LeafJ: Ein ImageJ Plugin für Semi-automatisierte Blattform Measurement
21. Januar 2013
Demonstration der wichtigsten Methoden für hohen Durchsatz Blatt Messungen. Diese Methoden können verwendet werden, um Blatt Phänotypisierung zu beschleunigen, wenn das Studium vieler Pflanzen-Mutanten oder anderweitig Siebanlagen für Blatt Phänotyp werden.
Ziel dieses Verfahrens ist es, die Blattformmessung für Hochdurchsatzexperimente zu automatisieren. Dazu werden zunächst die Blätter präpariert und mit einem Flachbettscanner abgebildet. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Blatt-J-Plugin zu verwenden, um die Blätter zu erkennen und zu messen.
Der dritte Schritt besteht darin, die Blätter für die Mikroskopie vorzubereiten und mit einem Verbundmikroskop zu fotografieren. Der letzte Schritt besteht darin, die Ausverkaufslinien auf den aufgenommenen Bildern mit einem Touchscreen-Tablet zu verfolgen. Letztendlich können die Ergebnisse durch diese Kombination der Bildanalyse Unterschiede in der Blattform, der Zellgröße und der Zellzahl zeigen.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden ist ihre Geschwindigkeit. Es ist etwa sechsmal schneller als die manuelle Messung. Die Einzelnen wussten, dass diese Methode schwierig sein könnte, da die richtige Blattplatzierung für die nachgelagerte Analyse entscheidend ist und weil das Anbringen von Blättern auf Objektträgern eine technische Herausforderung darstellen kann.
Ich hatte die Idee zu dieser Methode, als ich feststellte, dass wir etwa 15.000 Blätter zu analysieren hatten, und es von Hand zu machen, würde viele Monate dauern und unglaublich langweilig sein, da es zeigte, dass die Pflanzendissektionstechnik Neuro Zue verursachen würde. Ein Forscher aus meinem Labor Beginnt mit der Vorbereitung von 8,5 x 11 Zoll großen Transparentfolien. Jedes Blatt sollte in rechteckige Rahmen unterteilt werden, die groß genug sind, um die Blätter einer Pflanze aufzunehmen, und das zweite Blatt sollte sich zum bedruckten Blatt verjüngen, um als Abdeckung zu dienen, um ein Austrocknen der Blätter zu verhindern.
Etikettieren Sie mit der Pflanze, dem Genotyp und der Wachstumsbedingung. Sezieren Sie die Blätter der 26. Dayle-Pflanzen. Ordnen Sie die Blätter auf der Folie in taktischer Reihenfolge vom jüngsten zum ältesten an.
Positionieren Sie die Flügel vertikal innerhalb des Rahmens, ohne den Rand zu berühren oder andere Flügel zu überlappen. Andernfalls kommt es zu Problemen. Während der Analyse ist es wichtig, dass sich die orientalischen Blätter vertikal nicht berühren, rahmen, sich nicht überlappen Mit den Blättern angeordnet. Lege sie in ein Sandwich mit dem zweiten leeren Transparentblatt und einem Gitter, um die Blätter flach zu halten.
Generieren Sie dann ein Bild mit einem Flachbettscanner mit einer Auflösung von mindestens 600 Punkten pro Zoll. Beginnen Sie mit der Installation des Plugins. Laden Sie das Bild J herunter und ziehen Sie die Blatt-Jja-Datei in den Plugins-Ordner von Bild J.Wenn Bild J verwendet wird, ist das Blatt-J-Plugin jetzt verfügbar.
Fahren Sie mit dem Öffnen der Blattbilddatei in Bild J fort.Stellen Sie sicher, dass Image J Version 1.45 s oder höher ist. Teilen Sie das Bild in drei Farbkanäle auf: Rot, Grün und Blau, indem Sie auf Bildfarb-Split-Kanäle klicken. Wenden Sie als Nächstes einen Schwellenwert auf das Bild im blauen Kanal an.
Wählen Sie nun mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug alle Blätter einer Pflanze aus und wählen Sie dann das Blatt-J-Plugin aus. Das Plugin öffnet nun eine Box, in der die verschiedenen Bedingungen des Experiments eingestellt werden können, wie z. B. eine Versuchsgruppe und ein Genotyp. Bevor Sie fortfahren, bearbeiten Sie diese Optionen, wählen Sie dann die Bedingungen für ausgewählte Blätter in der Region von Interesse aus und geben Sie einen aussagekräftigen Namen ein.
Drücken Sie auf Weiter und Blatt J umrandet jedes Blatt automatisch mit einem eindeutigen ROI-Bild. J-Routinen passen die Ellipse an die Klinge an und berechnen bei Bedarf die Haupt- und Nebenachsen dieser Ellipse. Bearbeiten Sie die Trace-Linien mithilfe des ROI-Manager-Fensters.
Ein Touchscreen-Tablet, das als externer Monitor angeschlossen ist, kann für dieses Verfahren nützlich sein. Wenn die Grenzen korrekt definiert sind, führen Sie die Analyse durch Drücken aus. Okay, jetzt gibt Blatt J die Blütenblattlänge und verschiedene Geometrien der Blattspreite aus.
Exportieren Sie schließlich die Messergebnisse und die zugehörigen Informationen in eine Tabelle. Nachdem du die Blätter gescannt hast, fixiere sie in F-A-A-F-A. Ein fixiertes Laub kann bis zu sechs Monate bei vier Grad Celsius gelagert werden.
Gehen Sie ein oder zwei Stunden vor, bevor Sie die Blätter abbilden, reinigen Sie die Blätter, indem Sie das FAA-Fixiermittel gegen Chlorhydratlösung austauschen. Nach der Klärung montieren Sie die Blätter mit den Trichomen nach oben auf Objektträgern mit 40-facher Vergrößerung auf einem zusammengesetzten Mikroskopbild, wobei die Mesilschicht der Mitte jedes Blattes auf beiden Seiten der Hauptader liegt, wobei Zellen in der Nähe von Trichomen oder Venen vermieden werden. Um Schwierigkeiten bei der Bildbearbeitung zu vermeiden, ist es wichtig, beim Montieren von Blättern alle Luftblasen von Dias zu entfernen und im nächsten Schritt auch scharfe Bilder zu erhalten.
Nachdem Sie die gewünschten Bilder gesammelt haben, öffnen Sie eines in Bild J und zeichnen Sie die Umrisse der Blattzellen mit Hilfe des Bild-JROI-Manager-Tools mit Hilfe des Touchscreen-Tablets und eines Stifts nach. Dabei wird das LEAF J-Plugin nicht verwendet. Bevor LEAF J für Experimente verwendet wurde, wurde die Genauigkeit und Geschwindigkeit des Plugins mit der eines erfahrenen Forschers verglichen. Insgesamt.
Leaf J schloss 5,7 schneller ab als die manuellen Berechnungen und der Vergleich der Daten aus den beiden Methoden zeigte, dass die Ergebnisse für alle gemessenen Parameter der 3.532 verglichenen Parameter eng korreliert waren. Bei den Datenpunkten 172 handelte es sich um Ausreißer. Von diesen Ausreißern wurden 29 durch das LEAF J-Plugin verursacht, viel weniger als die 143, die durch menschliches Versagen verursacht wurden.
Bei der manuellen Messung wurde Blatt J seitdem aktualisiert, um die Anzahl der Fehler weiter zu reduzieren. Unter Vertrauen in die LEAF J-Messungen wurde es verwendet, um die Schattenvermeidung unter Verwendung eines Mixed-Effects-Modells zu testen. Behandlung und Blattzahl waren feste Effekte und die Replikation erfolgte als Zufallseffekt.
Viele Parameter wurden durch die Farbbehandlung signifikant beeinflusst. Alternativ wurden einige Parameter nicht signifikant durch die Verschattung beeinflusst. Mit Hilfe einer tablettengestützten bildgebenden Analyse von Zellparametern wurden 67 Genotypen von Arabidopsis ANA untersucht, die insgesamt 8.629 Zellen aus 877 Blättern von 224 Pflanzen umfassten.
Die Genotypen wurden dann in sechs Klassen eingeteilt. Die meisten Genotypen haben eine normale Zellgröße und -anzahl. Einige hatten jedoch eine größere Zellgröße bei normaler Zellzahl.
Obwohl es wichtig ist, dieses Verfahren auszuprobieren, um Randomisierung und experimentelles Design zu verwenden, wenn Du Deine Pflanzen anbaust, denke daran, dass die Arbeit mit Formaldehyd und Chlorhydrat extrem gefährlich sein kann. Daher sollten bei diesem Verfahren Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten im Abzug getroffen werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Hochdurchsatz-Screening von Blatt- und Zellform-Phänotypen unter Verwendung Ihrer eigenen experimentellen Bedingungen durchführen können. Nach diesem Verfahren sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Hochdurchsatz-Screening von Blatt- und Zellform-Phänotypen durchführen können.
Zusätzliche Methoden wie die RNA-Sequenzierung können verwendet werden, um Fragen zu beantworten, z. B. welche Gene effektiv formen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Artikel zeigt zentrale Methoden für die Hochdurchsatz-Messung von Blättern auf, die darauf abzielen, die Blatt-Phänotypisierung in Pflanzenstudien zu beschleunigen. Das Verfahren umfasst die Abbildung von präparierten Blättern und deren Analyse, um Unterschiede in der Blattform und in zellulären Eigenschaften aufzudecken.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzen-Phänotypisierung
- Bildanalyse
- Botanische Forschung
Hintergrund
- Die Messung der Blattform ist entscheidend für das Verständnis von Pflanzenmutanten.
- Hochdurchsatzmethoden können die Effizienz der Auswahl verbessern.
- Automatisierte Techniken verringern den manuellen Arbeitsaufwand und erhöhen die Genauigkeit.
- Bildanalyse liefert quantitative Daten zur Blattmorphologie.
Zweck der Studie
- Automatisierung der Blattform-Messung für Experimente mit hohem Durchsatz.
- Vereinfachung der Untersuchung pflanzlicher Mutanten durch effiziente Phänotypisierung.
- Verbesserung der Genauigkeit von Blattmessungen mithilfe fortschrittlicher Bildgebungstechniken.
Verwendete Methoden
- Präparation von Blättern, gefolgt von der Abbildung mit einem Flachbettscanner.
- Verwendung des Leaf J-Plugins zur Erkennung und Messung.
- Vorbereitung der Blätter für die Mikroskopie und Fotografie.
- Nachzeichnen von Zellkonturen auf Bildern mithilfe eines Touchscreen-Tablets.
Hauptergebnisse
- Zeigte Unterschiede in der Blattform zwischen verschiedenen Pflanzenmutanten auf.
- Quantifizierte Zellgröße und Zellanzahl mittels Bildanalyse.
- Stellte eine optimierte Methode für die hochdurchsatzfähige Blatt-Phänotypisierung bereit.
- Belegte die Wirksamkeit automatisierter Techniken in der botanischen Forschung.
Schlussfolgerungen
- Hochdurchsatzmethoden verbessern die Blatt-Phänotypisierung erheblich.
- Die automatisierte Bildanalyse ist ein wertvolles Werkzeug für die Pflanzenforschung.
- Zukünftige Studien können diese Methoden für weiterreichende Anwendungen nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Hochdurchsatz-Phänotypisierung beschleunigt die Zuordnung von Genen zu ihrer Funktion in der Pflanzenbiologie und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in der agrarischen Biotechnologie. Die automatisierte Messung von Blattform und Blattstiel ermöglicht eine schnelle Untersuchung von Mutanten unter Einfluss umweltbedingter Reize wie Schattvermeidung. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Verknüpfung von Genotyp mit phänotypischen Ergebnissen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch quantitative Analyse der Blattmorphologie.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch Standardisierung der Messung von Blattstiel-Länge und Blattspreite-Parametern.
- Prädiktiver Wert: Verbessert die Selektion von Projektportfolios, indem Blattmerkmale mit genetischen Modifikationen korreliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Verfahren zur Wirkstoff-Screening-Arbeitsabläufe vor.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch halbautomatisierte Bildanalyse.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Hochdurchsatzbewertung von Blattphänotypen in großen Mutantenpopulationen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet Übereinstimmung mit krankheitsrelevanten Systemen, indem umweltabhängige Merkmale wie schatteninduzierte Blattstielverlängerung gemessen werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch konsistente Quantifizierung von Blattmerkmalen.
- Risikominderung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem mechanistische Unklarheiten bei der phänotypischen Bildschirmung verringert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie Hypothesentests durch automatisierte Quantifizierung der Blattmorphologie ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen, indem genetische Störungen mit messbaren Veränderungen der Blattform verknüpft werden.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays und quantitative Ausgaben zur zuverlässigen Bewertung von Substanzen in Phänotypisierungsscreenings.
- Analytik: Erzeugt statistische Ergebnisse zu Blattstiellänge, Spreitenfläche und Zellmorphologie, um experimentelle Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem umweltrelevante Blattmerkmale über verschiedene Genotypen hinweg verfolgt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform für phänotypische Großanalysen von Blättern über mehrere Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung durch hochpräzise, varianzarme Blattmessungen.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Skalierbarkeit und reduziert den manuellen Aufwand um den Faktor ~6 im Vergleich zu manuellen Methoden.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem reproduzierbare phänotypische Daten für genetische Screening-Kampagnen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Genotypen basierend auf quantifizierten Blattmerkmalsantworten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Bildanalyse und der Pflanzenprobenpräparation.
- Benötigt einen Flachbettscanner (≥600 DPI) und ein Touchscreen-Tablet zur Korrektur der Begrenzungen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise für die Blattpräparation und -montage über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg voraus.
- Erfordert Anpassungen bei unterschiedlichen Blattgrößen und Modellsystemen jenseits von Arabidopsis.
- Ist durch technische Schwierigkeiten bei der Blattplatzierung und Objektträgermontage begrenzt, die die Qualität der nachfolgenden Analyse beeinträchtigen können.
