sortierprobe konjugiert, ebenso wie die einfarbigen Kontrollen, um andere Zellpopulationen zu markieren. Geben Sie die entsprechenden fluoreszierend konjugierten Antikörper ebenfalls in einer Verdünnung von 1 bis 50 zu Oberflächenmarkern.

Die Zugabe von Antikörpern auch zu geeigneten einfarbigen Kontrollröhrchen, einschließlich Antikörpern für Immunzellen und Epithelzellen, wird empfohlen, um doppelt positive Populationen auszuschließen und somit die Reinheit der isolierten Fibroblasten zu erhöhen. Als nächstes werden die Zellen mit Antikörpern eine Stunde lang auf Eis im Dunkeln inkubiert, nach einer Stunde werden die Zellen gewaschen, indem die Röhrchen mit Faxpuffer eins gefüllt und fünf Minuten lang bei 450 μG bei vier Grad Celsius gedreht werden, wobei die Zellen im Faxpuffer eins auf eine Konzentration gebeugt werden, die für die Sortierung mit dem zu verwendenden Faxsortierer am besten geeignet ist. Übertragen Sie markierte Zellen in Faxröhren mit Filterdeckeln und Filterzellen in die Röhren, um Zellklumpen zu verhindern, Klumpen, um abgestorbene Zellen auszuschließen.

Ein DPI-Wert für alle Proben mit Ausnahme des nicht gefärbten Steuerelements. Bewahren Sie die Proben während der Faxanalyse auf Eis auf. Um dieses Verfahren zu starten, verwenden Sie die Faktensortiersoftware, um die Fluoreszenzeinstellung, die Erfassungseinstellung und die hydrodynamische Tropfeneinstellung vorzubereiten.

Jede Probe wird kurz vortext, um die Zellen zu resuspendieren, bevor sie in den Zellsortierer geladen wird. Beginnen Sie mit der Analyse der ungefärbten Probe, um das Gating für die gesamte Zellpopulation einzustellen, um Zelltrümmer auszuschleusen und die Autofluoreszenz oder Hintergrundfärbung zu bestimmen. Analysieren Sie als Nächstes die ungefärbte Probe plus DPI, um die Population lebender Zellen von der Gesamtzellpopulation zu bestimmen und zu koppeln.

Analysieren Sie jede einzelne Farbsteuerung, um Parameter wie die Kompensation zu ermitteln und zu kalibrieren. Analysieren Sie die Fleckenprobe, um die Position der Anschnitte für die Sortierung zu bestimmen. Sobald die Parameter und Gates für die gewünschten Zellpopulationen eingestellt sind, beginnen Sie mit der Sortierung der markierten Zellpopulationen in Eph-Röhrchen oder konische 15-Milliliter-Röhrchen, die Kulturmedium oder RNA-Lysepuffer enthalten.

Unmittelbar nach Abschluss der Sortierung werden die Zellen heruntergeschleudert und in frisches Medium oder RNA-Lysepuffer überführt. Abhängig vom Zweck Ihres Experiments sollen Fibroblasten, wenn sie sortiert sind, immer auf kollagenbeschichteten Platten und niemals direkt auf Kunststoff kultiviert werden, da dies zu einer Aktivierung der Fibroblasten führt, die zu Veränderungen in ihrer Genexpression führt. Die Verwendung des PDGF-Rezeptors alpha als Marker für Fibroblasten führt zur Isolierung hochangereicherter Populationen von Gewebefibroblasten.

In diesem Beispiel wurden einzellige Suspensionen von Maus-Brustdrüsen mit PDGF-Rezeptor-alpha- und F-4-80-Antikörpern gefärbt. Das Diagramm der Faktensortierung ist im linken Feld dargestellt, wobei P zwei das Fibroblasten-Gate und P vier das Makrophagen-Gate ist. Eine Post-Source-Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der sortierten Fibroblasten im rechten Feld und der Makrophagen im mittleren Bild zu bestimmen.

Die nächste Abbildung zeigt eine Analyse der Beschaffungsreinheit von zellspezifischen Kontrollgenen für Fibroblasten, Immunzellen und Epithelzellen durch Q-R-T-P-C-R. Die Ergebnisse wurden auf zwei Housekeeping-Gene, ga, DH und mgus, und die relative Expression zur Lücke normalisiert. Es wird gezeigt, dass solche Analysen typischerweise eine Kontamination von 0,1 bis 0,6 % aufweisen.

Dieser Reinheitsgrad ermöglicht eine qualitativ hochwertige Transkriptomprofilierung isolierter Fibroblasten. Die Quantifizierung der PDGF-Rezeptor-alpha-Expression in einer unsortierten Population von Mamma-Fibroblasten deutet darauf hin, dass etwa 85% der gesamten Gewebefibroblasten in den Brustdrüsen PDGF-Rezeptor-alpha-positiv sind. Ich isolierte mich.

Fibroblasten können direkt nach der Sortierung kultiviert werden, es kann jedoch einige Tage dauern, bis sie sich erholt haben. Es ist wichtig, alle weiteren Experimente mit niedrigen Massagezellen durchzuführen, da die primären Fibroblasten während der Vermehrung eine Seneszenz durchlaufen. In der Kultur kann diese Technik, wenn sie einmal gemeistert ist, in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn die dritten Zellen für die Kultivierung bestimmt sind, werden sie importiert, um daran zu denken, dass alle Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen. Bei diesem Shooting haben wir keine sterile Sortierung durchgeführt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hochangereicherte Populationen von Fibroblasten aus frischem Gewebe isoliert