Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation In vivo Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

Ziel dieses Verfahrens ist es, Zeitraffer-Fluoreszenzbilder von wachsenden E-Coli-Kolonien zu erhalten, wobei Co-Track-Konstrukte exprimiert werden, um die Anzahl der neu produzierten Proteinmoleküle zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Zellprobe präpariert wird, wobei Coex ein Protein von Interesse exprimiert, das mit einem fluoreszierenden Cora-Reporter fusioniert ist, und eine Protease, die spezifisch zwischen dem Cora-Reporter und dem Protein von Interesse spaltet. Der zweite Schritt besteht darin, ein Gel mit niedriger Schmelztemperatur Aris herzustellen, das mit M neun minimalen Medien hergestellt wird.

Als nächstes wird ein AROS-Gel-Pad für die Verwendung mit einer temperierten Probenkammer vorbereitet. Die E-Coli-Zellen werden auf das Gel gelegt und die Kammer wird zusammengebaut. Der letzte Schritt besteht darin, die Kammer auf ein Fluoreszenzmikroskop zu stellen und mehrere wachsende Zellkolonien in regelmäßigen Abständen über mehrere Generationen hinweg abzubilden.

Das Photobleichen neu produzierter TRE-Berichtsmoleküle in jedem Intervall aller letztendlich re wird verwendet, um Zeitspuren der Proteinproduktion in lebenden Zellen mit Einzelmolekül- und Einzelzellauflösung zu erfassen. Der Vorteil dieser Technik gegenüber ex-Einzelzellmessungen unter Verwendung der Fluoreszenzproteinfusion besteht darin, dass die Produktion von Proteinmolekülen mit dem Einzelmolekülverfahren verfolgt werden kann und das Ergebnis die Funktionen des Moleküls beeinflusst. Um den Stamm zu erzeugen, fügen Sie Sequenzen ein, die für eine Membranlokalisierungssequenz, ein schnell reifendes fluoreszierendes Protein und eine Proteaseerkennungssequenz kodieren und mit einem Protein, das in diesem speziellen Fall von Interesse ist, einem Transkriptionsfaktor oder tf, und in einem Rahmen.

Bei diesem Verfahren wurde der membrangerichtete venöse TSR-Reporter verwendet. Der Reporter wurde mit der Proteaseerkennungssequenz Ubiquitin fusioniert, um die Anzahl der exprimierten Bakterienphagen Lambda Repressor, C one Proteinmoleküle zu zählen. Nach dem Einbau des Konstrukts in das E-Coli-Chromosom wird das Plasmid, das für die Protease spezifisch für die Erkennungssequenz kodiert, in einen Stamm transformiert, der den fluoreszierenden Reporter und das Protein von Interesse in der translationalen Fusion exprimiert.

In diesem Protokoll wird die Protease Ubiquitin carboxy Hydro verwendet, die unmittelbar nach der C-terminalen Ubiquitinreste spaltet. Um dieses Protokoll zu beginnen, wählen Sie eine E-Coli-Kolonie aus einer frisch gestreiften Agarplatte in einen Milliliter M neun, minimales Medium, ergänzt mit mindestens x essentiellen Aminosäuren des Mediums und geeigneten Antibiotika. Inkubieren eines Schüttlers bei der gewünschten Temperatur, die lange genug ist, um eine optische Dichte von 600 Nanometern oder OD 600 von mehr als 1,0 zu erreichen.

Anschließend wird die Kultur in einen Milliliter frisches M neun Medium mit geeigneten Antibiotika auf einen OD 600 von 0,02 verdünnt. Durch die Inkubation eines Schüttlers bei der entsprechenden Temperatur kann die anfängliche Zelldichte erhöht werden, wenn dies für ein Wachstum bei niedrigen Temperaturen erforderlich ist. Wenn der OD 600 0,2 bis 0,3 beträgt, beginnen Sie mit der Vorbereitung des ARO-Gel-Pads, indem Sie 10 bis 20 Milligramm Aros mit niedriger Schmelztemperatur in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen abwiegen.

Fügen Sie das entsprechende Volumen M neun, minimales Medium ohne Antibiotika hinzu, um eine 3%ascent-Lösung herzustellen. Anschließend erhitzen Sie die entstandene Lösung 30 Minuten lang bei 70 Grad Celsius zum Schmelzen. Drehen Sie das Rohr um, um sicherzustellen, dass die Lösung vollständig geschmolzen und homogen ist.

Spülen Sie für die Montage des Gel-Pads ein vorgereinigtes Deckglas und einen Mikro-Aquädukt-Objektträger mit sterilem Wasser. Trocknen Sie das Deckglas und den Schieber durch Blasen mit Druckluft. Platzieren Sie die Gummidichtung so auf dem Mikro-Aquäduktschieber, dass sie die Ein- und Auslässe abdeckt.

Tragen Sie auf der Glasseite des Objektträgers 50 Mikroliter ARO-Lösung auf die Mitte des Mikroaquädukts auf. Schieben Sie die ARO-Lösung mit dem gereinigten trockenen Deckglas auf. Lassen Sie die Agro-Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen.

Wenn die Zellen einen OD 600 von 0,3 bis 0,4 erreichen, sind sie bereit für die Bildgebung. Übertragen Sie einen Milliliter der inkubierten Kultur in eine 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchenzentrifuge bei 10.000 G für eine Minute in einer Tisch-Mikrozentrifuge. Nach dem Verwerfen des SUP-Mittels einen Milliliter frisches M nine medium und resus hinzufügen.

Suspendieren Sie das Pellet und zentrifugieren Sie die Suspension erneut eine Minute lang bei 10.000 Mal G. Wiederholen Sie dann den Schritt der Reanimationszentrifugation noch einmal und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem Milliliter M nine Medium. Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen für die Mikroskopfotografie verwendet oder 10- bis 100-fach verdünnt werden, um eine geringe Zelldichte für die Zeitrafferbildgebung zu gewährleisten.

Um eine Probe für die Bildgebung vorzubereiten, ziehen Sie das Deckglas vorsichtig von der Oberseite des Gelkissens ab. Geben Sie einen Mikroliter gewaschene Zellkultur auf die Oberseite des Gelpads. Warten Sie etwa zwei Minuten, bis die Kultur vom Gelpad absorbiert wurde.

Es ist wichtig, nicht so lange zu warten, bis das Gelpad übertrocknet. Die ideale Zeit variiert je nach Temperatur und Luftfeuchtigkeit, während Sie trocken warten. Ein weiteres vorgereinigtes Deckglas.

Sobald die Probe getrocknet ist, decken Sie die Probe mit dem neuen Deckglas ab und stellen Sie sicher, dass das Deckglas und der Objektträger des Mikroaquädukts gut ausgerichtet sind. Montieren Sie die temperaturgesteuerte Wachstumskammer gemäß den Anweisungen des Herstellers. Es kann nun für die Bildgebung am Mikroskop verwendet werden.

Um mit der Bildgebung zu beginnen, schalten Sie den Laser und das Mikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Verriegeln Sie die zusammengebaute Kammer mit dem Tischeinsatz am Mikroskop. Stellen Sie die Temperatur der Wachstumskammer und des Objektivheizers auf 37 Grad Celsius oder eine andere gewünschte Wachstumstemperatur ein.

Bei der Bildgebung oberhalb der Raumtemperatur driftet der Fokus oder das Gel-Padd in der Regel etwa 15 Minuten lang nach der anfänglichen Temperaturänderung erheblich. Praktisch. Nutzen Sie diese Zeit, um interessante Bereiche zu finden und Imaging-Skripte nach Bedarf zu ändern.

Für ein Experiment. Passen Sie die Intensität der Laseranregung so an, dass fast alle fluoreszierenden Moleküle innerhalb von sechs Belichtungen photobleichen. Finden Sie Zellen am Mikroskop und zentrieren Sie sie in einem vordefinierten und ausgerichteten Bildgebungsbereich.

Speichern Sie dann die Position jeder Zelle: In jedem Bild können mehr als eine Zelle abgebildet werden. Das Aufnahmezeitfenster für die Zeitraffer-Bildgebung über viele Generationen hinweg stellt sicher, dass die Bildzellen zunächst von anderen Zellen getrennt werden, mindestens jedoch einige hundert Mikrometer, damit andere Kolonien während des Wachstums nicht in den Bildgebungsbereich gelangen. Mit einem automatisierten Bildgebungsskript erfassen Sie Zeitrafferdaten mit dem in diesem experimentellen Arbeitsablauf beschriebenen Algorithmus, der im Textprotokoll zu diesem Video zu finden ist.

Diese Bilder zeigen typische Zeitrafferdaten aus einem Codetrack-Experiment. Bilder von einer einzelnen Kolonie werden im Abstand von 25 Minuten gezeigt. In diesem Experiment wurden alle fünf Minuten Daten von 12 verschiedenen Kolonien erfasst.

Diese Bilder stellen Hellfeldbilder und Venus-YFP-Fluoreszenzbilder dar, wobei der durchschnittliche Hintergrund subtrahiert wurde, um die Änderung des Hintergrunds des gesamten Bildfeldes zu berücksichtigen. Im Laufe der Zeit, wenn die Bilder überlagert werden, zeigen sie die Pollokalisierung von TSR-venösen UB-Reportermolekülen und die Heterogenität in der Anzahl der Moleküle, die in Fünf-Minuten-Zeitfenstern in verschiedenen Zellen produziert werden. Hier werden typische Daten von einem einzelnen Zeitpunkt in einem Code-Track-Experiment gezeigt: venöse Fluoreszenzbilder von sechs 100-Millisekunden-Expositionen, die zu Beginn jedes Fünf-Minuten-Zeitintervalls aufgenommen wurden.

Jede der sechs Aufnahmen wurde durch 900 Millisekunden getrennt, um Zeit für vorübergehend dunkle venöse Moleküle zu haben, die abgeblinzelt haben, um für die Analyse fluoreszierend zu werden. Bild sechs wird von Bild eins subtrahiert, um ungebleichte Moleküle und Autofluoreszenz zu korrigieren. Hintergrundflecken in diesem Bild sind auf bestimmte Zelllinien lokalisiert und durch ihre integrierte Fluoreszenzintensität quantifiziert.

Die durchschnittliche integrierte Fluoreszenz der Kolonie wird dann über sechs Bilder aufgetragen, wobei diese Linie zu einem exponentiellen Zerfall passt. Außerdem ergibt ein konstanter Offset eine Decay-Halbwertszeit von etwa einer Sekunde. In diesem Experiment photobleichen venöse Moleküle viel schneller als zelluläre Autofluoreszenz.

Daher wird etwa die Hälfte der Gesamtzahl der venösen Moleküle in jedem Rahmen photogebleicht. Für dieses Verfahren kann eine leitfähigkeitsbildgebende Analyse in anderen durchgeführt werden, um eine Metrik der Anzahl der Proteinmoleküle zu erstellen, die in einzelnen Zellen produziert werden.