Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, normale und tumorassoziierte Fibroblasten aus frischem Gewebe zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Brustdrüsen disseziert werden. Im zweiten Schritt werden die Brustdrüsen vorbereitet, Suspensionen einzelner Zellen hergestellt und anschließend Zellen mit fibroblastenspezifischen Antikörpern sowie Antikörpern, die spezifisch für andere Zellpopulationen sind, markiert.

Der letzte Schritt besteht darin, eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder FACS durchzuführen. Abschließend wird mittels Q-R-T-P-C-R die Expressionsanalyse spezifischer Marker in den sortierten Zellpopulationen durchgeführt, um die Reinheit der sortierten Zellpopulationen zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Fibroblastenisolierung liegt darin, dass sie die Isolierung des Großteils der Gewebe-Fibroblasten mit minimaler Kontamination durch Immunzellen oder epitheliale Zellen ermöglicht und dabei einen Zellkulturschritt vermeidet, der das Genexpressionsprofil der Fibroblasten verändern könnte.

Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf alle Therapien des Brustkrebses, da das Verständnis und die Identifizierung molekularer Zielstrukturen einen neuartigen kombinatorischen Ansatz zur Bekämpfung der Brustkrebsprogression bieten, das Überleben der Patientinnen verlängern und letztendlich dazu beitragen können, individualisierte therapeutische Optionen zu verbessern und anzupassen. Zusätzlich zu Ihrem Auge wird allein Dr. Lena, die Laborleiterin, die Durchführung des Verfahrens demonstrieren. Um mit dem Verfahren zu beginnen, legen Sie die euthanasierte weibliche Maus auf den Rücken auf eine Styroporoberfläche und befestigen Sie alle vier Gliedmaßen mit 25-Gauge-Nadeln fest.

Besprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol unter Verwendung einer Pinzette großzügig. Heben Sie die Bauchhaut entlang der Mittellinie an und führen Sie mit einer scharfen Schere einen kleinen Schnitt beginnend an der Einstichstelle durch. Schneiden Sie die Haut bis zum Hals des Tieres auf, wobei Sie vermeiden, die Bauch- und Brusthöhlen zu verletzen.

Schneiden Sie die Haut an den Hinterbeinen vom mittigen Einschnitt in Richtung Bein, sodass sich eine Y-Form ergibt. Ziehen Sie danach die Haut vom Körper der Maus ab und fixieren Sie sie, um die an der Unterseite der Haut befestigten Brustdrüsen freizulegen. Eines der größten Probleme bei diesem Vorgang besteht darin, Muskelgewebe zu vermeiden.

Um dieses Problem zu vermeiden, entnehme ich nur die vierte und fünfte Milchdrüse und nicht die zweite, die in unmittelbarer Nähe zum Muskelgewebe liegt. Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Milchdrüse vorsichtig von der Haut zu lösen, während Sie das Bindegewebe mit einer kleinen, scharfen Schere durchtrennen, um die Milchdrüse in Richtung Wirbelsäule der Maus zu lösen, und entfernen Sie alle vorhandenen nekrotischen Bereiche. Legen Sie die präparierten Milchdrüsen in PBS auf Eis.

Die einfachste Möglichkeit, Hautgewebe zu gewinnen, ohne sich mit der Enthaarung befassen zu müssen, ist die Verwendung von Mauseohren. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere beide Ohren von der euthanasierten Maus ab. Legen Sie die Ohren unverzüglich in ein Verdauungsgefäß, das eine kleine Menge PBS auf Eis enthält.

Um eine Einzelzell-Suspension aus der Mammapapille herzustellen, die Brustdrüsen mit einer gebogenen Schere gründlich in einem Verdauungsgefäß, das eine kleine Menge PBS auf Eis enthält, zerkleinern, anschließend 20 Milliliter Kollagenase-Lösung zum zerkleinerten Gewebe hinzufügen. Diese Menge an Kollagenase-Lösung löst effizient etwa fünf Gramm Brust- oder Tumorgewebe sowie Ohren von bis zu 15 Mäusen auf. Sofort auf ein Rührgerät in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad stellen und 15 Minuten lang unter mittlerer Rührgeschwindigkeit inkubieren, um die Reaktion mit 30 Milliliter kaltem DMEM plus 10 % FCS zu stoppen.

Anschließend filtrieren Sie die Gewebe-Medium-Mischung durch einen 70-Mikron-Zellsieb, der auf einem 50-Milliliter-Konischgefäß platziert ist. Zentrifugieren Sie das Konischgefäß fünf Minuten bei 450 ×g und 4 °C. Falls die Mäuse vor der Tötung nicht über das Herz mit PBS perfundiert wurden, müssen die roten Blutkörperchen in der Probe lysiert werden, bevor die Immunfärbung erfolgt.

Die Zellen müssen vor der Markierung von Fibroblasten und anderen Zellpopulationen für endogenes FC blockiert werden. Resuspendieren Sie die Zellen in ein bis drei Milliliter Fax-Puffer 1 und geben Sie dann FC-Block in einer Verdünnung von 1:50 hinzu. Inkubieren Sie 10 bis 20 Minuten auf Eis. Es ist nicht notwendig, den FC-Block abzuwaschen. Überführen Sie 100 Mikroliter Zellaliquote in Eppendorf-Röhrchen, die als unbehandelte Kontrolle und Einzelfarbenkontrollen verwendet werden sollen.

Abhängig von der Anzahl der in dieser Demonstration verwendeten fluoreszierenden Antikörper werden zwei fluoreszierende Antikörper verwendet, um Fibroblasten gegen den PDGF-Rezeptor alpha zu markieren. Dieser ist direkt mit einem Fluorophor konjugiert und wird im Verhältnis 1:50 zum Sortierprobenmaterial sowie zu den Einzelfarben-Kontrollen gegeben, um andere Zellpopulationen zu markieren. Fügen Sie die entsprechenden fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen Oberflächenmarker ebenfalls im Verdünnungsverhältnis 1:50 hinzu.

Fügen Sie Antikörper auch zu geeigneten Einzelfarben-Kontrollröhren hinzu; es wird empfohlen, Antikörper für Immunzellen und epitheliale Zellen einzuschließen, um doppelt positive Populationen auszuschließen und somit die Reinheit der isolierten Fibroblasten zu erhöhen. Inkubieren Sie anschließend die Zellen eine Stunde lang auf Eis im Dunkeln mit den Antikörpern. Waschen Sie danach die Zellen, indem Sie die Röhrchen mit Fax-Puffer eins füllen und fünf Minuten bei 450 × g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in Fax-Puffer eins in einer für die Sortierung mit dem verwendeten Fax-Sorter am besten geeigneten Konzentration. Überführen Sie die markierten Zellen in Fax-Röhrchen mit Filterspitzen und filtrieren Sie die Zellen in die Röhrchen, um Zellklumpen zu vermeiden, und schließen Sie tote Zellen aus.

Eine DPI zu allen Proben hinzufügen, mit Ausnahme der unbehandelten Kontrolle. Halten Sie die Proben während der Durchflusszytometrie-Analyse auf Eis. Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie die Sortiersoftware, um die fluoreszierenden Einstellungen, die Erfassungseinstellungen und die hydrodynamischen Tropfeneinstellungen vorzubereiten.

Vortexen Sie jede Probe kurz, um die Zellen vor dem Beladen in den Zellsortierer erneut in Suspension zu bringen. Beginnen Sie mit der Analyse der nicht angefärbten Probe, um das Gating für die Gesamtzellpopulation festzulegen, um Zelltrümmer auszuschließen, und um die Autofluoreszenz oder Hintergrundfärbung zu bestimmen. Analysieren Sie anschließend die nicht angefärbte Probe mit DPI, um die Population lebender Zellen innerhalb der Gesamtzellpopulation zu identifizieren und zu erfassen.

Analysieren Sie jede einzelne Farbkontrolle, um Parameter wie die Kompensation zu bestimmen und zu kalibrieren. Analysieren Sie die Färbeprobe, um die Position der Gates für die Sortierung festzulegen. Sobald die Parameter und Gates für die gewünschten Zellpopulationen eingestellt sind, beginnen Sie mit der Sortierung der markierten Zellpopulationen in eph-Röhrchen oder 15-Milliliter-Konusröhrchen, die Kulturmedium oder RNA-Lysepuffer enthalten.

Unmittelbar nach Beendigung der Sortierung die Zellen abzentrifugieren und in frisches Medium oder RNA-Lysepuffer überführen. Abhängig vom Ziel Ihres Experiments sollten sortierte Fibroblasten, sofern kultiviert werden sollen, stets auf mit Kollagen beschichteten Platten ausplattiert werden, niemals direkt auf Kunststoff, da dies zu einer Aktivierung der Fibroblasten führen würde, die wiederum Veränderungen in ihrer Genexpression nach sich zieht. Die Verwendung des PDGF-Rezeptor-alpha als Marker für Fibroblasten ermöglicht die Isolierung stark angereicherter Populationen von Gewebe-Fibroblasten.

In diesem Beispiel wurden Einzelzellpräparationen von Mausbrustdrüsen mit Antikörpern gegen den PDGF-Rezeptor alpha und F vier 80 gefärbt. Das Darstellungsschema des Sortiervorgangs ist im linken Panel dargestellt, wobei P zwei das Fibroblasten-Tor und P vier das Makrophagen-Tor darstellt. Eine nachgeschaltete Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der sortierten Fibroblasten, die im rechten Panel gezeigt werden, und der im mittleren Panel gezeigten Makrophagen zu bestimmen.

Die nächste Abbildung zeigt eine Analyse der Quellenreinheit mittels Q-R-T-P-C-R von zellspezifischen Kontrollgenen für Fibroblasten, Immunzellen und epitheliale Zellen. Die Ergebnisse wurden auf zwei Housekeeping-Gene, ga, DH und mgus, normalisiert, und die relative Expression bezogen auf gap. DH ist dargestellt; solche Analysen zeigen typischerweise eine Kontamination von 0,1 bis 0,6 %.

Dieser Reinheitsgrad ermöglicht eine qualitativ hochwertige Transkriptom-Profilierung isolierter Fibroblasten. Die Quantifizierung der Expression des PDGF-Rezeptor-alpha in einer nicht sortierten Population von Brustdrüsen-Fibroblasten zeigt, dass etwa 85 % aller Gewebe-Fibroblasten in den Brustdrüsen PDGF-Rezeptor-alpha-positiv sind. Ich isolierte.

Fibroblasten können direkt nach dem Sortieren kultiviert werden, benötigen jedoch möglicherweise einige Tage, um sich zu erholen. Es ist entscheidend, alle weiteren Experimente mit niedriger Passagieranzahl durchzuführen, da primäre Fibroblasten während der Vermehrung in die Seneszenz übergehen. In der Kultur gilt: Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden.

Wenn die geteilten Zellen kultiviert werden sollen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Schritte unter sterilen Bedingungen durchzuführen. In diesem Versuch führten wir keine sterile Sortierung durch. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine stark angereicherte Population von Fibroblasten aus frischem Gewebe isoliert.