Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Die in diesem Video gezeigte Methode verwendet Schicksalskarten des Opus-Embryos im Spaltstadium, um die Kultur eines einzelnen Blaser isoliert zu identifizieren, um zu beurteilen, ob das embryonale Sulfat durch intrinsische oder extrinsische Anweisungen bestimmt wird. Die ersten beiden Zellembryonen werden entnommen, wobei die erste Spaltfurche den leicht pigmentierten Bereich der tierischen Hemisphäre halbiert. Diese Embryonen werden kultiviert, wenn die Embryonen 16 bis 32 Zellen erreichen, dann wird die Vitelmembran entfernt und benachbarte Zellen werden von der ausgewählten Zelle wegpräpariert. Zum Beispiel wird der präparierte Blaster dann in eine Vertiefung in einer schneckenbeschichteten Kultur überführt, vertieft und kultiviert.

Sobald der Explan das gewünschte Stadium erreicht hat, wird er geerntet, um die Gen- oder Proteinexpression mittels In-situ-Hybridisierung, QPCR oder Immunhistochemie zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen wie der Kultivierung großer Gruppen embryonaler Zellen oder Organen bei der Anmeldung besteht darin, dass einzelne embryonale Blasphemiere, deren Entwicklungsschicksal aus Studien zur Abstammungsverfolgung bekannt ist, ohne zusätzliche Wachstumsfaktoren oder das Vorhandensein benachbarter Zellen kultiviert werden können. So kann man direkt testen, ob zellinterne Faktoren die Blasphemie dazu veranlassen, zum Vorläufer eines bestimmten Gewebes zu werden, oder ob sie Signale von umgebenden Zellen benötigt.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Sezieren von Blairs und ihr Transfer in Kulturbrunnen feinfühlige Manipulationen unter dem Stereomikroskop erfordert. In diesem Video werde ich diese Methode verwenden, um zu zeigen, ob mütterliche mRNAs Zellen in Richtung eines neuronalen Schicksals verzerren. Schärfen Sie vier Sätze Pinzetten mit dem Illumina-Schleiffilm.

Eine Pinzette dient als Backup für den Fall, dass eine Spitze während des Eingriffs beschädigt wird, autoklavieren Sie alle vier Pinzetten und lagern Sie sie in einem sterilen Behälter, stellen Sie je 500 Milliliter 0,1 x und 1,0 x modifizierte Barth-Kochsalzlösung oder MKS her und sterilisieren Sie sie mit dem Filter. Lagern Sie diese Lösungen monatelang bei 14 bis 18 Grad Celsius in einer Glasflasche mit Schraubverschluss und bereiten Sie 2%ige Elektrophorese-Aros in 100 Millilitern einer X-Kultur vor. Mittlerer Autoklav zum Auflösen der Aros Mikrowelle, um die Aros zu verflüssigen, wenn sie das nächste Mal benötigt wird, während die Aros flüssig ist.

Gießen Sie etwa 0,5 Milliliter auf den Boden jeder Vertiefung einer sterilen 24-Well-Kulturplatte. Dadurch wird verhindert, dass die Implantate am Kunststoff kleben bleiben. Gießen Sie dann etwa zwei bis drei Milliliter auf den Boden von zwei bis 360 Millimeter großen Petrischalen und schwenken Sie sie leicht, um sie zu verteilen.

Diese dienen als Sezierschalen und der Aros verhindert, dass Embryonen am Kunststoff kleben bleiben. Sobald ihre Membranen entfernt sind, wenn der Aros abgekühlt und ausgehärtet ist, flammt die Spitze einer sechs Zoll langen Weidepipette, bis sie zu einer Kugel schmilzt. Formulieren Sie die Kugel kurz wieder und berühren Sie sie dann leicht auf der Oberfläche des Aros in einer Vertiefung der Kulturplatte.

Dadurch entsteht eine flache Vertiefung, in die der X-Plan eingefügt wird. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Vertiefung in der Platte. Füllen Sie anschließend jede Vertiefung der Kulturplatte mit einem Milliliter eines x sterilen Nährmediums.

Füllen Sie dann die Sezierschale mit 0,1 XMBS, um die Trennung des Blasters zu erleichtern. Sobald die Sezierschalen vorbereitet sind, übertragen Sie befruchtete Eier mit entfernter Geleehülle in 100-Millimeter-Petrischalen mit 0,5-fachem Nährmedium. Diejenigen, die nicht sofort verwendet werden, können bei 14 Grad Celsius kultiviert werden, während die erste Schale auf zwei Zellembryonen untersucht wird.

Untersuchen Sie die Embryonen in der ersten Petrischale, verwenden Sie ein Seziermikroskop, verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, übertragen Sie etwa 101 Zell- und zwei Zellembryonen in eine separate Schale, die mit 0,5-facher Kultur gefüllt ist. Mittel. Stellen Sie die Petrischale in einen 14 Grad Celsius heißen Inkubator. Die Fähigkeit dieses Assays, das Entwicklungspotenzial einer Zelle genau zu beurteilen, beruht auf der Aufschlüsselung der korrekten Blasphemie auf der Grundlage von Schicksalskarten.

Daher ist es entscheidend, Embryonen mit dem richtigen Pigmentmuster im Zweizellstadium auszuwählen, die folglich den regelmäßigen Spaltungsmustern entsprechen. Wie hier dargestellt. Regelmäßige Spaltungen treten oft nur auf einer Seite des Embryos auf.

Diese Embryonen können weiterhin als Spender verwendet werden, wenn die Spenderzelle von der regulären Seite stammt. Wenn die Embryonen das Zweizellstadium erreicht haben, sortieren Sie diejenigen, bei denen die erste Spaltfurche den leicht pigmentierten Bereich in der tierischen Hemisphäre halbiert, in eine separate Schale, sortieren Sie etwa fünfmal so viele Embryonen, wie präpariert werden. Dies sind die Spender für den Explan.

Bewahren Sie die restlichen zwei Zellembryonen während des gesamten Eingriffs in einer separaten Schale neben den Spenderembryonen auf, um als Geschwisterkontrollen für die Inszenierung des Plans zu dienen. Nachdem die Embryonen sortiert und seziert wurden, kehren Sie zu den Schalen im Inkubator zurück, um weitere einzellige und zweizellige Embryonen zu finden. Da die Teilung eines Zellembryos etwa 90 Minuten dauert, kann dies bis zu zwei Stunden nach der Eizellentnahme erfolgen.

Um den Explan vorzubereiten, legen Sie fünf bis 10 Embryonen in eine Sezierschale. Positionieren Sie dann den ersten Embryo so, dass die transparente Vitelmembran mit einer Pinzette gefasst werden kann. Er ist in der Regel nicht zu sehen, kann aber am Tierpol gegriffen werden, wo er durch einen klaren Peralraum über der Oberfläche des Embryos getrennt ist.

Fassen Sie mit einer geschärften Pinzette in einer Hand in einiger Entfernung von dem Blaster, der präpariert werden soll, um ihn nicht zu beschädigen. Fassen Sie dann mit einer geschärften Pinzette in der anderen Hand die Membran nahe der Spitze der anderen Pinzette und ziehen Sie vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen, um die Membran abzuziehen. Der Embryo flacht ab, wenn die Membran entfernt wurde.

Als nächstes greifen Sie mit der Pinzette nach einer benachbarten Zelle und verwenden diese Zelle als Griff, damit die zu präparierende Zelle nicht direkt mit der Pinzette berührt wird, in der anderen Hand ziehen Sie die restlichen Nachbarzellen vorsichtig von der gewünschten Lästerung weg. Wenn Zellen der Mittellinie, die das gleiche Schicksal teilen, ins Visier genommen werden, können sie zusammen als Paar entfernt werden. Trennen Sie abschließend die Griffzelle.

Nehmen Sie das Blasphemi- oder Amere-Paar mit einem sterilen Glas an der Pipette vorbei auf und vermeiden Sie Luftblasen und übermäßigen Sog. Legen Sie die Spitze der Weidepipette unter die Oberfläche des Kulturmediums in eine Vertiefung der X explan-Kulturschale und stoßen Sie den Blaster vorsichtig aus. Er sollte durch die Schwerkraft in die flache Vertiefung gleiten.

Gotteslästerer von mehr als einem Embryo können zu einem einzigen Explan kombiniert werden, indem man sie in der gleichen Vertiefung in einer Kultur deponiert. Nun, wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen Embryonen in der Sezierschale, einen nach dem anderen. Nach etwa 10 Embryonen wird die Sezierschale mit Zelltrümmern gefüllt.

Wechseln Sie in diesem Fall zur nächsten Sezierschale. Nachdem alle Dissektionen abgeschlossen sind, prüfen Sie, ob sich die Explans in den flachen Vertiefungen befinden. Wenn nicht, können sie mit einer Haarschlaufe, die in 70%igem Ethanol sterilisiert wurde, sanft in die Vertiefung geschoben und die Implantate etwa eine Stunde nach der letzten Dissektion bei Raumtemperatur auf der Bank luftgetrocknet inkubieren.

Entfernen Sie die Ablagerungen, die den geheilten Explan umgeben, mit einer sterilen Weidepipettenkultur aus Glas. Die Platte mit Explan bei 14 bis 20 Grad Celsius neben der Petrischale, in der sich die Geschwister-Kontrollembryonen befinden. Geschwisterembryonen zeigen das Entwicklungsstadium des Blasphemie-Plans an.

Nach etwa ein bis zwei Stunden in Kultur haben sich die explantierten Blastomere etwa viermal geteilt und den größten Teil der Überreste der geschädigten Nachbarzellen abgestoßen. Nach 20 Stunden bilden sie kleine robuste Kügelchen aus Zellen. Wenn die Geschwister das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben, ernten Sie den Explan.

Diese Explan überleben recht gut, auch wenn ein Teil der Zellen zerfällt. Wenn es also eine trübe Masse in der Kultur gibt, erkunden Sie sie mit einer Haarschlaufe oder einer Pinzette, um festzustellen, ob ein gesunder Explan darin vergraben ist. Nehmen Sie den Explan in einer kleinen Menge Kulturlösung mit einem Glas an Ihrer Pipette vorbei auf und geben Sie ihn vorsichtig in ein Fixiermittel oder einen Lysepuffer, der für den durchzuführenden Assay geeignet ist.

Zwei dorsale Blasphemiere oder zwei ventrale Blasphemere wurden im 16. Zellstadium präpariert und in einem XMBS bei 14 Grad Celsius kultiviert, bis die Geschwisterembryonen frühe Stadien der neuralen Platte erreichten. Jede Probe wurde auf die Expression einer zygotischen Neuralplatte untersucht. Gen Sox zwei durch in situ Hybridisierung, die als blaues Reaktionsprodukt angesehen wird.

Die Ergebnisse dieses Assays zeigen, dass die Mehrzahl der dorsalen tierischen Blasphemiere, die Vorläufer der neuralen Platte sind, SOX 2 autonom exprimieren können. Das heißt, ohne zusätzliche Signale aus anderen Regionen des Embryos. Diejenigen Explan, die SOX zwei nicht exprimieren, könnten zum Zeitpunkt der Sektion falsch identifiziert worden sein.

Im Gegensatz dazu exprimiert keiner der ventralen tierischen Lästerer, die Vorläufer der ventralen Epidermis sind, SOX zwei. Diese Daten deuten darauf hin, dass dorsale tierische Blasphemier eine intrinsische Fähigkeit haben, Nervengewebe zu bilden, während die ventralen tierischen Blasphemieren dies nicht bemerken. Einige der dorsalen Expläne haben auch eine längliche Morphologie, die auf die Bildung des dorsalen Mesoderms hinweist.

Diese Blastomere werden ebenfalls verblasst, um das Noor im intakten Embryo zu bilden, und eine Explankultur exprimiert ein Noor-Markerprotein, um die Wirkung der Veränderung der endogenen Spiegel eines mütterlich exprimierten neuronalen Gens zu testen. Fox D wurden fünf mRNAs in die acht Zellen ventralen Vorläufer-Blasphemeren injiziert. Wie hier gezeigt, exprimierte die Mehrzahl der ventralen Implantate SOX zwei.

Umgekehrt, wenn der endogene Spiegel von Fox D fünf durch Injektion von Antisense-Morph-Oligonukleotiden in die achtzelligen dorsalen Vorläuferblaster reduziert wurde, exprimierten nur wenige dorsale Explan SOX zwei. Diese Experimente deuten darauf hin, dass die mütterliche Expression von Fox D fünf eine Rolle bei der intrinsischen Fähigkeit von dorsalen Blasphemiern spielt, ein neuronales Schicksal vor diesem Verfahren zu erlangen. Andere Methoden, wie z. B. die Injektion von entweder mRNAs für den Funktionsgewinn oder Antisense-Morpho-Oligonukleotide für den Funktionsverlust in die zu präparierenden Blairs, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Welche Gene sind zum Beispiel an der intrinsischen Fähigkeit von Zellen beteiligt, ein bestimmtes Entwicklungsschicksal hervorzurufen? Darüber hinaus kann man bekannte Signalfaktoren testen, indem man dem Kulturmedium gereinigte Faktoren zusetzt. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um einzelne Gotteslästerer an neue Stellen im intakten Embryo zu transplantieren.

Diese Information ist entscheidend für die Definition der zellulären Mechanismen, durch die eine pluripotente embryonale Zelle zum Vorläufer eines definierten Gewebes wird.