Name: Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation In vivo Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Lernen Sie die CoTrAC-Methode zur Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation in lebenden E. coli-Zellen. Diese Technik ermöglicht die nicht-invasive Beobachtung von Transkriptionsfaktoren mit hoher Auflösung.

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Das Plasmid pCG001 Ausdruck UBP1 wurde freundlicherweise von Rohan Baker an der John Curtin School of Medical Research. Diese Arbeit wurde von March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 und NSF CAREER Award 0.746.796 finanziert.

Ein. Belastung Engineering Workflow <ol><li> Legen Sequenzen kodiert (a) eine Membran-Lokalisierungssequenz, (b) eine schnell reifenden fluoreszierendes Protein und (c) eine Protease-Erkennungssequenz N-terminal zu und im Leserahmen mit einem Protein von Interesse (zB ein Transkriptionsfaktor). Wir verwendeten die Membran gezielt Tsr-Venus Reporter 2 und fusioniert an die Protease Erkennungssequenz Ubiquitin (Ub), die Anzahl der Bakteriophage λ ausgedrückt Repressor CI Proteinmoleküle zählen. Einzelheiten über konstruierten wir das Fusionsprotein Tsr-Venus-Ub-CI, Ersetzen des Wildtyp-CI Kodierregion und Einbringen des Konstrukts in die E. coli-Chromosom mit λ Red Rekombination 3, sind im Detail in ref beschrieben. Ein. </li><li> Überprüfen Sie alle Änderungen durch Sequenzierung. </li><li> Transformieren eines Plasmids, das eine Protease spezifisch für die Erkennungssequenz oben in einen Stamm, der die fluoreszierende Reporter und Protein von Interesse verwendetin translationale Fusion. Wir verwendeten die Protease UBP1, die sofort spaltet nach der C-terminale Rest 4 Ubiquitin. </li></ol> 2. Kultur Cells und Probe vorbereiten <ol><li> Wählen Sie ein E. coli-Kolonie von Interesse aus einer frisch ausgestrichenen Agarplatte in 1 ml M9 Minimalmedium 5 mit 1X MEM Aminosäuren und geeigneten Antibiotika ergänzt. Inkubieren in einem Schüttler bei gewünschte Temperatur lange genug, um zu erreichen OD 600&gt; 1,0 (optische Dichte bei 600 nm). </li><li> Verdünnen Sie die Kultur in 1 ml frischem M9-Medium mit geeigneten Antibiotika zur OD 600 = 0,02. Inkubieren in einem Schüttler bei geeigneter Temperatur. Initial Zelldichte erhöht werden, wenn für die Tieftemperatur-Wachstum benötigt werden. </li><li> Wenn die OD 600 = 0,2-0,3 (bei ​​37 ° C mit einem anfänglichen Zellkultur bei OD 600 = 0,02, dies wird 3-4 Stunden dauern kann), beginnen die Vorbereitung der Agarosegel-Pad (Schritt 3). </li><li> Die Zellen sind zur Bildgebung bereit, wenn OD <sub&gt; 600 = 0,3-0,4. </li><li> Übertragen 1 ml inkubierten Kultur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Zentrifuge bei 10.000 xg für 1 min in einem Tischgerät Mikrozentrifuge. </li><li> Überstand verwerfen und 1 ml frisches Medium M9 und das Pellet vorsichtig. </li><li> Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1 Minute. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1,6 und 1,7. Überstand verwerfen. </li><li> Vorsichtig in 1 ml M9-Medien resuspendieren. Bis 100-fache zu geringen Zelldichten für timelapse Bildgebung sicherzustellen - Zellen können direkt für Mikroskopabbildanordnung oder verdünntem 10 verwendet werden. Beachten Sie, dass geringen Zelldichten wichtig sind für längere timelapse Bildgebung. Die Abbildungskammer (Schritt 4) während des Experiments abgedichtet. Durch exponentielle Wachstum der Zellen, können hohe anfängliche Zellkonzentration signifikant zum Abbau Sauerstoff in die Kammer nach längerer Wachstum in der Gel-Pad, wodurch fluoreszierende Protein Reifung und beeinflussen Zellwachstum. </li></ol> 3. Bereiten Sie die Agarose-Lösung <ol><li> Wiegen 10-20 mglow-Schmelztemperatur Agarose in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Fügen Sie entsprechende Volumen M9 Minimalmedium ohne Antibiotika, um eine 3% igen Lösung herzustellen. </li><li> Erwärmen der Agarose-Lösung für 30 min bei 70 ° C zu schmelzen, Invertieren des Rohres zu gewährleisten, dass die Lösung vollständig geschmolzen und homogen ist. Das Gelkissen kann an diesem Punkt (Schritt 4) gegossen werden, oder die Temperatur kann auf 50 ° C gesenkt werden und dort für mehrere Stunden zur späteren Verwendung. </li></ol> 4. Bereiten Gel Pad auf der Kammer <ol><li> Etwa 50 min vor der Bildgebung, spülen ein Microaqueduct Rutsche mit Wasser. </li><li> Lidspalt ein Deckglas reinigen (mit einem strengen Reinigungsverfahren wie das in 6 beschrieben) und Microaqueduct Schlitten mit sterilem Wasser und trocken durch Abblasen mit Druckluft. </li><li> Platzieren Sie die Gummidichtung auf den Schieber Microaqueduct so dass er die Ein-und Auslässe auf der Glasseite der Microaqueduct Schieber (deckt diese für Anwendungen im modifiziert werdenwelche Medien durch die Probe perfundiert). Anwenden 50 ul Agaroselösung (Schritt 3) in der Mitte des Schiebers Microaqueduct. </li><li> Ganz oben auf der Agarose-Lösung mit dem gereinigten, trockenen Deckglas. </li><li> Lassen Sie die Agarose-Lösung bei Raumtemperatur stehen für 30 min. </li><li> Unterdessen bereiten eine Zellprobe (Schritt 2). </li><li> Ziehen Sie vorsichtig die Glasabdeckung von der Spitze des Gel-Polster. Fügen Sie 1,0 ul gewaschene Zellkultur an die Spitze des Gel-Polster. Warten für ~ 2 Minuten für die Kultur von der Gel-Polster absorbiert werden. Es ist wichtig, nicht so lange zu warten, dass die Gel-Polster overdries, aber lang genug, dass die Zellen richtig auf das Gel Pad eingehalten werden. Das Ideal Wartezeit wird mit Temperatur und Luftfeuchtigkeit variieren. </li><li> Während des Wartens, trocknen anderen vorgereinigte Deckglas. </li><li> Decken Sie die Probe mit dem neuen Deckglas sicherzustellen, dass das Deckglas und Microaqueduct Objektträgers ausgerichtet sind. </li><li> Montieren Sie den temperierten Klimakammer nach den Anweisungen des Herstellers.Es kann nun zur Abbildung auf Mikroskop (Schritt 5) verwendet werden. </li></ol> 5. Imaging und Erwerb von Timelapse Filme <ol><li> Einschalten des Lasers und Mikroskop nach Herstellerangaben (zB der Laser muss möglicherweise aufgewärmt für ~ 0,5 Stunden vor dem Experiment). </li><li> Verriegeln Sie den zusammengesetzten Kammer auf die Bühne Einsatz am Mikroskop. Stellen Sie die Temperatur der Wachstumskammer und des Ziels Heizeinrichtung bei 37 ° C oder eine andere gewünschte Wachstumstemperatur. </li><li> Wenn Bildgebung oberhalb der Raumtemperatur, wird der Fokus oder die Gel-Polster in der Regel deutlich driften für ~ 15 min nach der anfänglichen Temperatur-Verschiebung. In der Praxis diese Zeit nutzen, um Bereiche von Interesse zu finden und zu ändern Bildgebung Script als notwendig für ein Experiment. </li><li> Finden Zellen auf dem Mikroskop und Speichern der Position einer jeden Zelle nach Zentrierung er innerhalb eines vordefinierten und ausgerichtet Bildgebungsregion. Mehr als eine Zelle in jeder Bildaufnahmezeit Fenster abgebildet werden. Für timelapse Abbildung über mirgendwelche Generationen, damit abgebildeten Zellen zunächst von anderen Zellen durch mindestens ein paar hundert um getrennt, so dass andere Kolonien nicht betreten wird die Bildgebungsregion während des Wachstums. </li><li> Passen Laseranregung Intensität, so dass fast alle fluoreszierende Moleküle Photobleichmittels innerhalb von 6 Aufnahmen (Abbildung 5). </li><li> Mit Hilfe eines automatisierten Imaging-Skript / journal erwerben timelapse Daten mit Hilfe des Algorithmus in der experimentellen Workflow in Abbildung 3 beschrieben. </li></ol>

<ol><li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells%2C+One+Protein+Molecule+at+a+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2(2001).</li>
<li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXiao%2C+J+%22Single+Molecules%3A+a+laboratory+manual%22">Single Molecules: a laboratory manual</a>. , 149-169 (2007).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li>
<li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li>
</ol>

Wir haben keine Angaben.

Die CoTrAC Verfahren kann verallgemeinert werden, um die Produktion von anderen Proteinen, wo herkömmliche N-oder C-terminale Fusionen fluoreszierendes Protein-Protein-Aktivität zerstören kann messen. Die CoTrAC Strategie hat drei einzigartige Vorteile gegenüber den derzeitigen Methoden. Erstens sorgt co-translationale Fusion, daß ein Molekül des fluoreszierenden Reporter für jedes Molekül des Proteins von Interesse hergestellt wird, was eine genaue Zählung der Proteinproduktion in Echtzeit. Zweitens die Membran gezielt...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Agarose (Low Schmelztemperatur) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q-H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × M9-Salze </td><td></td><td></td><td> Folgende Rezept in 9 beschrieben </td></tr><tr><td> 20% Glucose </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 × MEM Aminosäurelösung </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatur-Controlled GrowthKammer Tischadapter </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Ziel Heater </td><td> Bioptechs </td><td> Modell hängt Mikroskopobjektiv </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Slide </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Deckgläser </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Kann schwierig sein Quelle; ebenfalls erhältlich von Bioptechs </td></tr><tr><td> Deckglas / slide Dichtung </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Verschiedene </td><td> Beispiel setup: Coherent Innova 308C Argon-Ionen-Laser, Olympus IX-81 Mikroskop Olympus PlanApo 100X NA 1,45 Ziel, Metamorph-Software </td><td> Muss Laseranregung, automatisierte xyz Bühne, Automatisierungs-Software in der Lage ist scripted Bildgebung und Autofokus, Optik in der Lage Resolvin habeng einzelner fluoreszierender Proteine </td></tr><tr><td> EM-CCD-Kamera </td><td> Verschiedene </td><td> Beispiel setup: Andor Ixon DU-898 </td><td> Muss niedrig genug Lärm haben, einzelne fluoreszierende Proteine ​​über den Hintergrund erkennen </td></tr></tbody></table>

einzel-molekül-imaging der genregulation<em&gt; in vivo</em&gt; verwenden cotranslationalen aktivierung durch spaltung (cotrac)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Wir beschreiben ein Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, Co-translationale Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC) zur Abbildung der Herstellung von Protein-Molekülen in lebende Zellen mit Einzel-Molekül-Präzision ohne Stören des Proteins Funktionalität. Dieses Verfahren macht es möglich, die Zahl der Proteinmoleküle in einer Zelle während sequentiell, fünfminütigen Zeitfenster produziert zählen. Es erfordert ein Fluoreszenzmikroskop mit Laseranregung Leistungsdichte von ~ 0,5 bis 1 kW / cm 2, die empfindlich genug, um einzelne Moleküle fluoreszierende Protein in lebenden Zellen nachzuweisen ist. Das fluoreszierende Reporter in diesem Verfahren verwendet wird, besteht aus drei Teilen: eine Membran-Targeting-Sequenz, eine Fast-Reifung, gelb fluoreszierendes Protein und ein Protease-Erkennungssequenz. Der Reporter translatorisch an den N-Terminus eines Proteins von Interesse fusioniert ist. Zellen werden auf einer Temperatur-gesteuerten Mikroskoptisch gewachsen. Alle fünf Minuten werden fluoreszierende Moleküle in Zellen abgebildet (und später coUNTED durch die Analyse von Fluoreszenz-Bildern) und anschließend Lichtgeschädigte so dass nur neu übersetzt Proteine ​​in der nächsten Messung gezählt. Fluoreszenzbilder aus diesem Verfahren kann durch Erfassen Fluoreszenzpunkte in jedem Bild, ihre Zuordnung zu einzelnen Zellen und dann Zuweisen Zellen Zelllinien analysiert werden. Die Anzahl von Proteinen innerhalb eines Zeitfensters in einer gegebenen Zelle erzeugt wird durch Dividieren der integrierten Intensität der Fluoreszenz von Flecken durch die durchschnittliche Intensität der einzelnen fluoreszierenden Moleküle berechnet. Wir verwendeten diese Methode zum Expressionslevel in dem Bereich von 0-45 Molekülen in einzelnen Zeitfenstern 5 min zu messen. Dieses Verfahren ermöglichte es uns, Rauschen in dem die Expression des λ-Repressor CI messen, und hat viele andere potentielle Anwendungen in Systembiologie.

Typische Ergebnisse aus einem Versuch CoTrAC Verfolgen der Herstellung des λ-Repressor CI sind in den 4 und 5 gezeigt. In diesem Experiment wurden 12 Kolonien in 5 min Intervallen abgebildet. Zu jedem Zeitpunkt wurde die erste Kolonie autofocused und zentralisiert innerhalb der Bildgebungsregion. Als nächstes wurde die mittig / fokussierte Position gespeichert und ein Hellfeld Bild erworben wurde. Die Stufe wurde dann von ~ 0,5 um entlang der z-Achse von der translozier...

Wir beschreiben ein Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, Co-translationale Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC), zur Abbildung der Herstellung von Protein-Molekülen in lebende Zellen mit Einzel-Molekül-Präzision ohne Stören des Proteins Funktionalität. Dieses Verfahren wurde verwendet, um die Expression stochastische Dynamik eines Transkriptionsfaktors, dem λ-Repressor CI folgen<sup&gt; 1</sup&gt;.

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, Zeitraffer-Fluoreszenzbilder von wachsenden E-Coli-Kolonien zu erhalten, wobei Co-Track-Konstrukte exprimiert werden, um die Anzahl der neu produzierten Proteinmoleküle zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Zellprobe präpariert wird, wobei Coex ein Protein von Interesse exprimiert, das mit einem fluoreszierenden Cora-Reporter fusioniert ist, und eine Protease, die spezifisch zwischen dem Cora-Reporter und dem Protein von Interesse spaltet. Der zweite Schritt besteht darin, ein Gel mit niedriger Schmelztemperatur Aris herzustellen, das mit M neun minimalen Medien hergestellt wird.Als nächstes wird ein AROS-Gel-Pad für die Verwendung mit einer temperierten Probenkammer vorbereitet. Die E-Coli-Zellen werden auf das Gel gelegt und die Kammer wird zusammengebaut. Der letzte Schritt besteht darin, die Kammer auf ein Fluoreszenzmikroskop zu stellen und mehrere wachsende Zellkolonien in regelmäßigen Abständen über mehrere Generationen hinweg abzubilden.Das Photobleichen neu produzierter TRE-Berichtsmoleküle in jedem Intervall aller letztendlich re wird verwendet, um Zeitspuren der Proteinproduktion in lebenden Zellen mit Einzelmolekül- un

single-molecule-imaging-gene-regulation-vivo-using-cotranslational

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

RNA-Polymerase II Transkription Kinetik auf bestimmte Gene in lebenden Zellen gemessen. mRNAs aus dem Gen von Interesse transkribiert werden fluoreszenzmarkierten und mit Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der in vivo Kinetik von Transkriptions-Dehnung erhalten werden.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine optogenetische Strategie zur Modulation der mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) Aktivität während der Zelldifferenzierung und der Xenopus embryonalen Entwicklung. Diese Methode ermöglicht die reversible Aktivierung des MAPK-Signalwegs in der Säugerzellkultur und in multizellulären Lebendorganismen wie Xenopus- Embryonen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Lichtvermittelte reversible Modulation des mitogenaktivierten Proteinkinase-Pathways während der Zelldifferenzierung und<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Entwicklung

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Hier beschreiben wir das Standardprotokoll für die Erkennung von β-Galaktosidase Aktivität in frühen ganze Maus-Embryonen und die Methode für die Paraffin-Schnitt und gegenfärbung. Dies ist ein einfaches und schnelles Verfahren, Genexpression während der Entwicklung zu überwachen, auch die Gewebeschnitte, angewendet werden können, Organe oder kultivierten Zellen.

Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen

Verordnung der Chromatin-Umgebung ist ein wesentlicher Prozess erforderlich für die ordnungsgemäße Genexpression. Hier beschreiben wir eine Methode zur Steuerung der Genexpression durch die Rekrutierung von Chromatin-modifizierende Maschinen Gen-spezifischen und reversibel.

Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte erforderlich, um ein Modellsystem, in dem die Transkription des endogenen Gens von Interesse bedingt gesteuert werden kann, in lebenden Tieren oder Zellen mit verstärkten Lac Repressor und/oder Tet Aktivator Systeme generieren.

In-vivo Anwendung der REMOTE-Steuerung für die Manipulation von endogenen Genexpression

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Genregulation. Das Verfahren birgt jedoch Schwierigkeiten bei der Erlangung reproduzierbarer Chromatinfragmentierung durch mechanisches Scheren. Hier bieten wir ein verbessertes Protokoll für einen ChIP-Assay mit enzymatischer Verdauung.

Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

Neurale Stamm-/Vorläuferzellen weisen verschiedene Expressionsdynamiken von Notch-Signalkomponenten auf, die zu unterschiedlichen Ergebnissen zellulärer Ereignisse führen. Eine solche dynamische Expression kann durch Echtzeitüberwachung und nicht durch statische Analyse mit einem hochempfindlichen Biolumineszenz-Bildgebungssystem, das die Visualisierung schneller Veränderungen von Genausdrücken ermöglicht, aufgedeckt werden.

Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Das Nachverfolgen einzelner Übersetzungsereignisse ermöglicht hochauflösende kinetische Studien von kappenabhängigen Translationsmechanismen. Hier zeigen wir einen in vitro Einzelmolekül-Assay basierend auf bildgebenden Wechselwirkungen zwischen fluoreszierend markierten Antikörpern und epitopmarkierten aufkommenden Peptiden. Diese Methode ermöglicht die Einzelmolekülcharakterisierung der Initiations- und Peptiddehnungskinetik während der aktiven in vitro capabhängigen Translation.

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Diese Arbeit beschreibt eine Methode für Hochdurchsatz-Experimente mit einem 3D-gedruckten LED-Array, um die lichtinduzierbare Genexpression in HEK293T Zellen zu optimieren.

Schnelle Optimierung eines lichtinduzierbaren Systems zur Kontrolle der Genexpression von Säugetieren

Lernen Sie die CoTrAC-Methode zur Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation in lebenden E. coli-Zellen. Diese Technik ermöglicht die nicht-invasive Beobachtung von Transkriptionsfaktoren mit hoher Auflösung.

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation

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