Name: A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie molekulare Auslesemethoden für langfristige olfaktorische Adaptation in C. elegans nutzen. Dieses Protokoll zeigt GFP-markiertes EGL-4 in AWC-Neuronen zur Visualisierung nukleärer Translokation und Verhaltensanalyse.

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Wir möchten Scott Hamilton, und die Mitglieder der O&#39;Halloran Labor für sorgfältige Lektüre des Manuskripts danken. Wir danken auch unseren anonymen Gutachter für gute Vorschläge und aufschlussreiche Kommentare.

Ein. Bau der GFP Tagged EGL-4 Ausdruck Tiere <ol><li> Klonen die translationale Fusion GFP :: EGL-4 unter dem Promotor für das odr-3-Gens (2678 bp Gebrauch unmittelbar vor dem Startkodon): (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4. Die odr-3-Promotor-Laufwerke Ausdruck in den amphid Neuron Paare: AWA, AWB, AWC und schwach ASH. </li><li> Injizieren das Plasmid (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4 in Wildtyp (N2) Tiere bei 50 ng / ul mit den Co-Injektion unter Verwendung von Standard-Marker Keimbahn-Transformationstechniken 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / ul) und (p) odr-1 :: dsRed 10 (25 ng / ul). Die odr-1-Promotor-Laufwerke Ausdruck in der AWC und AWB amphid Neuron Paaren, und die OFM-1-Promotor-Laufwerke Ausdruck in den coelomocytes. </li><li> Betreff Die transgenen Tiere exprimieren die extrachromosomale Arrays in Schritt 1,2 bis Ultra Violet (UV) / trimethylpsoralen (TMP) Integration-Protokoll detailliert11. </li><li> Bleach synchronisiert die Tiere 12 und kultivieren sie auf Nematode Growth Media (NGM) Platten mit OP50 E. coli auf die L4-Stadium. Waschen L4 Tiere von NGM-Platten mit M9 Puffer OP50 E. entfernen coli-Bakterien. </li><li> Entfernen M9-Puffer und fügen 50-100 ul von 30 ug / ml TMP arbeitet Lösung auf dem Wurm Pellet in der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wickeln Sie den 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in Folie Umgebungslicht blockieren und leicht bewegen auf einem Rotator für 15 min in der Folie verpackte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Übertragen Sie die Würmer in der TMP / Wurm-Lösung zu einem großen ungesetzte NGM Platte. </li><li> Setzen Sie die Würmer auf dem NGM Platte UV 350 uJ (X100) mit einem Stratalinker 2400. Dann fügen Würmern zu einem OP50 mit NGM Platte und inkubieren im Dunkeln für 5 Std. </li><li> Pick-50 transgenen Würmer etwa 10 gesetzten Platten (2-5 Würmern jede Platte). Transfer P0 ist auf neue Platten alle 24 Stunden für 3 Tage. </li><li> Pick-250 klonale F1 einnimals (1 Tier pro Platte). Klonen von 2-4 F2 Tiere aus jeder F1 Platte. Prüfen F3 Tiere für eine 100% Übertragungsleitung durch suchen (p) ofm-1 :: GFP Expressionsmuster unter einem Präpariermikroskop Fluoreszenzmikroskop aussehen. </li><li> Outcross die endgültige integrierte Linie (n) mit Wildtyp N2 Tieren 5 mal. Wir werden auf die endgültige integrierte Linie als pyIs500 beziehen, und die GFP-markierten EGL-4-Molekül als GFP :: EGL-4. </li></ol> 2. Anbau und Pflege der Tiere für nukleare Translokation Assays <ol><li> Kultivieren die pyIs500 Tieren bei 25 ° C auf Standard 10 cm NGM-Platten (siehe unten für Rezept) seeded mit OP50 E. coli-Bakterien 13 (Abbildung 1). </li><li> Am Tag 1, Pick vier vor fünf L4 pyIs500 Tiere aus Platten bei 25 ° C kultiviert auf fünf separaten 10 cm OP50 E. coli ausgesät Platten und Inkubation bei 25 ° C (dh 4-5 L4 Tieren pro Platte). </li><li> Am Tag 4, waschen erwachsenen populations der pyIs500 Tieren abseits der großen NGM-Platten mit S-Basal-Puffer (siehe unten Rezept). Verwenden Sie Einweg-Glas-Pipetten auf Tiere zu übertragen, da sie an der Seite des Kunststoff-Pipettenspitzen haften. </li></ol> 3. Langfristige Geruch Induced Nuclear Translokation Assays <ol><li> Waschen Sie die pyIs500 Tieren 3 mal in S-Basal, um Bakterien zu entfernen. Nicht zentrifugieren Tiere zwischen Wäschen, sondern dass die Tiere durch die Schwerkraft in einer stationären 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen begleichen. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass alle Bakterien entfernt wird, und dass die NGM Pasteten sind frei von Verunreinigungen, wie Restbakterien wird sich negativ auf das Ergebnis der Translokation Assay. Außerdem haben wir gefunden, dass die Autoklavierung 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen erzeugt einen &quot;sticky&quot;-Eigenschaft auf die Innenwände der Röhre, die Tiere bewirkt, dass an den Seiten haften und so verwenden nicht-autoklavierter 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Während Tiere zwischen Wäschen Abwicklung, Make-up tEr Adaption Lösung. 100 ml S-Basal-Puffer in einem 100 ml Zylinder graduiert. Hinzufügen Anpassung Geruch an die S-Basal und Abdichtung des Zylinders mit einem Streifen Parafilm. Bei Durchführung Benzaldehyd Anpassung hinzuzufügen 7,5 ul von Benzaldehyd in 100 ml S-Basal für Butanon Adaption fügen 11 ul von 2-butaone zu 100 ml S-Basal. Vorsichtig umdrehen (nicht schütteln) die Abschluss Zylinder mit S-Basal und Geruch 30 Mal um eine gleichmäßige Emulsion zu schaffen. </li><li> Nach dem letzten Waschen in S-Basal, damit die Tiere sich niederzulassen und entfernen Sie alle Flüssigkeit. Label ein tube &quot;+ ve&quot; oder &quot;Anpassung&quot; und das andere Rohr &quot;-ve&quot; oder &quot;unadapt&quot;. Dann fügen Sie 1 ml der Anpassung Mix der Anpassung Mikrozentrifugenröhrchen (+ ve) und 1 ml S-Basal der unangepassten Kontrolle Mikrozentrifugenröhrchen (-ve). Versuchen, die Anzahl der Tiere zwischen 100 und 200 in jeder Röhre zu halten. Mit einigen der Praxis ist es möglich, den ungefähren Anzahl von Tieren in einem Pellet schätzen, indem Auge. </li><li> Legen Sie eine 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen cap protectorZu jedem Röhrchen (verhindert Deckel aus knallen offen) und platzieren Sie die Rohre auf einem Rotator für 80 min. Wir haben festgestellt, dass Geruch Belichtung zwischen 60 min und 80 min zu ähnlichen Ergebnissen (sowohl aufgrund der langfristigen Anpassungsmaßnahmen) ergibt. Allerdings bietet 80 min Exposition konsistentere Ergebnisse in unseren Händen. So sind alle unsere langfristige Anpassung Assays standardisiert sind durch die Verwendung eines 80 min Geruch Exposition (Abbildung 2). </li><li> Nach 80 min, waschen Tieren 3 mal in S-Basal. Damit sich die Tiere durch die Schwerkraft zwischen jedem Waschgang zu begleichen. </li></ol> 4. Kurzfristige Odor-induzierten nukleären Translokation von Assays <ol><li> Im Falle von kurzfristigen Geruch Anpassung, das gleiche Protokoll nach langfristigen geruchs-induzierte Translokation Assays (Schritte 3.1-3.4), jedoch anstelle der Inkubation der pyIs500 Tieren bei der Anpassung Geruch für 80 min, verwenden Sie eine Exposition von 30 Minuten . Die Quantifizierung von Geruchs-induzierte Kerntranslokation unten beschriebenen Assays (Schritt 5) die gleiche ist für eine langfristige und kurzfristige term Expositionen. </li></ol> 5. Scoring der Geruch-induzierten nukleären Translokation Ereignis <ol><li> Make 2% Agarose Pads enthaltend 5 mM Natriumazid (NaN 3) durch Lösen Agarose-Gelelektrophorese in dH 2 0. Legen Sie eine einzelne Tropfen geschmolzenen Agarose mit NaN 3 auf einem Glasobjektträger. Unmittelbar legen Sie ein weiteres Glasobjektträger auf der ersten Folie, um die Tropfen geschmolzenen Agarose glätten. Hinterlegen für 30 sec, und dann sanft necken abgesehen die Objektträger Ausfahrt aus einer Mikroskop-Objektträger mit einer flachen Agarose Pad von ~ 1 mm. </li><li> Nach dem letzten Waschen in S-Basal, damit die Würmer in der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen niederlassen und entfernen Sie alle Flüssigkeit. Dann fügen Sie die Tiere tropfenweise auf die Agarose Pads von mehreren Objektträgern. Es ist wichtig, die Anzahl der Tiere pro Folie zwischen 50 und 100 halten. Zu viele Tiere pro Folie wird komplizierter Scoring und oft eine Streuung glow nach Blaulicht-Anregung. Überschüssige Flüssigkeit kannböse sein aus der Agarose-Pad mit einem kleinen Kim-wischen. Legen Sie eine 0,5 mm Glas Deckglas auf dem Pad und stehen lassen für 2 min für die NaN 3 zu ermöglichen, um die Tiere zu fixieren. Beachten Sie, können Tiere aus den Folien nach Scoring wiederhergestellt werden. Die Tiere werden aus dem NaN 3 Anästhesie nach ~ 1 Stunde wiederherstellen, wenn ein seeded NGM Platte in einem Tropfen M9 Puffer übertragen. </li><li> An dieser Stelle ist es zwingend erforderlich, dass jeder Experimentator eine Schlüsselrolle zu verfolgen, welche Rutsche die experimentelle (+ ve) Folie ist und die Folie ist die Steuerung (-ve) slide entwickeln, und übergeben Sie die Folien an eine andere Person, die blind punkten wird die GFP: EGL-4 Lokalisation Muster. Dies wird für jede Experimentator Vorspannung zu steuern. </li><li> Bewertung zwischen 50 und 100 Tieren pro Folie unter Verwendung eines aufrechten Fluoreszenzmikroskop mit 10X, 40X und 63X vergrößernden Objektiven und GFP / RFP Filter. Erstens, suchen Tiere unter 10X Vergrößerung mit Hellfeldbeleuchtung. Zweitens, suchen Sie die AWC Neuron durch Ausschalten des bright-Beleuchtung und mit dem RFP-Filter. Die (p) odr-1 :: dsRed Laufwerken Ausdruck in AWB und AWC Neuronen. Die AWC Neuronen haben ausgeprägte ovale Zellkörper wie mit AWB Zellkörpern, die kleiner und kreisförmig sind (Abbildung 2). </li><li> Sobald die AWC Zellkörper gefunden wurde, dem GFP-Filter einschalten und notieren Sie die Lokalisierung von GFP: EGL-4 als Kern-oder zytoplasmatisch. Verwendung eines Zählers kann der Experimentator zu halten suchen in das Okular während Scoring die Folie. Anmerkung: Schritte 5,1-5,5 sind mindestens 3-mal auf verschiedenen Tagen wiederholt, um statistisch signifikante Daten (Fig. 1-2) zu erzeugen. </li></ol> 6. Die Überwachung EGL-4 während der Erholung von Langzeit-Geruch Anpassung GFP-markierten <ol><li> Nach Schritt 3,5, teilen die Bevölkerung pyIs500 Tieren in mehrere Aliquots und Gäste für nukleare gegenüber zytoplasmatische GFP :: EGL-4 in der AWC zum Zeitpunkt Null (dh nach 80 min Exposition) und multiple nachfolgenden Zeitpunkten (Abbildung 3). </li><li> Übertragen sowohl die Steuerung (-ve) und experimentelle (+ ve) Tieren mit Einweg-Glas-Pipetten auf NGM-Platten. </li><li> Damit sich die Tiere für verschiedene Zeitspannen erholen und erneut zu prüfen, die Lokalisierung von GFP :: EGL-4in AWC zu jedem Zeitpunkt wie in den Schritten von 5,1 bis 5,5. </li></ol> 7. Materialien NGM-Platten:; 3 g Natriumchlorid (NaCl), 2,5 g Bacto-Pepton 21 g Bacto-Agar: Für 1 L 1 L ddH 2 0 hinzuzufügen. Autoclave Media. Nach dem Autoklavieren, kühlen den Agar, bis die Temperatur liest 54 ° C. Fügen Sie die folgenden Lösungen: 25 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer, 1 ml 1 M Magnesiumsulfat (MgSO 4), 1 ml 1 M Calciumchlorid (CaCl 2), 1 ml Cholesterin in Ethanol (5 mg / ml Stammlösung). 1 M Dibasic K 2 HPO 4 174,2 g / mol: Für 500 ml: In 400 ml ddH 2 O löst man 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Lautstärke auf 500 L mit ddH 2 O. Filtern sterilisieren mit einem 500 ml Sterile Filter Unit. 1 M Einbasisches KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Für 1 L: In 800 ml ddH 2 O löst 136,1 g Einbasisches KH 2 PO 4. Lautstärke auf 1 l mit ddH 2 O. Filtern sterilisieren mit einem 500 ml Sterile Filter Unit. 1 M Kaliumphosphat (K 3 PO 4) Puffer pH 6,0: Für 1 L: In einem 1 L Sterile Filter Unit, fügen Sie 868 ml von 1 M Einbasisches KH 2 PO 4. Lassen Sie das Gerät filtern durch, dann fügen Sie 132 ml von 1 M Dibasic K 2 HPO 4. Lassen Sie das Gerät, um alle Flüssigkeit zu filtern. Filter entfernen Gerät und pH-Wert auf 6,0. Lagerung bei Raumtemperatur. S-Basal: Für 1 L: 50 ml 1M K 3 PO 4-Puffer, pH ~ 6,0, und 20 ml 5M NaCl aq. Füllen auf 1 l mitddH 2 O. Autoklavieren Solution. M9: Für 1 L: 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O. Füllen auf 1 l mit ddH 2 0. Sterilisieren durch Autoklavieren.

<ol><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803(1995).</li>
<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity%2C+discrimination%2C+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learning and Memory. 4 (2), 179(1997).</li>
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<li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity%3A+Aplysia+and+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757(2003).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Geruch nukleärer Eingabe eines GFP-markierten EGL-4-Molekül hier beschriebenen bietet eine robuste molekulare Auslesen der olfaktorischen Anpassung in C. elegans. Die Geruchs-induzierte nukleäre Translokation Assays sind einfach und erfordern nur ein paar Tage Vorbereitungszeit. Die pyIs500 Tier, das wir für diese Assays aufgebaut haben, drückt eine Markierung, die die AWC Neuron als auch als Ausdruck der GFP-markierten EGL-4-Protein leuchtet. So fühlen wir, dass ein Experimentator mit wenig bis ga...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> NGM-Platten </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fisher Chemical </td><td> S671-10 </td><td> NGM-Platten </td></tr><tr><td> Bacto Pepton </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> NGM-Platten </td></tr><tr><td> Kaliumphosphat Dibasic </td><td> Fisher Chemical </td><td> S375-500 </td><td> S-Basal-Puffer und NGM-Platten </td></tr><tr><td> Kalium monobasisches </td><td> Fisher Chemical </td><td> P285-500 </td><td> S-Basal-Puffer und NGM-Platten </td></tr><tr><td> Kimwipes - Small </td><td> Kimberly-Clark </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol 100% </td><td> Gold Shield ChemicalCo. </td><td> 43196-115 </td><td> Verdünnen Gerüche für Chemotaxis-Assays </td></tr><tr><td> Kalziumchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C8106-500G </td><td> NGM-Platten </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfat </td><td> MP Biomedicals </td><td> 150.136-500G </td><td> NGM-Platten </td></tr><tr><td> Natriumazid 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> ICN10289180 </td><td> Narkose </td></tr><tr><td> Agarose - UltraPure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> Agarose-Pads </td></tr><tr><td> Benzaldehyd </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1334-100G </td><td> AWC Geruch </td></tr><tr><td> Butanon, ACS Grade </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 360.473-500ML </td><td> AWC Geruch </td></tr><tr><td> Reaktionsgefäße - 1,5 ml Colored </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur Pipette Einweg Glas 5-3/4 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> UV-Integration </td></tr><tr><td> Filter Vacuum Bottle - 500 ml </td><td> Nalgene </td><td> 09-740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

a molecular auslesen langfristige olfactory anpassung in<em&gt; c. elegans</em

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Während anhaltende Stimulation meisten sensorischen Neuronen wird ihre Reaktion durch eine Verringerung ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem Signal anzupassen. Die Anpassung Resonanz hilft Form Aufmerksamkeit und schützt die Zellen vor Reizüberflutung. Anpassung innerhalb des olfaktorischen Schaltung C. elegans wurde zuerst von Colbert und Bargmann 1,2 beschrieben. Hier haben die Autoren Parameter der olfaktorischen Adaption Paradigma, das sie verwendet, um einen genetischen Screen entwerfen zu isolieren Mutanten in ihrer Fähigkeit, an flüchtigen Gerüchen, erfasst durch den Amphid Flügel Zellen Typ C (AWC) sensorischen Neuronen anzupassen definiert. Wenn Wildtyp C. elegans Tiere werden zu einem attraktiven AWC-spürte Geruch 3 für 30 min ihre Reaktionsfähigkeit auf den Geruch wird anzupassen ausgesetzt und ignoriert dann die Anpassung Geruch in einem Chemotaxis Verhaltens Assay für ~ 1 Stunde. Wenn Wildtyp C. elegans Tiere werden zu einem attraktiven AWC-spürte Geruch für ~ 1 Stunde ausgesetzt werden sie dann ignorieren Sie die Anpassung Geruch in achemotaxis Verhaltens Assay für ~ 3 Std. Diese beiden Phasen der olfaktorischen Anpassung in C. elegans wurden als kurzfristige olfaktorische Adaption (induziert nach 30 min Geruch Belichtung) und langfristige olfaktorischen Adaption (induziert nach 60 min Geruch Exposition) beschrieben. Später von L&#39;Etoile et al. Arbeiten, freigelegt 4 ein Protein Kinase G (PKG) genannt EGL-4, die sowohl für die kurz-und langfristigen olfaktorische Anpassung AWC Neuronen benötigt wird. Die EGL-4-Protein enthält eine Kernlokalisierungssequenz, die zur langfristigen olfaktorischen Anpassungsmaßnahmen aber entbehrlich für kurzfristige olfaktorischen Adaption Reaktionen im AWC 4 ist. Durch die Kennzeichnung EGL-4 mit einem grün fluoreszierenden Protein, war es möglich, die Lokalisation von EGL-4 im AWC bei längerer Exposition Geruch zu visualisieren. Mit diesen vollständig funktionellen GFP-markierten EGL-4 (GFP :: EGL-4)-Molekül ist es uns gelungen, eine molekulare Auslesen langfristige olfaktorischen Adaption im AWC 5 zu entwickeln. Mit dieser molecular Auslesen der olfaktorischen Anpassung konnten wir sowohl vorwärts und rückwärts genetischen Screens durchführen, um mutierte Tiere, die defekte subzelluläre Lokalisation Muster der GFP :: EGL-4 weisen in der AWC 6,7 identifizieren. Hier beschreiben wir: 1) die Konstruktion von GFP :: EGL-4 Ausdruck Tieren; 2) das Protokoll für den Anbau von Tieren für die langfristige geruchs-induzierte nukleäre Translokation Assays, und 3) die Wertung der langfristigen geruchs-induzierte Kerntranslokation Event-und Recovery-(Re-Sensibilisierung) aus der nuklearen GFP :: EGL-4 Zustand.

Ein Beispiel für die Lokalisierung von GFP :: Muster EGL-4in der AWC vor und nach längerer Exposition Geruch ist in Abbildung 2 gezeigt. Vor verlängerte Geruch Belichtung GFP :: EGL-4 wird in das Cytosol der AWC (2B) lokalisiert, und nach 80 min Geruch Exposition GFP :: EGL-4 ist mit dem Kern der AWC (2D) lokalisiert. Auf der Verhaltensebene werden die Tiere mit zytosolischen GFP :: EGL-4 in AWC zu einer punktförmigen Quelle des Geruchs (- beachten Sie die Chemotaxis In...

Hier beschreiben wir eine molekulare Auslesen der langfristigen olfaktorische Anpassung<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Die Protein Kinase G, EGL-4, ist für einen stabilen Anpassungsmaßnahmen im primären sensorischen Neuronen Paar genannt AWC. Bei längerem Geruch Exposition EGL-4 transloziert aus dem Cytosol an Kern der AWC.

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in<em&gt; C. elegans</em

Bei anhaltender Stimulation passen die meisten sensorischen Neuronen ihre Antwort an, indem sie ihre Empfindlichkeit gegenüber dem Signal verringern. Die Adaptationsantwort hilft ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos besteht darin, die Entwicklung und Durchführung eines molekularen Nachweises für die langfristige olfaktorische Anpassung bei Seeeiern darzustellen, der den Anpassungszustand eines Tieres beschreibt. Dies wird erreicht, indem eine Protein-Kinase G, genannt egg L vier, mit einem grün fluoreszierenden Proteinmolekül markiert und dieses Protein-Fusionsprodukt in den amphi wing-Zellen vom Typ C oder AWC-Neuronen exprimiert wird. Als zweiten Schritt werden Tiere, die die mit GFP markierte Form von egg L vier in den AWC-Neuronen exprimieren, auf Nematoden-Wachstumsmedien-Platten kultiviert, die die bakterielle Nahrungsquelle OP 50 enthalten. Anschließend wird nach vier Tagen eine Population von Tieren von den Kultivierungsplatten abgewaschen und 80 Minuten lang einem von den AWC-Neuronen wahrgenommenen Duftstoff ausgesetzt, um eine langfristige olfaktorische Anpassung zu fördern.Die Ergebnisse zeigen eine nukleäre Lokalisation des mit GFP markierten Ei-L-vier im AWC von angepassten Tieren im Vergleich zu einer zytoplasmatischen Lokalisation des mit GFP markierten ALE-vier in nicht angepassten Kontrolltieren. Durch Erstellung einer funktionalen Kopie der ALE-vier-Felder mithilfe des grünen Fluoreszenzproteins können wir die subzelluläre Lokalisation von ACO-vier im AWC verfolgen und den Verhaltenszustand des Tieres anhand der GFP-Lokalisation beschreiben. Dieses molekulare Werkzeug ermöglicht es uns, die Rolle verschiedener Mutanten oder Behandlungen bei der Beeinflussung der zellulären Antwort nach anhaltender neuronaler Stimulation schnell zu untersuchen.Dieses Protokoll beginnt mit dem Aufbau von GFP-markierten Ei-L4-exprimierenden Tieren, wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben, die diesem Video beiliegt. Die endgültige integrierte Linie wird als IS500 bezeichnet, und das GFP-markierte Ei-L4-Molekül als GFP-Ei-L4. Kultivieren Sie die IS500-Tiere bei 25 Grad Celsius auf standardmäßigen 10 cm NGM-Platten, die mit OP50 E. coli-Bakterien besiedelt wurden. Am ersten Tag wählen Sie vier bis fünf IS500-Tiere im vierten Larvenstadium von Platten, die bei 25 Grad Celsius kultiviert wurden, auf 10 cm OP50 E. coli-geimpfte Platten, indem Sie einen kleinen Platindraht – als „Pick“ bezeichnet – verwenden, um die Tiere aufzunehmen und zu übertragen.Wiederholen Sie dies für vier zusätzliche Platten. Inkubieren Sie die Platten am vierten Tag bei 25 Grad Celsius. Waschen Sie adulte Populationen von IS 500 Tieren von den großen NGM-Platten ab, indem Sie einen Basalpuffer zur Platte hinzufügen und vorsichtig schwenken.Dadurch lösen sich die Tiere von der Plattenoberfläche und gelangen in die Pufferlösung. Saugen Sie die Tiere mit Einweg-Glaspipetten von der Platte ab und überführen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen. Beginnen Sie die Translokationsassays, indem Sie 500 Tiere in S. basil waschen, um Bakterien zu entfernen; zentrifugieren Sie nicht.Tiere zwischen den Waschschritten. Lassen Sie die Tiere stattdessen durch Schwerkraft in einer ruhenden 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenprobe ruhig absinken. Es ist entscheidend sicherzustellen, dass alle Bakterien entfernt werden und dass NGM-Platten frei von Kontamination sind, da verbliebene Bakterien das Ergebnis des Translokationsassays negativ beeinflussen würden.Wiederholen Sie die Wäsche zweimal mit Basilikum. Stellen Sie die Anpassungslösung her, indem Sie 100 Milliliter S-Basilikuspuffer in einen 100-Milliliter-Messzylinder geben. Wenn eine Aldehyd-Anpassung durchgeführt wird, geben Sie 7,5 Mikroliter Aldehyd zu 100 Milliliter ESP Basilikum und verschließen Sie den Zylinder mit einem Streifen Param.Den Messzylinder mit Basilikum und Duftstoff vorsichtig 30-mal umdrehen. Um eine gleichmäßige Emulsion zu erzeugen, fügen Sie Tiere in jedes Röhrchen hinzu, wobei die Anzahl der Tiere in jedem Röhrchen zwischen 100 und 200 liegen sollte. Mit etwas Übung ist es möglich, die ungefähre Anzahl der Tiere in einer Probe visuell abzuschätzen, nachdem sich die Tiere abgesetzt haben.Nach dem S. basil-Waschschritt entfernen Sie alle Flüssigkeit aus dem Epi-Röhrchen. Beschriften Sie ein neues Röhrchen als „positiv“ und das andere neue Röhrchen als „negativ“. Geben Sie dann ein Milliliter der Anpassungsmischung in das positive Anpassungs-Mikrozentrifugenröhrchen und ein Milliliter S. basil in das negative, nicht angepasste Kontroll-Mikrozentrifugenröhrchen. Setzen Sie einen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen-Kappenprotektor auf jedes Röhrchen und stellen Sie die Röhrchen 80 Minuten lang auf einen Rotator.Nach 80 Minuten die Tiere dreimal in S basil waschen und zwischen jedem Waschschritt durch Schwerkraft absetzen lassen. Herstellung von 2 %igen Aros-Platten, die fünf Millimolar Natriumazid enthalten, durch Auflösen von Gel-Elektrophorese-Aros. Auf einem Objektträger einen einzelnen Tropfen Mol und Aros, der Natriumazid enthält, in destilliertem Wasser aufbringen und unmittelbar danach einen weiteren Objektträger auf den ersten legen, um den Tropfen des geschmolzenen Agros zu flachzudrücken.30 Sekunden stehen lassen und dann die Objektträger vorsichtig auseinanderziehen, sodass ein Objektträger mit einem flachen Aros-Pad von etwa einem Millimeter übrig bleibt. An diesem Punkt ist es unerlässlich, dass jeder Experimentator einen Schlüssel entwickelt, um nachzuverfolgen, welche Objektträger dem positiven Experiment und welche der negativen Kontrolle zugeordnet sind. Nachdem sich die Würmer nach der letzten Wäsche in Basilium beruhigt haben, entfernen Sie sämtliche Flüssigkeit und geben anschließend die Tiere tropfenweise auf die Aros-Pads mehrerer Objektträger.Es ist wichtig, die Anzahl der Tiere pro Objektträger zwischen 50 und 100 zu halten. Zu viele Tiere pro Objektträger erschweren die Auswertung und erzeugen oft ein streuendes Leuchten. Nach der Anregung mit blauem Licht kann überschüssige Flüssigkeit mit einem kleinen Kim-Tuch von der aros-Pad abgezogen werden.Legen Sie eine 0,5 Millimeter dicke Glasdecke auf das Polster und lassen Sie sie zwei Minuten lang stehen, damit das Natriumazid die Tiere immobilisieren kann. Danach geben Sie die Objektträger an eine andere Person weiter, die das GFP-Ei-L4-Lokalisierungsmuster blind bewertet. Dies kontrolliert mögliche experimentelle oder Bewertungsverzerrungen, wobei zwischen 50 und 100 Tiere pro Objektträger an einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop mit 10×, 40× und 63× Vergrößerungsobjektiven sowie GFP-RFP-Filtern analysiert werden.Zunächst lokalisieren Sie die Tiere unter 10-facher Vergr&ouml;&szlig;erung mit Hellfeldbeleuchtung. Anschlie&szlig;end lokalisieren Sie das AWC-Neuron, indem Sie die Hellfeldbeleuchtung ausschalten und den RFP-Filter verwenden. Der Promotorgeruch.Ein DS-rot steuert die Expression in einem WB- und A-WC-Neuron. Die A-WC-Neuronen weisen charakteristische ovalförmige Zellkörper auf, im Vergleich zu den kleineren, kreisförmigen Zellkörpern von WB-Zellen. Sobald der Zellkörper des A-WC-Neurons lokalisiert wurde, wechseln Sie zum GFP-Filter und notieren die Lokalisation von GFP-Ei-L4 als nukleär oder zytoplasmatisch.Mithilfe eines Zählers kann der Experimentator weiterhin durch das Okular schauen, während er die Probe auswertet. Dieser Vorgang wird mindestens dreimal an getrennten Tagen wiederholt, um statistisch signifikante Daten zu erhalten. Ein Beispiel für das Lokalisierungsmuster von GFP-Ei-L-vier in der A-WC vor und nach längerer Geruchsbelastung wird vor der längeren Geruchsbelastung gezeigt.GFP-Ei-L-vier lokalisiert sich nach 80 Minuten Duftstoffexposition im Zytoplasma der A-WC. GFP-Ei-vier lokalisiert sich auf Verhaltensebene im Zellkern der A-WC. Tiere mit zytoplasmatischem GFP-Ei-vier in einer WC zeigen eine Anziehung zu einer punktförmigen Duftstoffquelle.Dieses Diagramm wurde aus repräsentativen Ergebnissen von Chemotaxis-Assays nicht-adaptierter Tiere erstellt. Beachten Sie, dass der CHEMOTAXIS-Index nahe bei eins liegt. Tiere, die im AWC nukleäres G-F-P-E-L vier exprimieren, werden nicht von einer Punktquelle des adaptierenden Geruchs angezogen.Dieses Diagramm wurde aus repräsentativen Ergebnissen von CHEMOTAXIS-Assays an adoptierten Tieren erstellt. Beachten Sie, dass der CHEMOTAXIS-Index nahe bei null liegt. Sobald Ei L vier in den Zellkern der A WC-Neuronen eindringt, verursacht es stabile und lang anhaltende Veränderungen in der Physiologie der A WC, die auch dann bestehen bleiben, wenn sich Ei L vier nicht mehr im Kern befindet.Nach 80 Minuten Geruchsbelichtung ignorieren die Tiere eine Punktquelle des anpassenden Geruchs, und diese Anpassung bleibt auch nach 120 Minuten Erholung bestehen. Nach 80 Minuten Geruchsbelichtung wird GFP Eagle vier im Kern der AWC beobachtet. Dieser nukleäre Eintritt ist sowohl notwendig als auch ausreichend, um eine Langzeit-Anpassung in der AWC auszulösen. Nach 120 Minuten Erholung zeigen diese Tiere kein nukleäres GFP Eagle vier mehr, ignorieren jedoch weiterhin eine Punktquelle des anpassenden Geruchs Aldehyd auf Verhaltensebene, ohne die Kultivierungszeiten einzuschließen.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden.

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In diesem Video-Beitrag beschreiben wir eine neue Methode erlaubt den Bau von Geruchsrezeptoren Gradienten mit stabilen und kontrollierbaren Geometrien. Wir haben kurz zeigen, wie diese Gradienten zu Bildschirm kann für olfaktorische Mängel (vollständiger oder teilweiser Anosmie) verwendet werden und auf subtilere Funktionen der Chemotaxis Verhalten zu studieren.

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Hier beschreiben wir Methoden zu testen, C. elegans assoziativen Lernens sowie kurz-und langfristigen assoziativen Gedächtnisses. Diese Bevölkerung Assays verwenden die Würmer Fähigkeiten chemotax Richtung flüchtigen Geruchsstoffe und bilden positive Assoziationen bei Paarung Essen mit dem Lockstoff Butanon. Erhöhung der Zahl der Konditionierung Perioden induziert Langzeitgedächtnis.

C. elegans Positive Butanone Learning, kurzfristige und langfristige Assoziative Speicher Assays

Verfahren zur quantitativen Bewertung der chemotaktischen Reaktion...

C. elegans Chemotaxis-Assay

Nach Exposition gegenüber spezifischen Umweltstressoren erfährt der Fadenwurm Caenorhabditis elegans eine umfangreiche phänotypische Plastizität, um in ein stressresistentes 'Dauer'-Jugendstadium überzugehen.  Wir stellen Methoden zur kontrollierten Induktion und Bildgebung der Neuroplastizität während der Dauer vor.

In-vivo-Imaging von Dauer-spezifische neuronale Remodeling in C. elegans

Die Verwendung eines angepassten "olfaktorischen Chips" für die effiziente Kalzium Imaging von C. Elegans Männchen ist hier beschrieben. Studien über männliche Einwirkung von Glycerin und ein Pheromon werden ebenfalls angezeigt.

Verwenden einen angepasste mikrofluidischen olfaktorische Chip für die Bildgebung neuronaler Aktivität als Reaktion auf Pheromone in männlichen C. Elegans Kopf Neuronen

Dieses Protokoll analysiert Navigations Verhalten von Drosophila Larve in Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen. 630 nm Wellenlänge wird verwendet, um einzelne olfaktorischen Neuronen mit dem Ausdruck einer rot-verschoben Kanal Rhodopsin zu aktivieren. Larval Bewegung gleichzeitig verfolgt, digital erfasst und mit individuell geschriebenen Software analysiert.

Tracking von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen

Wir haben zuvor Protokolle für Caenorhabditis elegans entwickelt, um kurz- und langfristige assoziative Erinnerungen durch massiertes bzw. räumliches Training zu bilden. Hier werden detaillierte Protokolle für die Konditionierung von C. elegans beschrieben, indem 1-Propanol und Salzsäure als konditionierte bzw. unkonditionierte Stimuli gepaart werden, um ein aversives assoziatives Gedächtnis zu bilden.

Aversives assoziatives Lernen und Gedächtnisbildung durch Paarung zweier Chemikalien in Caenorhabditis elegans

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um assoziatives Lernen durch klassische Konditionierung im Modellorganismus C. elegans zu testen. Das Paradigma basiert auf der Paarung der Salzkonzentration in der Umwelt mit dem Vorhandensein oder Fehlen von Nahrung, was ihre Chemotaxis in Richtung oder weg von Salz verändert.

Messung des assoziativen Lernens in der Chemotaxis des Fadenwurms Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll etabliert Methoden zur Extraktion und Quantifizierung von Reaktionen auf das flüchtige Sexualpheromon in C. elegans und stellt Werkzeuge zur Untersuchung der chemischen Kommunikation und Navigationsbahn zur Verfügung.

Extraktion von flüchtigen Sexualpheromonen und Chemoattraction-Assay bei Caenorhabditis elegans

Ein wesentliches Hindernis für die Untersuchung der zellulären Aktivität während kognitiver Prozesse wie Lernen und Gedächtnis ist die Verwendung von Anästhetika für die Vorbereitung von In-vivo-Bildgebung . Die Anästhesie beeinträchtigt das Kurzzeitgedächtnis und die Kognition in mehreren Modellen, einschließlich Drosophila. Diese Studie stellt eine einzigartige Methode zur Vorbereitung adulter Drosophila für die In-vivo-Bildgebung ohne Anästhesie vor.

Im lebenden Organismus Bildgebung der neuronalen Aktivität in nicht anästhesierten erwachsenen Drosophila-Fliegen

Erfahren Sie, wie Sie molekulare Auslesemethoden für langfristige olfaktorische Adaptation in C. elegans nutzen. Dieses Protokoll zeigt GFP-markiertes EGL-4 in AWC-Neuronen zur Visualisierung nukleärer Translokation und Verhaltensanalyse.

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in

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