Microgavage der Zebrafischlarven

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Substanzen oraal in das Darmlumen von Zebrafischlarven zu verabreichen. Zunächst werden die Larven anästhesiert und auf eine mit Methylcellulose beschichtete Injektionsschablone gelegt. Danach werden die Larven vorsichtig in die Schablone eingetaucht und am Winkel der Magensonde und des Mikromanipulators ausgerichtet.

Dann wird die Nadel in den Mund einer Larve eingeführt und bis zum Darmbläschen vorgeschoben. Sobald die Nadel an der richtigen Stelle ist, wird das Material in das Lumen freigesetzt. Im letzten Schritt wird die Larve aus der Methylcellulose entnommen und in frisches Medium gegeben, um sich von der Anästhesie zu erholen.

Schließlich kann diese Methode verwendet werden, um Materialien gezielt in das Darmlicht von Zebrafischembryonen abzugeben, wo der Transport innerhalb des Darms oder in außerintestinellen Geweben untersucht werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Einweichung in Wasser, das das gewünschte Material enthält, liegt darin, dass die Menge des in das Tier eingebrachten Materials sowie Zeitpunkt und Dosierung streng kontrolliert werden können. Dies verringert die experimentelle Variabilität und in einigen Fällen die mit bestimmten Materialien assoziierte Toxizität.

Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir Schwierigkeiten hatten, bestimmte fluoreszierende Sonden in ausreichend hohen Konzentrationen anzuwenden, um sie mittels Mikroskopie im Darmepithel nachweisen zu können. Hohe Konzentrationen können die Fische manchmal abtöten und dennoch kein ausreichend starkes fluoreszierendes Signal für die Bildgebung liefern. Zunächst ziehen Sie mehrere Magensonde-Nadeln mit einem Mikropipettenzuggerät und leihen Sie sich Kieselsäure-Glaskapillaren aus.

Wechseln Sie zu einem Stereomikroskop, um die Nadeln abzuschneiden. Richten Sie zunächst die Nadelspitze mit dem Ende eines transparenten Lineals oder einer Grafik aus. Verwenden Sie anschließend feine Uhrmacherpinzetten, um die Nadel etwa einen Millimeter von der Spitze entfernt abzuschneiden.

Untersuchen Sie die Nadelspitze mit 100-facher Vergrößerung. Die Nadel sollte einen Durchmesser von etwa 27 bis 30 Mikrometern haben und stumpf sein. Scharfe oder gezackte Nadeln sollten vermieden werden, um konsistentere Ergebnisse zu erzielen.

Eine Mikroschmiede kann verwendet werden, um die Clip-Stelle der Nadel besser zu kontrollieren und die Nadel zu polieren. Spitzen, um scharfe Kanten zu entfernen. Bereiten Sie als Nächstes die Gavagelösung vor.

Für die meisten Anwendungen wird Phenolrot hinzugefügt, um die Visualisierung der Mikroinjektion und die Platzierung der Gavagesuspension zu erleichtern. Nach dem Befüllen mit Mineralöl wird die Gavagenadel an die Nano-Jet-Zwei-Mikroinjektionsanlage montiert. Eine Kunststoff-Petrischale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern wird mit Biofilm umwickelt, um eine flache, wasserdichte Oberfläche bereitzustellen, und etwa zwei Mikroliter der Gavagesuspension werden auf den Parafilm gegeben.

Der nächste Schritt besteht darin, die Gavage-Nadel manuell nachzufüllen. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in das Mineralöl einzubringen. Um das Ausstoßvolumen zu kalibrieren, geben Sie kleine Tröpfchen in eine kleine mit Mineralöl gefüllte Petrischale ab, bis diese gleichmäßig im Durchmesser sind, messen Sie den Durchmesser der Tröpfchen mithilfe der Grafik und berechnen Sie das Tröpfchenvolumen.

Die Konsistenz zwischen den Nadeln wird hier dargestellt. Vor der Verwendung der Nadel für die Gavage entfernen Sie jegliches restliches Mineralöl durch Spülen in sauberem Zebrafisch-Medium. Nach dem Aufwärmen der aros-Form bedecken Sie drei Rillen mit 3 % Methylcellulose. Die Rille sollte gerade genug bedeckt sein, um den Fisch zu halten, aber nicht so wenig, dass die Methylcellulose schnell austrocknet.

Nächste Schritte: Aliquotieren Sie etwa vier Milliliter Zebrafisch-Medium in die Vertiefungen einer sechs-well-Platte und überführen Sie die Zebrafischlarven jeder experimentellen Gruppe in separate Vertiefungen. Um die Fische zu betäuben, bereiten Sie eine dreifache Trica-Lösung im entsprechenden Zebrafisch-Medium vor. Eine Vertiefung pro Zeitpunkt.

Betäuben Sie die Fische, indem Sie eine gleiche Menge Trica-Lösung in das Medium geben und vorsichtig umrühren. Sobald die Fische sich nicht mehr bewegen, verwenden Sie eine breite Pasteurpipette aus Borosilikatglas, um sie einzeln mit dem Kopf im 45-Grad-Winkel der Rille und dem Schwanz im 90-Grad-Winkel der Rille auf die Methylcellulose zu legen. Drücken Sie jedes Larvenexemplar mit einer stumpfen Präparationsnadel vorsichtig in die Methylcellulose, um seine Position zu stabilisieren.

Als Nächstes stellen Sie die Nano-Jet-Zwei-Mikroinjektionsvorrichtung so ein, dass die Nadel in einem flachen Winkel geneigt ist. Stellen Sie sicher, dass der Auslenkbereich ausreicht, um bis unterhalb des Bodens des Wells zu reichen. Um zukünftige Nachjustierungen zu minimieren, stellen Sie die Mikroinjektionseinheit darauf ein, 4,6 Nanoliter im langsamen Injektionsmodus abzugeben. Positionieren Sie eine Hand zur feinen Justierung der Platte mit den immobilisierten Larven und die andere Hand zur Steuerung des Mikromanipulators der Mikroinjektionseinheit.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Zebrafische sehr klein sind und leicht beschädigt werden können. Es erfordert Übung, die ösophageale Struktur unter dem Stereomikroskop zu identifizieren und die geeignete Druckmenge zu bestimmen, die auf die Gavagekanüle ausgeübt werden muss, um das Darmlumen zu erreichen. Zunächst bewegen Sie die Gavagekanüle vorsichtig in den Mund eines anesthetisierten Fisches.

Führen Sie die Sonde durch die Speiseröhre und drücken Sie leicht auf den Speiseröhrenschließmuskel, um die Spitze gerade innerhalb der vorderen Darmwand einzuführen. Sobald die Spitze im vorderen Bulbus angekommen ist, geben Sie das Material vorsichtig unter diesen Einstellungen ab. Das applizierte Volumen sollte den vorderen Darmbulbus gerade füllen, ohne aus der Speiseröhre oder der Kloake auszutreten.

Ziehen Sie die Kanüle schnell und sanft zurück. Achten Sie darauf, keine nennenswerten Mengen an Material in die Speiseröhre freizusetzen. Nach dem Entfernen der Gavagenkanüle überführen Sie den Fisch in eine Schale mit frischem Medium.

Wecken Sie die Larven aus der Anästhesie auf und entfernen Sie die Methylcellulose, indem Sie sie mehrmals in frischem Medium spülen. Überführen Sie die Larven in eine Petrischale oder eine 6-Well-Platte, bis sie benötigt werden. Für nachfolgende Analysen kann eine Mikro-Gavage verwendet werden, um unterschiedliche Substanzen in die Zebrafischlarven zu verabreichen.

Bereiten Sie zunächst die erforderlichen Gavagenlösungen vor, um diese Methode zu demonstrieren. 10 KD Dextran, konjugiert mit Texas Red, wird zur Analyse der Barrierefunktion des intestinalen Epithels verwendet.

Wie zuvor gezeigt, schläuche jeweils 10 bis 20 Zebrafischlarven pro experimenteller Bedingung. Wiederhole dies, wenn möglich, an duplizierten oder tripelten Gruppen. Nach der Schlucksondierung erhole die Larven aus der Anästhesie und lasse sie frei in frischem Medium schwimmen.

Nach ungefähr 20 Minuten erneut die Larven wie zuvor gezeigt anästhesieren. Sobald die Larven anästhesiert sind, positionieren Sie sie in 3 % Methylcellulose auf einem 3 % Agaroseblock. Bilden Sie die Larven mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop und einem Texas-Red-Filter ab, und wählen Sie eine Vergrößerung, die die Larven vom Schnabel bis unmittelbar hinter das Ende des Darmkreises zeigt. Die Fluoreszenz sollte im Darmlicht intensiv sein.

Jedoch wird die Barrierefunktion anhand der Menge an Dextran bewertet, die in extraintestinalem Gewebe nachweisbar ist, wobei die Belichtungseinstellung zur Visualisierung der Fluoreszenz im Rumpfbereich angepasst wird. Selbst wenn dadurch die luminalen Fluoreszenz überbelichtet wird, bleibt Dextran allein verabreicht innerhalb des Darmlumens zurückgehalten. Hingegen ist bei Larven, die zusammen mit EDTA inkubiert wurden – einem Stoff, der epitheliale Tight Junctions stört – Dextran in der Zirkulation sowie in perivaskulären Räumen und Gefäßen nachweisbar.

In diesen Beispielen wurde Image J verwendet, um die relative mittlere Fluoreszenz in einem interessierenden Bereich im Rumpf des Zebrafisches zu quantifizieren und gegenüber einer ROI außerhalb des Fisches als interner Kontrolle zu normalisieren. Hier werden Ergebnisse einer herkömmlichen Nadel mit denen einer Micro-Forge-Nadel verglichen. Weniger Larven in der nur Dextrin enthaltenden Gruppe zeigten extraintestinale Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass Micro-Forge-Nadeln weniger wahrscheinlich sind, die Larven zu beschädigen.

Bei genauerer Betrachtung eines Bereichs findet sich Dextran erneut ausschließlich im Darmlumen, ohne in das Gefäßsystem oder in extraintestinale Bereiche auszutreten. In Abwesenheit von EDTA, wenn zusammen mit EDTA verabreicht, wird Dextran in extraintestinalen Räumen sowie im Lumen der dorsalen Aorta und der posterioren Kardinalvene nachgewiesen, wobei das hier beobachtete Signal aufgrund des Blutflusses entsteht. Während des Durchführens dieses Verfahrens sollte sichergestellt werden, dass die Nadel keine gezackten Kanten aufweist, dass die Fische gut positioniert und sicher im Methylcellulose fixiert sind, und es ist Vorsicht sowie Geduld erforderlich, während das Einführen der Nadel durch die Speiseröhre der Larve erlernt wird.

Diese Technik kann in einer Vielzahl von Anwendungen beim Zebrafisch eingesetzt werden, bei denen eine kontrollierte Einführung oder Visualisierung von Substanzen im Darm erforderlich ist. Sie ermöglicht eine strenge Kontrolle über Zeitpunkt, Applikationsweg und Dosierung der Verabreichung am Tier und reduziert die Variabilität innerhalb und zwischen Experimenten erheblich.