Name: Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Erfahren Sie die Isolation von normalen und krebsassoziierten Fibroblasten aus frischem Gewebe mittels FACS. Diese Methode minimiert Kontaminationen und bewahrt das Genexpressionsprofil für präzise Krebsforschung.

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Wir danken Dr. Yitzchak Oschry und Dr. Orit Sagi-Asif für ihre Hilfe bei FACS-Sortierung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien an NE von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung n unterstützt ° [276890], aus dem Israel Cancer Association (# 20110078), und aus dem Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).

Ein. Sezieren Mammary oder Skin Gewebe von Mäusen <ol><li> Vor der Zerlegung des gewünschten Gewebe von Mäusen, bereiten Sie die folgenden Lieferungen und Reagenzien: Supplies: <ul><li> Chirurgische Werkzeuge (gewaschen mit Reinigungsmittel getaucht und dann in 70% Ethanol). </li><li> Styropor Oberfläche mit der Maus auf beim Präparieren ruhen. </li><li> Pins oder Nadeln an Mäusen während der Präparation zu halten. </li><li> Glas mit Deckel für die Verdauung, mit Magnetrührstab (autoklaviert). </li><li> Wasserbad bei 37 ° C, mit einer Tauchpumpe Magnetrührer und genug Wasser zu tauchen die Verdauung jar, während es auf der Rührplatte. </li></ul> Reagenzien: <ul><li> FACS-Puffer I: (4 ° C): Dulbeccos Phosphat-gepufferte Saline CMF (Calcium Magnesium Gratis) + 0,5% BSA </li><li> Collagenase Lösung (aus unmittelbar vor der Verwendung): 0,05 g Collagenase II 0,05 g Kollagenase IV 0,01 g Deoxyribonucpachten 20 ml FACS-Puffer I. Halten Kollagenaselösung auf Eis bis zum Gebrauch. </li><li> PharmLyse (Ammoniumchlorid Lysereagenz). </li><li> FACS-Puffer II: Dulbeccos Phosphat-gepufferte Saline CMF + 1% FCS. </li></ul></li><li> Dissection der Brustdrüsen (siehe auch 17). <ul><li> Einschläfern weiblichen Mäusen unter Verwendung von Kohlendioxid (CO 2) Einatmen. </li><li> Auf einem Styropor-Oberfläche, platzieren Sie den Mauszeiger auf den Rücken und Pin fest alle vier Gliedmaßen mit 25-Gauge-Nadeln (Abbildung 1A). Sprühen Sie die Maus großzügig mit 70% Ethanol. </li><li> Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Bauchhaut an der Mittellinie und machen einen kleinen Schnitt mit einer scharfen Schere. </li><li> Ausgehend von dem Einschnitt, schneiden die Haut bis zum Hals des Tieres unter Vermeidung Punktieren der Bauch-oder Brusthöhle. </li><li> Schneiden die Haut an den hinteren Beinen von der Mittellinie Einschnitt in Richtung der Schenkel, was zu einer &quot;Y-förmig&quot;. </li><li> Ziehen Sie die Haut vom mouse Körper und festzunageln, Freilegung der Milchdrüsen an der Unterseite der Haut (Abbildung 1B). </li><li> Mit Q-Tips vorsichtig trennen Milchdrüsen von der Haut während des Schneidens Bindegewebe mit kleinen scharfen Schere die Brustdrüse Richtung Wirbelsäule der Maus trennen. </li><li> Die Bauch-Drüsen (# 4, 5) sind am besten für dieses Protokoll. Sie können auch die 2. Brustdrüse, aber bedenken Sie, dass diese Drüsen anatomisch sind in unmittelbarer Nähe zu dem Brustmuskel, die nur schwer zu trennen kann, was in den Zellen des gemischten Gewebe Ursprungs befindet. </li><li> Hinweis: Wenn Sezieren Tumorgewebe, empfiehlt es sich, nekrotische Bereiche zu entfernen. </li></ul></li><li> Dissection des Hautgewebes: Der einfachste Weg, um das Hautgewebe zu erhalten, ohne sich mit Haarentfernung umzugehen ist, Mäuseohren verwenden. Wenn eine größere Menge des Gewebes erforderlich ist, können Sie rasieren Haare von der Maus Oberkörper und sezieren Haut. <ul><li> Einschläfern Mäusen usingen CO 2-Inhalation. </li><li> Mit einer scharfen Schere, schneiden Sie beide Ohren und unmittelbar bei der Verdauung Gefäß mit einem kleinen Volumen (~ 0,5 ml) PBS auf Eis. </li></ul></li></ol> 2. Vorbereitung der Brustdrüse / Haut Single Cell Suspension <ul><li> Zeigen Brustdrüsen / Haut Verdauung Gefäß mit einem kleinen Volumen von PBS auf Eis. Wenn Gewebe blutige Wäsche x2 mit PBS und dann entsorgen überschüssiges PBS. </li><li> Hackfleisch gründlich mit gebogenen Schere. </li><li> 20 ml Kollagenase-Lösung (Anmerkung: diese Menge an Kollagenase-Lösung effizient distanzieren ca. 5 g von Mamma-oder Tumorgewebe und Ohren von bis zu 15 Mäuse). </li><li> Zeigen sofort auf Rührplatte in 37 ° C Wasserbad und inkubieren für 15 min unter Rühren bei mittlerer Geschwindigkeit. </li></ul> Hinweis: optimale Inkubationszeiten kann variieren, wenn verdauen anderen Geweben. <ul><li> Um die Reaktion zu stoppen, fügen Sie 30 ml kaltem DMEM + 10% FCS. </li><li> Der Stamm der Gewebe / Medien Gemisch durch ein 70 um Zellsieb auf einem 50 ml konischen Röhrchen gegeben. </li><li> Zentrifugieren konischen Röhrchen 5 min bei 450 × g bei 4 ° C. </li></ul> 3. Red Blood Cells Lysis Hinweis: Dieser Schritt ist nicht erforderlich, wenn Mäuse wurden mit PBS Herz perfundiert, bevor sie getötet wurden. <ul><li> Überstand unter Verwendung einer Glaspipette, die an Vakuum, ohne das Zellpellet. </li><li> Um RBC, Zellpellet in 10 ml PharmLyse Lösung, Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur lysiert. </li><li> Neutralisieren die PharmLyse Lösung durch Zugabe von ca. 40 ml FACS-Puffer I. </li><li> Spin der konischen Rohrs mit Zellen für 5 min bei 450 × g bei 4 ° C. </li><li> Überstand </li></ul> 4. Blockierung der endogenen Fc <ul><li> Optional: Zählen von Zellen auf eine angemessene Lautstärke für folgende ste bestimmenps. </li><li> Die Zellen in 1-3 ml FACS-Puffer I (je nach Zellzahl und Menge des Antikörpers die Sie verwenden möchten). </li><li> Fügen FcBlock (anti-Maus CD16/CD32) bis 1:50 Verdünnung (10 ug / ml) zu erreichen, und auf Eis inkubieren für 10-20 &quot;. Keine Notwendigkeit zu waschen FcBlock. </li></ul> 5. Färbung <ul><li> Nehmen Sie 100 ul Aliquots in Eppendorf-Röhrchen als un-gefärbten Steuerung und einfarbig Kontrollen (nach der Anzahl der fluoreszierenden Antikörpern verwendet wird) verwendet werden. </li><li> Um Label Fibroblasten: add anti-PDGFRα (direkt konjugiert Fluorophor) zu einer Verdünnung von 1:50 (10 ug / ml). </li><li> Um andere Zellpopulationen (zB Immunzellen, Makrophagen, Endothelzellen, etc.) bezeichnen: in geeignete fluoreszenzmarkierte konjugierten Antikörpern gegen Oberflächen-Marker, einer 1:50-Verdünnung. </li></ul> Anmerkung: Obwohl PDGFRα ist eine robuste Marker für Fibroblasten, ist es empfehlenswert, für i Antikörper umfassenmmune Zellen und für Epithelzellen, um etwaige doppelte positive Populationen auszuschließen und somit Verbesserung der Reinheit der isolierten Fibroblasten. <ul><li> Add 2 ul jedes Antikörpers zu jeder der einzelnen Farbregelung Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Inkubieren von Zellen mit Antikörpern für 1 Stunde auf Eis im Dunkeln. </li><li> Zum Waschen: Füllen Rohre mit FACS-Puffer I und Spin für 5 min bei 450 xg bei 4 ° C. </li><li> Absaugen des Überstandes, resuspendieren Zellen in FACS Puffer I bis zu einer Konzentration von etwa 2 x 10 6 Zellen / ml, oder welche Konzentration am besten geeignete für die Sortierung mit den verfügbaren FACS Sorter. </li></ul> Optional: Die Zellen können in FACS-Puffer II für die Dauer von Sortier resuspendiert werden. Dies kann die Lebensfähigkeit der Zellen. Jedoch kann die Exposition gegenüber Faktoren in Serum einen Effekt Genexpression, die getestet werden soll und berücksichtigt. <ul><li> Übertragen markierten Zellen in FACS-Röhrchen mit Filter oben: Filter Zellen in den Rohrenverhindern Zellklumpen. </li><li> Um tote Zellen auszuschließen, fügen 7AAD (0,5 ug / ml) oder Propidiumiodid (PI) zu Proben (mit Ausnahme der un-gefärbten Steuerung). </li></ul> Hinweis: Um zu vermeiden, verschwenden Zellen, können Sie 7AAD/PI der un-gefärbten Probe hinzufügen, nachdem die Aufnahme in den FACS, und verwenden Sie wieder als 7AAD nur Kontrolle. <ul><li> Die Proben auf Eis während der Analyse. </li></ul> 6. Isolierung von Zellen durch FACS (Hinweis: dieser Teil des Protokolls erfordert Vorkenntnisse in Betrieb einer FACS-Sorter, zB BD FACS AriaII oder die Hilfe von einem Fachmann). <ul><li> Mit dem FACS Sorter Software (BD FACSDiva), bereiten entsprechende Analysen Plots Vorwärtsstreuung (FSC), seitliche Streulicht (SSC), 7AAD, FITC, PE und andere Fluorophor zur Kennzeichnung Zellen (Abbildung 2) zu analysieren. </li><li> Vor dem Laden jeder Probe in die Zelle Sorter, kurz vortexen zu resuspendieren Zellen. </li><li> Beginnen Sie, indem analyzIng. den ungefärbten Probe, um das Gating der gesamten Zellpopulation gesetzt, um Gate aus Zelltrümmern und um Autofluoreszenz oder Hintergrundfärbung zu bestimmen. </li><li> Analysieren ungefärbten Probe + 7AAD zu bestimmen, und Gate die Population lebender Zellen aus der gesamten Zellpopulation. </li><li> Analysieren Sie jede einzelne Farbe Kontrolle zu bestimmen und zu kalibrieren Parameter wie Entschädigung. </li><li> Analysieren der gefärbten Probe, um die Position von Gattern zum Sortieren definieren. </li><li> Sobald Parameter und Toren für die gewünschten Zellpopulationen gesetzt wurden, beginnen Sortieren der markierten Zellpopulationen in Eppendorf-Röhrchen oder 15 ml konischen Röhrchen mit Kulturmedium oder RNA Lysepuffer (wie RLT-Puffer oder Trizol). </li></ul> Anmerkung: Wenn das Sortieren einer großen Anzahl von Zellen, wird es nicht empfohlen, um direkt zu sortieren in RNA Lysepuffer, wie das große Volumen von Hüllfluid begleitende die Zellen des Lysepuffers verdünnen und die Ausbeute reduzieren. <ul><li> Spin Zellen nach unten unmittelbar nach Sortierung ist abgeschlossen, und die Übertragung in frisches Medium oder RNA Lysepuffer, je nach Zweck des Experiments. </li><li> Wenn Sortieranlagen, um Kultur isolierten Zellen, führen sterile sort. Zur besseren Gewinnung von Zellen, benutzt Phenolrot-freiem DMEM + 5% FCS anstatt FACS-Puffer II und sammeln Zellen in Kulturmedium mit 20% FKS. </li><li> Wenn Kultivierung von Fibroblasten sortiert, auf Kollagen beschichteten Platten alwaysplate und nie direkt auf Kunststoff, da dies zu einer Aktivierung von Fibroblasten führt zu Veränderungen in ihrer Genexpression. </li></ul>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Während Versuche in Zellkultur durchgeführt kann informativ und schlagen Funktionsprinzipien, die in vivo nachgewiesen werden kann, ist es bekannt, dass große Veränderungen in der Genexpression von Zellen in Kultur 11,12. Um eine Gewebekultur Schritt vermeiden beim Profilieren Genexpression in Fibroblasten, entwickelten wir ein Protokoll, das Isolierung von normalen, sowie Krebs assoziierten Fibroblasten aus frischen Maus oder menschlichen Gewebe. Ermöglicht Dieses Protokoll wurde erfolgreich mit der...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Name des Reagenz</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Kommentare (optional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 41965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt; Biological Industries</td&gt;<td&gt; 02-023-1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Collagenase II</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IV Collagenase</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoxyribonuclease</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cell Sieb 70 um</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Purified anti-Maus CD16/CD32</td&gt;<td&gt; BD Pharmingen</td&gt;<td&gt; 553142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Via Sonde (7AAD)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Maus-CD140a-PE (PDGFRA)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Maus-F4/80- FITC</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM w / o Phenolrot</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 31053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kollagen Typ I</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 354236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

isolation von normal und krebs-assoziierte fibroblasten von fresh gewebe durch fluorescence activated cell sorting (facs)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Krebs-assoziierte Fibroblasten (CAF) sind die bekanntesten Zelltyp innerhalb des Tumorstroma vieler Krebsarten, insbesondere Mammakarzinomen, und ihre höchste Präsenz wird oft mit einer schlechten Prognose assoziiert 1,2. CAF sind aktiviert Subpopulation von Stromafibroblasten, Ausdruck von denen viele die Myofibroblasten Marker α-SMA 3. CAF stammen vom lokalen Gewebe Fibroblasten sowie aus Knochenmark stammende Zellen rekrutiert in die sich entwickelnde Tumoren und Annahme eines CAF Phänotyp unter dem Einfluß des Tumormikroumgebung 4. CAF wurde gezeigt, dass Tumorinitiation, Wachstum und die Progression durch signalisiert, dass fördert die Proliferation von Tumorzellen, die Angiogenese und Invasion 5-8 erleichtern. Wir haben gezeigt, dass CAF Tumorwachstum verstärken durch Vermittlung tumorpromovierenden Entzündungen, ab den frühesten präneoplastische Stufen 9. Trotz der zunehmenden Nachweis der Schlüsselrolle CAF spielen bei der Förderung des Tumorwachstums,Studium CAF wurde ein fortlaufender Herausforderung aufgrund der mangelnden CAF-spezifische Marker und die überwiegende Heterogenität dieser Zellen, mit vielen Subtypen koexistierenden im Tumormikromilieu 10. Außerdem prüft Fibroblasten in vitro durch die Tatsache, dass ihre Genexpressionsprofils oft in Gewebekultur 11,12 verändert behindert. Um dieses Problem anzugehen und unvoreingenommene Genexpressionsanalysen von Fibroblasten aus frischen Maus und menschlichen Geweben zu ermöglichen, entwickelten wir ein Verfahren bei früheren Protokollen für Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) 13,14 basieren. Unser Ansatz beruht auf der Nutzung PDGFRα als Oberflächenmarker zu Fibroblasten aus frischen Maus und menschlichem Gewebe zu isolieren. PDGFRα ist reichlich von beiden normalen Fibroblasten und CAF 9,15 ausgedrückt. Diese Methode erlaubt die Isolierung von reinem Populationen von normalen Fibroblasten und CAF, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt α-SMA + aktiviert Myofibroblasten. Isolierte Fibroblasten können dannverwendet für die Charakterisierung und Vergleich der Entwicklung der Genexpression, die in der Tumorgenese CAF auftritt. Tatsächlich berichteten wir und andere Expression Profiling von Fibroblasten durch Zellsortierung 16 isoliert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich durchgeführt zu isolieren und zu profilieren hochangereichertes Populationen von Fibroblasten aus der Haut, Brust-, Pankreas-und Lungengewebe. Außerdem unserer Methode können auch Kultivieren von sortierten Zellen, um funktionelle Experimente durchzuführen und um die Kontamination durch Tumorzellen, die oft eine große Hürde beim Versuch Kultur CAF vermeiden.

Verwendung PDGFRα als Marker für Fibroblasten führt Isolierung von hochangereicherten Populationen von Gewebe Fibroblasten. Der Reinheitsgrad nach der Sortierung betrug 99%, wie durch post-sort-Analyse (2A) quantifiziert. Schätzen der Prozentsatz der nicht-kontaminierenden Fibroblastenzellen durch die relative Expression von zellspezifischen Kontrollgene (2B) zeigt typischerweise 0,1-0,6% Verunreinigung. Diese Reinheit ermöglicht hohe Qualität Transkriptom-Profiling von isolierten Fibro...

Krebs Fibroblasten (CAF) zu erleichtern Tumorinitiation, Wachstum und die Progression durch signalisiert, dass es fördert die Proliferation, Angiogenese und Entzündung. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um reine Populationen normalen Fibroblasten und CAF aus frischen Maus und menschlichen Geweben isolieren durch Zellsortierung unter Verwendung PDGFRα als Oberflächen-Marker.

Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) sind der prominenteste Zelltyp innerhalb des Tumorstromas vieler Krebserkrankungen, insbesondere beim Mammakarzinom, und ihre ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, normale und tumorassoziierte Fibroblasten aus frischem Gewebe zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Brustdrüsen disseziert werden. Im zweiten Schritt werden die Brustdrüsen vorbereitet, Suspensionen einzelner Zellen hergestellt und anschließend Zellen mit fibroblastenspezifischen Antikörpern sowie Antikörpern, die spezifisch für andere Zellpopulationen sind, markiert.Der letzte Schritt besteht darin, eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder FACS durchzuführen. Abschließend wird mittels Q-R-T-P-C-R die Expressionsanalyse spezifischer Marker in den sortierten Zellpopulationen durchgeführt, um die Reinheit der sortierten Zellpopulationen zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Fibroblastenisolierung liegt darin, dass sie die Isolierung des Großteils der Gewebe-Fibroblasten mit minimaler Kontamination durch Immunzellen oder epitheliale Zellen ermöglicht und dabei einen Zellkulturschritt vermeidet, der das Genexpressionsprofil der Fibroblasten verändern könnte.Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf alle Therapien des Brustkrebses, da das Verständnis und die Identifizierung mol

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) reichen in Myofibroblasten innerhalb des Tumorstroma, spielen eine wichtige Rolle bei der Vertreibung der Tumorprogression. Wir entwickelten ein coimplantation Tumor xengraft Modell für experimentell erzeugen CAF von der menschlichen Brustdrüse Fibroblasten. Das Protokoll beschreibt, wie CAF Myofibroblasten, dass die Fähigkeit zur Tumorentstehung fördern erwerben zu etablieren.

Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

Das Ziel des Protokolls ist es, lymphatische Endothelzellen menschlicher Lymphmissbildung zystenartige Gefäße und Vorhaut mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert werden. Anschließende Zellkultur und Expansion dieser Zellen ermöglicht eine neue Stufe der experimentellen Raffinesse für genetische, Proteomik, funktionale und Zelldifferenzierung Studien.

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Das Verhalten von Fibroblasten liegt einem Spektrum klinischer Entitäten zugrunde, aber sie bleiben schlecht charakterisiert, hauptsächlich aufgrund ihrer inhärenten Heterogenität. Die traditionelle Fibroblastenforschung beruht auf In-vitro-Manipulation, um das Verhalten von Fibroblasten in vivo zu maskieren. Wir beschreiben ein FACS-basiertes Protokoll für die Isolierung von Hautfibroblasten der Maus, das keine Zellkultur erfordert.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Etablierung von primären Fibroblasten/Myofibroblasten (MF)-Kulturen aus gefrorenen Magen-, kleinen Darm- und Dickdarmgewebe-liefernden Zellen mit einem MF-Phänotyp vorgestellt. Diese Zellen exprimieren CD90, α-SMA und Vimentin. MFs können für eine Vielzahl von funktionellen Assays verwendet werden, einschließlich enzymatischer Aktivität und Zytokinproduktion.

Isolierung von CD 90+ Fibroblasten / Myofibroblasten von Human Gefrorene Magen-Darm-Proben

Dieses Manuskript beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von papillären und Netzfibroblasten von der menschlichen Haut. Sie umgeht in der vitro-Kultur, die mit dem häufig verwendeten Isolationsprotokoll über Explantationskulturen unvermeidlich war. Die ausstrahlenden fibroblasten Untersätze sind funktional unterscheidbar und zeigen eine differenzierte Genexpression und Lokalisierung innerhalb der Dermis.

Isolierung von papillären und retikulären Fibroblasten aus der menschlichen Haut durch Fluoreszone-aktivierte Zellsortierung

Wir präsentieren ein Protokoll, um primäre erwachsene Fibroblasten auf einfache, schnelle und zuverlässige Weise zu isolieren, die von Anfängern (z. B. Studenten) durchgeführt werden können. Das Verfahren kombiniert enzymatische Gewebeverdauung und mechanische Agitation mit Ultraschallwellen, um primäre Fibroblasten zu erhalten. Das Protokoll kann leicht an spezifische experimentelle Anforderungen (z.B. menschliches Gewebe) angepasst werden.

Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Die Gewinnung einer reinen Population von Fibroblasten ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Rolle bei der Wundreparatur und Fibrose. Beschrieben ist eine detaillierte Methode, um Fibroblasten und Myofibroblasten von unverletzten und verletzten Mausherzen zu isolieren, gefolgt von der Charakterisierung ihrer Reinheit und Funktionalität durch Immunfluoreszenz, RTPCR, Fluoreszenz-unterstützte Zellsortierung und Kollagen-Gel-Kontraktion.

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Diese Arbeit zielt darauf ab, ein Protokoll für die Isolierung und Kultur von primären krebsassoziierten Fibroblasten aus einem syngenen murinen Modell von dreifach negativem Brustkrebs und deren Anwendung für die präklinische Untersuchung neuartiger Nanopartikel bereitzustellen, die auf die Tumormikroumgebung abzielen.

Isolierung primärer krebsseziensässiger Fibroblasten aus einem syngenen murinen Modell von Brustkrebs zur Untersuchung gezielter Nanopartikel

Die genaue Identifizierung von fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) und Muskelstammzellen (MuSCs) ist entscheidend für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Isolierung, Reinigung und Kultur von FAPs und MuSCs aus erwachsenen Mausmuskeln.

FACS-Isolierung und Kultur von fibro-adipogene Vorläuferzellen und Muskelstammzellen aus ungestörten und verletzten Maus-Skelettmuskeln

Multizelluläre 3D-Tumorsphäroide wurden mit Lungenadenokarzinomzellen, Fibroblasten und Monozyten hergestellt, gefolgt von der Isolierung von Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) aus diesen Sphäroiden. Isolierte CAFs wurden mit normalen Fibroblasten verglichen, um die mitochondriale Gesundheit zu beurteilen, indem das mitochondriale Transmembranpotential, reaktive Sauerstoffspezies und enzymatische Aktivitäten untersucht wurden.

Bewertung der mitochondrialen Gesundheit in krebsassoziierten Fibroblasten, die aus 3D-multizellulären Lungentumor-Sphäroiden isoliert wurden

Dieses Protokoll bietet ein umfassendes Verfahren zur Isolierung, Expansion und Immortalisierung von Fibroblasten aus radikalen Prostatektomien. Darüber hinaus werden Assays beschrieben, die entwickelt wurden, um die funktionellen Effekte des Fibroblasten-Tumorzell-Crosstalks zu bewerten, wobei sowohl die Behandlung mit konditioniertem Medium als auch die Co-Kultivierung genutzt werden.

Isolierung, Kultur und Charakterisierung von Prostatakrebs-assoziierten Fibroblasten

Erfahren Sie die Isolation von normalen und krebsassoziierten Fibroblasten aus frischem Gewebe mittels FACS. Diese Methode minimiert Kontaminationen und bewahrt das Genexpressionsprofil für präzise Krebsforschung.

Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

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