Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die ligandengesteuerte Ionenkanalfunktion in Neuronen aus akut präparierten Hirnschnitten zu untersuchen, die von erwachsenen Mäusen stammen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein intaktes Gehirn aus einer erwachsenen Maus extrahiert wird, die trans Cardi mit spezieller künstlicher Gehirnmarksflüssigkeit durchblutet wurde. Der zweite Schritt besteht darin, Hirnschnitte aus der interessierenden Hirnregion in der gewünschten Ausrichtung vorzubereiten.

Als nächstes werden einzelne Gehirnschnitte in einer Aufnahmekammer unter dem Mikroskop platziert und einzelne Neuronen innerhalb der Scheibe für die Aufzeichnung identifiziert. Der letzte Schritt ist die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung eines Neurons, gefolgt von der lokalen Applikation von Medikamenten, um die ligandengesteuerten Ionenkanäle mit einer zweiten Mikropipette aus Glas zu aktivieren. Letztendlich wird diese Methode zur Untersuchung ligandengesteuerter Ionenkanäle verwendet, um die biophysikalischen Eigenschaften nativer Rezeptoren auf lebenden Neuronen zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Badanwendung oder der YouTube-Wirkstoffabgabe besteht darin, dass die Wirkstoffabgabe an das aufgezeichnete Neuron sehr schnell und lokalisiert erfolgt. Kleine Mengen des Medikaments können verabreicht werden und mehrere Neuronen können mit einer einzigen Scheibe untersucht werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der nikotinischen Acetylcholinrezeptoren zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der nativen Nikotinrezeptoren, die an der biophysikalischen Zelle beteiligt sind, sowie biologische und verhaltensbezogene Reaktionen auf Nikotin.

Bei diesem Verfahren wird nach dem Opfern einer erwachsenen Maus und der Gewinnung des Gehirns das Gehirn in die gewünschte Ausrichtung getrimmt, um den interessierenden Bereich auf einer eisgekühlten Metallplatte einzuschließen. Befestigen Sie dann den Gehirnblock mit Sekundenkleber auf der trockenen Oberfläche eines vibrierenden Slicers. Tauchen Sie dann den Gehirnblock in eine vier Grad Celsius heiße NMDG-Rückgewinnungslösung und blasen Sie die Lösung kontinuierlich mit Carbogen.

Schneiden Sie anschließend die Scheiben mit einer Dicke von jeweils 250 Mikrometern aus dem interessierenden Hirnbereich ab. Ziehen Sie als Nächstes eine Standard-Patch-Mikropipette mit einem Widerstand von vier bis sechs Megaohm mit dem programmierbaren flammenden braunen Abzieher. Füllen Sie die Mikropipette mit einer geeigneten intrazellulären Aufzeichnungslösung.

Übertragen Sie dann eine Scheibe in die Aufnahmekammer auf dem Tisch eines aufrechten Mikroskops, füttern Sie die Scheibe kontinuierlich mit kohlensäurehaltigen 32 Grad Celsius Standard-Aufnahme-A-Liquor bei 1,5 bis 2,0 Millilitern pro Minute. Lokalisieren und zentrieren Sie unter dem Mikroskop den interessierenden Hirnbereich mit einem 10-fach-Luftobjektiv. Visualisieren Sie danach die einzelnen Neuronen mit einem 40-fachen Nahinfrarot-Wasserimmersionsobjektiv, das mit der IR-Differenzinterferenzkontrastoptik verbunden ist, und einem Hochgeschwindigkeits-Nahinfrarot-geladenen gekoppelten Gerät oder einer CCD-Videokamera. Unter IR-DIC-Beobachtung zeigen gesunde Neuronen nach der Zellvisualisierung eine glatte hellgraue Plasmamembran.

Führen Sie die Aufzeichnung ganzer Zellen mit herkömmlichen Techniken durch. Ziehen Sie nun wie zuvor eine weitere Standard-Patch-Clamp-Mikropipette, um zwei identische Schwesterspitzen aus demselben Stück Glas mit einem optimalen Widerstand von etwa fünf Megaohm herzustellen. Füllen Sie eine der Mikropipetten mit der Lösung des in kohlensäurehaltigen Standardaufzeichnung A verdünnten Arzneimittels auf. Richten Sie die Spitze nach unten und schnippen Sie mit der mit dem Arzneimittel gefüllten Mikropipette, um alle in der Mikropipette eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen.

Montieren Sie als Nächstes die mit Wirkstoffen gefüllte Mikropipette in einen Pipettenhalter, der am Mikrom-Manipulator befestigt ist. Der Pipettenhalter sollte mit einem Schlauch an ein geeignetes Druckabwurfsystem angeschlossen werden. Geben Sie den Druck drei- bis viermal manuell an die Mikropipette ab, um hinter der Flüssigkeitssäule einen ausreichenden Druck aufzubauen.

Senken Sie dann die Medikamentenpipette mit dem Mikrom-Manipulator mit I-R-D-I-C in die Scheibe ab. Beobachtung. Positionieren Sie die Mikropipette des Medikaments an der Oberfläche der Gewebescheibe. Führen Sie einen Druckabwurf aus und überwachen Sie die Umgebung der Spitze auf Bewegungen von Ablagerungen, die mit dem Abwurf und der Mikropipettenspitze in Verbindung stehen.

Bei Anzeichen dafür, dass die Spitze verstopft oder verstopft ist, ziehen Sie die Pipette zurück und ersetzen Sie sie durch eine neue. Nähern Sie sich der aufgezeichneten Zelle diagonal vom oberen Rand des Slices. Wenn sie sich in der endgültigen Position befindet, befindet sich die Spitze der mit Wirkstoffen gefüllten Pipette in der gleichen Brennebene wie die aufgezeichnete Zelle und die Spitze der Aufnahmeelektrode und ist etwa 10 bis 40 Mikrometer von der aufgezeichneten Zelle entfernt.

Wenn sich die mit Wirkstoff gefüllte Pipettenspitze über der aufgezeichneten Zelle befindet, könnte die Kraft des Druckauswurfs die Giga-Dichtung der Zelle stören und dann die von Acetylcholin und/oder Nikotin ausgelösten zellulären Ströme aufzeichnen, während die Neuronen im Spannungsklemmmodus gehalten werden. Obwohl die Druckunterdrückung bei Verwendung einer Pico-Schorle drei manuell ausgelöst werden kann, um reproduzierbarere Ergebnisse zu erzielen, ist es ratsam, die Druckunterdrückung über das Erfassungssystem und einen digitalen TTL-Impuls auszulösen. Um das Experiment zu verbessern, kann der mit Wirkstoffen gefüllte Pipettenhalter an einen eindimensionalen elektrischen Pizo-Konverter montiert werden, der in der Lage ist, einen analogen Spannungseingang aufzunehmen, der dann auf den hochpräzisen Mikromanipulator montiert wird.

Ein elektrischer Pizo-Translator ist nützlich, da die Bewegung der mit Wirkstoff gefüllten Pipette in und aus der Scheibe, einschließlich des Zeitpunkts und der Geschwindigkeit des Eintrittsaustritts, leichter kontrolliert und von Experiment zu Experiment reproduziert werden kann. Stellen Sie anschließend die Spannung mit dem manuell gesteuerten Potentiometer am elektrischen spannungsgesteuerten Verstärker pizo auf ihren Maximalwert ein. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die mit Medikamenten gefüllte Pipette in der Scheibe zu positionieren.

Ziehen Sie die Pipette zurück, indem Sie die Spannung am spannungsgesteuerten Pazo-Verstärker manuell auf Null reduzieren, indem Sie ein analoges Ausgangssignal vom Aufnahmeerfassungssystem verwenden. Bewegen Sie die mit Wirkstoff gefüllte Pipette in die Scheibe, bevor der TTL-Impuls des Druckabwurfs erfolgt. Nachdem der Impuls aufgetreten ist, ziehen Sie die Pipette zurück.

Diese Abbildung zeigt die repräsentative Reaktion eines Dopamin-Neurons auf 100 mikromolares Acetylcholin, das lokal aufgetragen wurde, und diese Abbildung zeigt die repräsentative Reaktion eines anderen Dopamin-Neurons auf 100 mikromolares Nikotin, das lokal aufgetragen wurde. Hier sind die spontanen Aktionspotentiale eines Dopamin-Neurons in einer Alpha-Sechs-L-Neun-Prime-S-Maus-Gehirnscheibe, die im Strom-Clamp-Modus gehalten wird. Die Anwendung eines Mikromolaren Nikotins mit einer Druckabweisung von 250 Millisekunden induzierte Änderungen der Wirkung, der potenziellen Feuerrate und des Ruhemembranpotentials.

Unter Verwendung der Schwellenwertsuche in der P-Clamp-Software wurde die momentane Feuerrate abgeleitet, um die Neuronen nach den Arten der Acetylcholin-Reaktion einzelner Neuronen superior Colus zu klassifizieren. In einer Alpha-Sechs-Liter-Maus-Gehirn-Scheibe mit neun Primes wurden die Spannung geklemmt, gefolgt von der lokalen Applikation von einem mikromolaren Nikotin über einen Druckauswurf vom Typ eins, zeigten Neuronen erhöhte IPCs. Nach der Nikotinapplikation zeigten Typ-2-Neuronen große Einströmungen und erhöhte EPCs als Reaktion auf die Nikotinapplikation.

Der elektrische Pizo-Übersetzer bietet Konsistenz und schützt vor dem Auslaufen von Medikamenten. Ein VTA-Dopamin-Neuron in einem Gehirnschnitt einer Alpha Six L Nine Prime S Maus wurde im Voltage Clap Mode aufgezeichnet. Während der Applikation eines mikromolaren Nikotins wurde die mit Nikotin gefüllte Pipette vor dem Druckauswurf in die Endposition manövriert und nach dem Auswurf mit einem Pazo-Elektrotranslator wieder zurückgezogen.

Eine zweite Reaktion wurde zwei Minuten nach der ersten aufgezeichnet, um zu zeigen, dass keine N-A-C-H-R-Desensibilisierung stattgefunden hatte. Die Experimente wurden unter Applikation von 10 mikromolaren Nikotin wiederholt. Auch bei der zweiten Reaktion wurde im Vergleich zur ersten keine Desensibilisierung beobachtet.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in nur drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. In einigen Fällen können innerhalb eines Tages 10 bis 15 Neuronen aus einer einzigen Gehirnscheibe untersucht werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die mit Medikamenten gefüllte Pipette genau zu positionieren, um ein Gleichgewicht zwischen der vollständigen Aktivierung der Nikotinrezeptoren an der Oberfläche und der Integrität der Giga-Dichtung aufrechtzuerhalten.