Name: Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Lernen Sie die lokale Medikamentenapplikation zur Untersuchung nikotinerger Acetylcholin-Rezeptoren in Hirnschnitten adulter Mäuse. Diese Patch-Clamp-Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Analysen lebender Neuronen.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) Gewährung DA030396 unterstützt. Dank an die Mitglieder des Drenan Labor für hilfreiche Diskussionen und Kritik des Manuskripts. Besonderer Dank geht an Mi Ran Kim für technische Hilfe und Jonathan Thomas Ting um Rat bezüglich erwachsenen Maus Hirnschnitten.

Ein. Herstellung von Lösungen für Brain Scheibe Vorbereitung und Elektrophysiologie <ol><li> Lösungen für die Herstellung von Hirnschnitten wurden bisher 3, 4 beschrieben. Planen N-Methyl-D-glucamin (NMDG)-basierten Schneiden und Recovery-Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mM): 93 N-Methyl-D-Glucamin, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 Glucose, 5 Na + Ascorbat, 2 Thioharnstoff, 3 Na + Pyruvat, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 • 2H 2 O. Passen Sie auf 300-310 mOsm mit NMDG. PH-Wert auf 7,3-7,4 mit 10 N HCl. <ol class="lalpha"><li> Lösen MgSO 4 • 7H 2 O und CaCl 2 • 2H 2 O in Millipore Wasser zu 2 M Stammlösungen von jedem machen. </li><li> Abzuwiegen anderen Komponenten in der angegebenen Reihenfolge und in eine teilweise gefüllte Messkolben mit Millipore-Wasser unter Rühren zu lösen. Sobald alles zugegeben, füllenMesskolben mit Millipore-Wasser. </li><li> Messen Sie den pH-Wert und die Einstellung mit 10 N HCl. </li><li> Messen Sie die Osmolarität und stellen Sie mit NMDG wenn nötig. </li></ol></li><li> Planen HEPES Halten künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF) der folgenden Zusammensetzung (in mM): 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 Glucose, 5 Na + Ascorbat, 2 Thioharnstoff, 3 Na + Pyruvat, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Passen Sie auf 300-310 mOsm mit Saccharose. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 mit 1 N HCl oder NaOH. <ol class="lalpha"><li> Abzuwiegen Komponenten in der angegebenen Reihenfolge und in eine teilweise gefüllte Messkolben mit Millipore-Wasser unter Rühren zu lösen. Sobald alles zugegeben, füllen Messkolben mit Millipore-Wasser. </li><li> Messung des pH-Wertes und Einstellen mit NaOH oder HCl, wenn nötig. </li><li> Messen Sie die Osmolarität und stellen mit Saccharose, wenn nötig. </li></ol></li><li> Standardlösungen aCSF Aufzeichnungs-Lösung folgender Zusammensetzung (in mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12,5 Glucose, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Passen Sie auf 300-310 mOsm mit Saccharose. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 mit 1 N HCl oder NaOH. </li></ol> 2. Vorbereitung der akuten Hirnschnitten <ol><li> Gehirnscheibe Schneiden und Wiederherstellung erfolgen wie zuvor 3, 4 beschrieben. Bubble zwei Kristall Gerichte mit NMDG Recovery-Lösung mit 95% Sauerstoff / 5% CO 2-Gas (Carbogen), eine Schüssel auf dem Eis, die andere bei 33 ° C gefüllt </li><li> Blase ein Kristall Schale mit HEPES Halten aCSF mit Carbogen bei Raumtemperatur gefüllt. </li><li> Anesthetize erwachsenen Maus (im Alter von 2 bis 12 Monaten) mit Na + Pentobarbital (200 mg / kg, ip). Fahren Sie mit dem Vorgang, wenn das Tier hat keine Antwort auf eine toe-Prise. </li><li> Falls erforderlich, einen Schwanz Gewebeprobe für eine spätere GenotypIng. des Tieres. </li><li> Öffnen Sie die Brusthöhle, Setzen Sie das Herz, und klemmen Sie die absteigende Aorta. Aufschlitzen den rechten Vorhof. </li><li> Transkardial perfundieren Tier mit 5-10 ml 0-4 ° C NMDG-Recovery-Lösung. </li><li> Enthaupten Tier, entfernen Sie das Gehirn und legen Sie es in 4 ° C NMDG-Recovery-Lösung für 1 min. </li><li> Auf einer eisgekühlten Metallplatte, schneiden das Gehirn in der gewünschten Ausrichtung (koronal, parasagittal, horizontal, etc.), um den Bereich in der Nähe sind. </li><li> Bringen Sie das Gehirn Block mit Sekundenkleber auf die trockene Bühne Oberfläche eines vibrierenden Allesschneider (DSK-Zero 1; Dosaka), tauchen das Gehirn Block in 4 ° C NMDG-Recovery-Lösung, und kontinuierlich bubble die Lösung mit Carbogen. </li><li> Angeschnitten des Gehirns Bereich von Interesse. Scheibendicke beträgt 200-400 um, abhängig von der spezifischen Gehirn interessierenden Bereich, tierische Alter und Experiment durchzuführen. </li><li> Unmittelbar nach dem Schneiden carbogenated inkubieren gewünschten Scheiben, 33 ° C NMDG-Recovery-Löauf genau 12 min, dann carbogenated, Raumtemperatur HEPES hält Lösung für einen anfänglichen Zeitraum von 60 min zu übertragen. Nach dieser 60 min Inkubation kann Scheiben für Aufnahmen verwendet werden. Scheiben werden in HEPES halten Lösung den ganzen Tag, bis sie für die Aufnahme verwendet werden beibehalten. </li></ol> 3. Patch Clamp Aufnahme von Neuronen im Gehirn Slices <ol><li> Ziehen Sie einen Standard-Patch-Mikropipette mit einer programmierbaren Flaming-Brown Puller (Sutter P-97 oder gleichwertig vertikale puller). Pipetten, die optimal für Giga-Ohm Dichtung Formation sind typischerweise einen Widerstand von 4-6 MOhm </li><li> Übertragen einer Scheibe zur Aufnahme Kammer (RC-27L; Warner Instruments) auf der Stufe eines aufrechten Mikroskop (Nikon FN-1). Kontinuierlich superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) die Scheibe mit carbogenated, Standard-Aufnahme aCSF erhitzt und bei 32 ° C gehalten Alternativ kann Scheiben bei Raumtemperatur gehalten werden. </li><li> Suchen und in der Mitte des Gehirns Bereich von Interesse mita 10X Luftobjektiv (Nikon Plan Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm). </li><li> Visualisieren einzelnen Neuronen mit einem 40X Nah-Infrarot-(IR-) Wasser Immersionsobjektiv (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) mit IR-Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Optik und einem High-Speed-nahen Infrarot charged coupled device (CCD) Videokamera (Hamamatsu C-7500). Unter IR-DIC Beobachtung, weisen gesunde Neuronen eine glatte, hellgraue Plasmamembran. </li><li> Füllen Sie eine Mikropipette mit einem geeigneten intrazellulären Recording-Lösung. Für die meisten Anwendungen, verwenden wir die folgende Lösung (in mM): 135 Kaliumgluconat, 5 EGTA, 0,5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP und 0,1 (pH-Wert auf 7,25 mit Tris-Base, Osmolarität eingestellt eingestellt auf 290 mOsm mit Saccharose). Stellen Sie eine whole-cell-Aufnahme von einer visualisierten Neurons. </li></ol> 4. Lokale Anwendung von Medikamenten zu Neuronen in Scheiben <ol><li> Ziehen Sie ein Standard-Patch-Clamp-Mikropipette wie oben beschrieben. Miteine Pipette Abziehvorrichtung wie eine Sutter P-97, die zwei identische &quot;Schwester&quot; Spitzen aus dem gleichen Stück Glas produziert, ist von Vorteil, wenn multiple drug Lösungen auf derselben Zelle verwendet werden sollen. Tip Größen, die einen Widerstand von ~ 5 MW haben würden, wenn sie mit der intrazellulären oben beschriebenen Lösung gefüllt wurden, sind optimal. </li><li> Hinterfüllung die Mikropipette mit einer Lösung des Wirkstoffs in carbogenated, Standard-Aufzeichnungs aCSF verdünnt. Richten Sie die Spitze nach unten, und Flick die Droge gefüllte Mikropipette, um Luftblasen in der Spalte der Lösung aufgefangen entfernen. </li><li> Montieren das Medikament gefüllte Mikropipette in einem Pipettenhalter mit Schlauch an einem geeigneten Druck Lastausstoßsystem wie eine Picospritzer III (General Valve Co.) verbunden ist. Der Pipettenhalter sollte auf einem Mikromanipulator mit der gleichen Auflösung montiert werden als Manipulatoren allgemein für Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet (z. B. Sutter MP-285). Außerdem sollte der Manipulator für diagonale Bewegungen in und aus der Scheibe zu ermöglichen. Mannmanuell auswerfen Druck 3 bis 4 Mal in die Mikropipette, um den Aufbau ausreichender Druck hinter der Säule der Flüssigkeit. </li><li> Mit den Mikromanipulator Kontrollen senken das Medikament Pipette in der Scheibe, während die Visualisierung der Spitze unter IR-DIC-Optik. Idealerweise sollte ein visuell zu identifizieren und in der Mitte ein Neuron aus aufgezeichnet werden, durch Positionieren des Medikaments Pipette nahe der Zelle vor dem Absenken des Aufzeichnungs Mikropipette in die Scheibe folgt. Positionieren der Pipette kann Medikaments Bewegung von Gewebe in der Nähe der Zelle, die die aufgezeichneten Aufzeichnungs stören könnte, wenn das Medikament Pipette in die Position nach Festlegung eines Gigaohm Dichtung bewegt verursachen. </li><li> Verwendung von IR-Video, das Medikament zu positionieren Mikropipette an der oberen Fläche des Gewebeschnitts. Ausführen ein Druck Ausstoßen und Monitor 1) der Umgebung der Spitze für eine Bewegung von Trümmern im Zusammenhang mit dem Ausstoßen, und 2) die Mikropipettenspitze auf Anzeichen, daß die Spitze verstopft oder blockiert. Wenn die Spitze blockiert / verstopft, zurückziehen pipette und ersetzen sie durch eine neue. </li><li> Nähern das aufgezeichnete Zelle diagonal von oben der Scheibe derart, dass, wenn in der Endposition ist die Spitze des Medikaments gefüllten Pipette 1) in derselben Fokalebene (oder leicht darunter) als aufgezeichnete Zelle und der Spitze der Aufzeichnungselektrode und 2) 10 bis 40 um aus dem aufgenommenen Zelle. Wenn das Medikament gefüllte Pipettenspitze ist oberhalb des aufgezeichneten Zelle könnte die Kraft von dem Druck Ausstoßen stören die Gigaohm Dichtung. </li><li> Notieren Sie die gewünschte zelluläre Reaktion, während die Zelle in Voltage-Clamp-Modus oder Stromzange Modus. Wir routinemäßig aufzeichnen Acetylcholin und / oder Nikotin-induzierte zelluläre Ströme, während Neuronen im Voltage-Clamp-Modus. Obwohl Druck Ausstoßen manuell ausgelöst werden kann, wenn unter Verwendung eines Picospritzer III, für mehr reproduzierbare Ergebnisse empfiehlt es sich, den Druck über das Ausstoßen Erfassungssystem (Axon Digidata 1440 und pClamp 10.3) mit einem digitalen TTL-Impuls auszulösen. </li></ol> 5. RegelungDie Drug-gefüllte Mikropipette mit einem piezoelektrischen Übersetzer <ol><li> Wenn möglich, den Wirkstoff gefüllten Pipettenhalter um ein eindimensionales piezoelektrischen Übersetzer (zB Piezojena PA-100 oder Burleigh PZM-150), die in der Lage zur Annahme eines analogen Spannungseingang (wiederum aus der Übernahme-System), welches dann ist befestigt auf der hochpräzisen Mikromanipulator (Sutter MP-285). Piezoelektrischer Übersetzer ist nützlich, da die Bewegung des Medikaments gefüllten Pipette in die und aus der Scheibe, einschließlich des Zeitpunkts und der Geschwindigkeit der Eingangs / Ausgangs, leichter beherrscht werden kann, und wiedergegeben von Experiment zu Experiment. Bei der Untersuchung von nAChR, die desensibilisierende Wirkung von Nikotin Leckage aus dem Arzneimittel gefüllten Pipette, sollten sie je vorkommen, werden minimiert, wenn die Pipette wird nur in der Nähe der Zelle mit einem piezoelektrischen Übersetzer verschoben auf den Augenblick der Druck Ausstoßen. </li><li> Mit dem manuell gesteuerten Potentiometer auf dem piezoelektrischen Spannungsregelverstärker, wählen Sie die Spannungum ihren maximalen Wert. </li><li> Mit dem Mikromanipulator, Position der Droge gefüllte Pipette in der Scheibe, wo die Pipette seinen Inhalt auf die aufgezeichneten Zelle wird ausgeworfen, und Einfahren der Pipette durch manuelle Reduzierung der Spannung auf Null auf dem piezoelektrischen Spannungsregelverstärker. </li><li> Verwendung eines analogen Ausgangssignals von dem Aufzeichnungs-Erfassungssystem, bewegen das Medikament gefüllten Pipette in das Segment über einen Zeitraum von 250 msec beginnend 300 msec bevor der Druck Ausstoßen TTL-Impuls auftritt. Einfahren der Pipette über einen Zeitraum von 250 msec, 50 msec beginnend nach der TTL-Impuls endet. </li></ol>

<ol><li>Tapper, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activation+of+%3F4%2A+receptors%3A+sufficient+for+reward%2C+tolerance%2C+and+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization.</a> Science. 306, 1029-1032 (2004).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+midbrain+dopamine+neurons+via+sensitized%2C+high-affinity+%3F6%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors.</a> Neuron. 60, 123-136 (2008).</li>
<li>Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).</li>
<li>Peca, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shank3+mutant+mice+display+autistic-like+behaviours+and+striatal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction.</a> Nature. 472, 437-442 (2011).</li>
<li>Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+interneuron+characteristics+and+nicotinic+properties+in+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum.</a> J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).</li>
<li>Pidoplichko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+activates+and+desensitizes+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons.</a> Nature. 390, 401-404 (1997).</li>
<li>Nashmi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+%3F4%2A+nicotinic+receptors%3A+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li>
<li>Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+selectively+enhances+%3F4%3F2%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).</li>
<li>Cohen, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+cholinergic+mechanisms+causing+elevated+dopamine+release+and+abnormal+locomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior.</a> Neuroscience. 200, 31-41 (2012).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+modulation+of+locomotion+and+striatal+dopamine+release+is+mediated+by+%CE%B16%CE%B24%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).</li>
<li>Grady, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+differences+determine+the+relative+selectivity+of+nicotinic+compounds+for+native+%CE%B14%CE%B22%2A-%2C+%CE%B16%CE%B22%2A-%2C+%CE%B13%CE%B24%2A-+and+%CE%B17-nicotine+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors.</a> Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).</li>
<li>Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+%CE%B16+and+%CE%B23+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).</li>
<li>Keath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+by+nicotine+of+substantia+nigra+versus+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).</li>
<li>Mansvelder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bupropion+inhibits+the+cellular+effects+of+nicotine+in+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area.</a> Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+largest+group+of+superficial+neocortical+GABAergic+interneurons+expresses+ionotropic+serotonin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors.</a> J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).</li>
<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+in+the+identification+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons.</a> PLoS One. 5, e15222(2010).</li>
<li>Margolis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ventral+tegmental+area+revisited%3A+is+there+an+electrophysiological+marker+for+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).</li>
<li>Couey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+network+actions+by+nicotine+increase+the+threshold+for+spike-timing-dependent+plasticity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex.</a> Neuron. 54, 73-87 (2007).</li>
<li>Yang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+nicotinic+acetylcholine+receptor+functional+phenotypes+of+rat+ventral+tegmental+area+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons.</a> J. Physiol. 587, 345-361 (2009).</li>
<li>Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+involved+in+facilitation+of+GABAergic+inhibition+in+mouse+superficial+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).</li>
<li>Bouzat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+structural+bases+of+activation+of+Cys-loop+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Paris%22%5BJournal%5D)">New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors.</a> J. Physiol. Paris. , (2011).</li>
</ol>

Das Verfahren in diesem Papier ist weitgehend nützlich für die Untersuchung Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Hirnschnitt Vorbereitungen. Es gibt jedoch eine Reihe von Faktoren wesentlich beeinflussen die Qualität und Reproduzierbarkeit der experimentellen Daten, die sich aus der Verwendung dieser Methode. Beispielsweise sind hervorgerufene Ströme sehr empfindlich auf den Durchmesser der Spitze des Arzneimittels gefüllten Pipette. Kleine Tipps werden Schwierigkeiten mit Ausstoßen der Arzneimittellösung und gro...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Name des Reagenz</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-Methyl-D-glucamin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaH<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaHCO<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Ascorbat</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thioharnstoff</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pyruvat</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgSO<sub&gt; 4</sub&gt; • 7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 230391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CaCl<sub&gt; 2</sub&gt; • 2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 223506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pentobarbital</td&gt;<td&gt; Vortech Pharmaceuticals</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kaliumgluconat</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mg-ATP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DSK-Zero 1 Vibrations-Allesschneider</td&gt;<td&gt; Ted Pella, Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; RC-27 Recording Kammer</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TC-344B Perfusion Heizungsregler</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SH-27B Lösung Heizer</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nikon FN-1</td&gt;<td&gt; Nikon</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 CCD Video Kamera</td&gt;<td&gt; Hamamatsu</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt; General Valve Co.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MP-285 Micromanipulator</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PA-100 Piezo-Übersetzer</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40 Piezoverstärker</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lokale anwendung von medikamenten zur nikotinischen acetylcholin-rezeptor-funktion in maus hirnschnitten studie

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tabakkonsum führt zu zahlreichen gesundheitlichen Problemen wie Krebs, Herzkrankheiten, Emphysem und Schlaganfall. Sucht nach Zigarettenrauchen ist eine weit verbreitete neuropsychiatrische Erkrankung, die von den biophysikalischen und zellulären Wirkungen von Nikotin auf Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren (nAChR) im gesamten zentralen Nervensystem beruht. Das Verständnis der verschiedenen nAChR Subtypen, in Hirnregionen, die für Nikotinsucht existiert ist eine wichtige Priorität. Experimente, die Elektrophysiologie Techniken wie whole-cell Patch-Clamp-oder Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Aufnahmen verwenden, sind für die pharmakologische Charakterisierung von nAChRs von Interesse nützlich. Exprimieren nAChRs, wie Säuger Gewebekulturzellen oder Xenopus laevis Oozyten sind galvanisch getrennt und können daher leicht studiert mit den Mitteln der modernen Pharmakologie. Große Fortschritte wurden gemacht mit diesen Techniken, insbesondere wenn die Target-Rezeptor bereits bekannt wurdend ektopische Expression wurde problemlos erreicht. Oft ist es jedoch notwendig, um nAChRs in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren: in Neuronen innerhalb Hirnschnitten akut vom Labor Mäusen oder Ratten geerntet. Beispielsweise exprimieren mice &quot;hypersensitiven&quot; nAChR-Untereinheiten wie α4 L9&#39;A Mäusen 1 und α6 L9&#39;S Mäusen 2, zur eindeutigen Identifizierung der Neuronen auf ihre funktionelle Expression eines spezifischen nAChR-Untereinheit basierend ermöglichen. Obwohl whole-cell Patch Clamp Messungen von Neuronen in Hirnschnitten wird routinemäßig durch den Fachmann Elektrophysiologen getan, ist es eine Herausforderung vor Ort gelten Drogen wie Acetylcholin oder Nikotin auf die aufgezeichneten Zelle innerhalb eines Hirnschnitt. Verdünnung der Wirkstoffe in die Superfusat (Badapplikation) nicht schnell reversible und U-Rohr-Systeme sind nicht leicht angepasst, um mit Hirnschnitten arbeiten. In diesem Papier beschreiben wir ein Verfahren zur schnellen Anwendung nAChR-aktivierende Medikamente Neuronen im erwachsenen m erfasstOuse Hirnschnitten. Standard Ganzzellableitungen aus Neuronen in Scheiben hergestellt, und ein zweites Mikropipette mit einem Medikament gefüllt ist von Interesse in Position in der Nähe der Zelle aufgenommen manövriert. Eine Injektion von Druckluft oder inerten Stickstoff in das Medikament gefüllten Pipette entsteht eine kleine Menge an Arzneimittel Lösung aus der Pipette auf die aufgezeichnete Zelle ausgestoßen werden. Mit dieser Methode sind nAChR-vermittelten Ströme können mit Millisekunden-Genauigkeit gelöst werden. Medikamentenapplikation mal leicht variiert werden, und das Arzneimittel gefüllten Pipette kann zurückgezogenen und mit einer neuen Pipette ersetzt werden, so dass für Konzentrations-Wirkungs-Kurven für ein einziges Neuron geschaffen werden. Obwohl im Rahmen der nAChR Neurobiologie beschrieben wurde, sollte diese Technik nützlich sein für die Untersuchung vieler Arten von Liganden-gesteuerte Ionenkanäle oder Rezeptoren im Gehirn Neuronen von Scheiben.

In unseren Experimenten haben wir routinemäßig von Dopamin (DA)-produzierenden Neuronen des ventralen Tegmentum (VTA) und der Substantia nigra pars compacta (SNC) aufzuzeichnen. Im Spannungs-Clamp-Modus wird Druckbeaufschlagung von Acetylcholin oder Nikotin an diese Zellen typischerweise in einer schnellen, einwärts Kationenstrom die Spitze erreicht innerhalb von 100 bis 200 ms (Fig. 1A-B) führen. Abklingen des Stroms wird weitgehend durch die Diffusion des Arzneimittels aus dem Wirkort diktiert, und ob...

In diesem Papier beschreiben wir eine nützliche Methode, um Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Neuronen akut isolierten Hirnschnitten studieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Arzneimittels, gefüllte Mikropipette zur lokalen Anwendung von Medikamenten, um unter Verwendung von Standard aufgezeichnet Neuronen Patch-Clamp-Techniken.

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die ligandengesteuerte Ionenkanalfunktion in Neuronen aus akut präparierten Hirnschnitten zu untersuchen, die von erwachsenen Mäusen stammen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein intaktes Gehirn aus einer erwachsenen Maus extrahiert wird, die trans Cardi mit spezieller künstlicher Gehirnmarksflüssigkeit durchblutet wurde. Der zweite Schritt besteht darin, Hirnschnitte aus der interessierenden Hirnregion in der gewünschten Ausrichtung vorzubereiten.Als nächstes werden einzelne Gehirnschnitte in einer Aufnahmekammer unter dem Mikroskop platziert und einzelne Neuronen innerhalb der Scheibe für die Aufzeichnung identifiziert. Der letzte Schritt ist die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung eines Neurons, gefolgt von der lokalen Applikation von Medikamenten, um die ligandengesteuerten Ionenkanäle mit einer zweiten Mikropipette aus Glas zu aktivieren. Letztendlich wird diese Methode zur Untersuchung ligandengesteuerter Ionenkanäle verwendet, um die biophysikalischen Eigenschaften nativer Rezeptoren auf lebenden Neuronen zu zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Badanwendung oder der YouTube-Wirkstoffabg

local-application-drugs-to-study-nicotinic-acetylcholine-receptor

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir haben eine neue Technik zur Quantifizierung nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors Veränderungen innerhalb subzellulären Regionen spezifischen Subtypen von ZNS-Neuronen zum besseren Verständnis der Mechanismen der Nikotinabhängigkeit, indem eine Kombination von Ansätzen einschließlich fluoreszierendes Protein Markierung des Rezeptors mit dem Knock-in-Ansatz entwickelt und spektrale konfokale Bildgebung.

Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin

Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Wir haben ein gen-chimäres Präparat des ventralen Hippocampus-Accumbens-Schaltkreises in vitro entwickelt, das eine direkte Live-Bildgebung ermöglicht, um präsynaptische Mechanismen der durch nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChRs) vermittelten synaptischen Übertragung zu analysieren. Dieses Präparat bietet auch einen informativen Ansatz zur Untersuchung der prä- und postsynaptischen Mechanismen der synaptischen Plastizität.

Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

Dieses Protokoll veranschaulicht die Implementierung einer optimierten N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) schützende Wiederherstellungsmethode der Gehirn-Scheibe-Vorbereitung. Eine einziges Medium Formulierung wird verwendet, um Tiere jeden Alters und für verschiedenste experimentelle Anwendungen zuverlässig gesunde Gehirnscheiben einzuholen.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

Eine validierte computergestützte Testbatterie neuropsychologische und neurophysiologische wird verwendet, um die Pharmakodynamische Wirkungen auf das zentrale Nervensystem neu entwickelte Medikamente in der frühen Phase der Entwicklung zu studieren. Um die Testbatterie zu demonstrieren, werden die akuten Wirkungen von Mecamylamin und die Umkehrung dieser Effekte durch zwei Agonist Drogen beschrieben.

Eine computergesteuerte Testbatterie Pharmakodynamische Wirkungen auf das zentrale Nervensystem cholinerge Medikamente in der frühen Phase Medikamentenentwicklung zu studieren

Wir präsentieren eine Methode, die bieten weitere Einblicke in die frühe Ereignisse zugrunde liegenden Neurodegeneration und basiert auf der etablierten Ex-Vivo -Gehirn-Technik verbindet die Vorteile eines in Vivo und in Vitro Experimente. Darüber hinaus stellt es eine einzigartige Gelegenheit zum direkten Vergleich von behandelten und unbehandelten Gruppe in der gleichen anatomischen Ebene.

Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren

Mikroglia, die ansässigen Immunzellen des Gehirns, reagieren schnell auf Änderungen ihrer Umgebung mit morphologischen Veränderungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie zwei-Photonen-Mikroskopie zu verwenden, um die Anziehungskraft der Mikroglia Prozesse gegenüber Serotonin oder ATP in akuten Hirnschnitten von Mäusen zu studieren.

Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung von Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) in Maus Hirnschnitten von Nikotin uncaging. Wenn gepaart mit gleichzeitiger Patch Clamp Aufnahme und 2-Photonen-Laser-scanning-Mikroskopie, verbindet Nikotin uncaging Nikotinsäure Rezeptor-Funktion mit zellulären Morphologie, bietet ein tieferes Verständnis der cholinergen Neurobiologie.

Sondieren Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Gehirnscheiben per Laser Flash Photolyse von Photoactivatable Nikotin

Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung des Gleichgewichts zwischen Glutamatfreisetzung und Clearance bei einzelnen kortikostriatalen glutamatergen Synapsen in akuten Scheiben von erwachsenen Mäusen. Dieses Protokoll verwendet den Fluoreszenzsensor iGluu zur Glutamaterkennung, eine sCMOS-Kamera zur Signalerfassung und ein Gerät zur fokalen Laserbeleuchtung.

Einzelne Synapsenindikatoren für Glutamatfreisetzung und Aufnahme in akuten Gehirnscheiben von normalen und Huntington-Mäusen

Diese Methode führt eine einfache Technik zum Nachweis der endogenen Monoaminfreisetzung unter Verwendung akuter Hirnschnitte ein. Das Setup verwendet eine 48-Well-Platte, die einen Gewebehalter für die Monoaminfreisetzung enthält. Freigesetztes Monoamin wird mittels HPLC in Verbindung mit elektrochemischem Nachweis analysiert. Darüber hinaus bietet diese Technik eine Screening-Methode für die Arzneimittelentdeckung.

Ein plattenbasierter Assay zur Messung der endogenen Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten

Dieses Protokoll beschreibt die Expression und Quantifizierung neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptor-Untereinheiten mittels der säugetierischen Neuro-2a-Zelllinie. pH-empfindliche fluoreszierende Tags und konfokale Mikroskopie ermöglichen eine präzise Bewertung der Rezeptorlokalisierung an der Plasmamembran im Vergleich zu denen, die in pH-neutralen intrazellulären Kompartimenten exprimiert werden, was die Untersuchung des nAChR-Transports und der pharmakologischen Modulation...

Lokalisierung der Plasmamembran und intrazellulärer neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptoren mittels quantitativer Bildgebung in Säugetierzellen

Lernen Sie die lokale Medikamentenapplikation zur Untersuchung nikotinerger Acetylcholin-Rezeptoren in Hirnschnitten adulter Mäuse. Diese Patch-Clamp-Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Analysen lebender Neuronen.

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

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