Name: Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie PALM-basierte Super-Resolution-Mikroskopie die Struktur des FtsZ-Rings in E. coli mit Nanometer-Genauigkeit auflöst. Diese Methode liefert quantitative Einblicke in bakterielle Zellteilungsmechanismen.

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Grant: 5RO1GM086447-02.

Ein. Probenvorbereitung <ol><li> Beimpfen LB Medium mit einer Einzelkolonie des Stammes JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Über Nacht wachsen in einem Schüttler bei 37 ° C. </li><li> Verdünnen Sie die Kultur 1:1,000 in M9 + minimal media [M9 Salze, 0,4% Glucose, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, MEM Aminosäuren und Vitamine] und wachsen bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD 600 = 0,2-0,3) in Gegenwart von Chloramphenicol (150 ug / ml) bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Erbrechen Kultur mit 20 uM IPTG für 2 Stunden (siehe Anmerkung Nr. 1). </li><li> Pellet Kultur in Mikrozentrifuge (8.000 UpM, 1 min) und Resuspension in einem gleichen Volumen von M9 +; wiederholen. Nach der zweiten Resuspension weiterhin Wachstum bei RT für 2 h. </li><li> Fix induzierten Kultur mit 4% Paraformaldehyd in PBS (pH = 7,4) bei RT für 40 min. Pelletkultur und resuspendieren in einem gleichen Volumen von PBS; wiederholen. Wenn Bildgebung lebender Zellen, überspringen Fixierung, Pellet Kultur und resuspendieren mit dem gleichen VolumenM9 - [M9 Salze, 0,4% Glucose, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, MEM Amino Acids]; wiederholen. </li><li> Verdünnen Goldperlen 1:10 mit resuspendierten Kultur. Bewerben Probe vorbereiteten Bildgebung Kammer (siehe Schritt 2,4). </li></ol> [1] Hinweis: Die obige Induktion Protokoll (Schritte 1.1-1.3) hat für den Ausdruck System der Belastung JB281 optimiert. Detaillierte Induktionsbedingungen für andere Expressionssysteme oder Proteine ​​von Interesse zu variieren. 2. Versammlung der Imaging Chamber <ol><li> Einen 3% (w / v) Agarose-Lösung in M9 -. Melt Agarose bei 70 ° C in einer Bank-Oberhitze Block für 40min. Laden geschmolzen Agarose bei 50 ° C für bis zu 5 Stunden. </li><li> Ein sauberes microaqueduct Folie in der oberen Hälfte der Abbildungskammer mit den Elektroden nach unten. Richten Sie die untere Dichtung auf der microaqueduct slide so die Durchblutung Kanäle abzudecken. </li><li> Anwenden ~ 50 ul der geschmolzenen Agarose zur Mitte des GlasesRutsche. Unmittelbar oben auf der Agarosegel Tröpfchen mit einem sauberen, trockenen Deckglas. Sollte das Gel bei Raumtemperatur für 30 min verfestigt. <ol><li> Um Deckgläser reinigen: arrangieren Deckgläser in einer keramischen Halter und beschallen für 20 min in rotierenden Bäder von Aceton, Ethanol und 1M KOH in Gläsern. Wiederholen Zyklus dreimal für insgesamt 9 sonications, gefolgt von einem einzelnen Beschallung in dH 2 O. Bewahren Sie die gereinigten Deckgläser in frischem dH 2 O. Vor dem Gebrauch trocken blasen Deckgläser mit gefilterter Luft. </li></ol></li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas, so dass Gel-Pad auf der microaqueduct Folie. Sofort im 1 ul Zellkulturprobe (siehe Schritt 1,6) an die Spitze des Gel-Polster. Warten für ca. 2 Min., wodurch Lösung durch das Gel-Pad absorbiert werden. Top-Gel-Pad mit einem neuen, sauberen, trockenen Deckglas. Montieren Sie den gesamten Imaging-Kammer nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop, Kamera und Laser. Öffnen MetaMorph weichenware (Molecular Devices). </li><li> Zeigen entsprechender Anregung / Emission Filter in der Bildgebung Pfad (Abbildung 1). </li><li> Set Laserleistungen und Akquisition Einstellungen entsprechend an. <ol><li> 488-nm-Laser = 15 mW (siehe Hinweis Nr. 2) </li><li> 561-nm-Laser = 75 mW </li><li> 405-nm-Laser = 2 mW ± Graufilter (Siehe Anmerkung # 3) </li></ol></li><li> Sperren Bildgebung Kammer in der Bühne über den ergänzenden Tischadapters. </li><li> Eine geeignete Bildgebung Region (100x100 Pixel), die homogen von allen drei Laser beleuchtet wird. </li><li> Identifizieren eines Probenbereichs, der beide Zellen und Bezugsmarkierungen (Goldkügelchen) in enger Nachbarschaft aber nicht überlappenden enthält. </li><li> Fokus auf der Oberfläche von Zellen am nächsten zu dem Deckglas. Erwerben Sie ein Hellfeld-Bild mit 50 ms Integrationszeit und den Fokus 0,5 um in die Probe (Abbildung 3Ai). </li><li> Erwerben Ensemble grüne Fluoreszenz Bild mit Anregung aus dem 488-n<html> m-Laser mit einer 50 ms Integrationszeit (Abbildung 3Aii). </li><li> Erwerben Sie Streaming-Video in roten Kanal mit kontinuierlicher Beleuchtung von 405-nm-und 561-nm-Laser. Für fixierten Zellen wird ein 50 ms Frame-Rate für eine Gesamtmenge von 20.000 Frames (~ 17 min insgesamt) mit dem 405-nm Laserleistung hochgefahren um ca. 10% alle 1.000 Frames (siehe Anmerkung Nr. 4) verwendet. Für lebende Zellen ist ein 10 ms Frame-Rate für insgesamt 3000 Frames (~ 30 s gesamt) bei einem konstanten 405-nm Laserleistung verwendet. </li><li> Verschieben des Fokus wieder auf die untere Oberfläche der Zellen und andere erwerben Hellfeld Bild wie in Stufe 3.7. </li></ol> [2] Bemerkung: Die integrierte Intensität der grünen Fluoreszenz einer Zelle ist direkt proportional zu der Gesamtzahl der-FtsZ mEos2 Moleküle in der Zelle exprimiert wird. Die 488-nm Anregungsleistung und Ensemble Fluoreszenz Akquisition Einstellungen konstant gehalten werden für alle Zellen, so dass die relative FtsZ-mEos2 Expressionsniveaus in verschiedenen Zellen verglichen werden können. nhalt &quot;&gt; [3]. Hinweis: Die fixierten Zellen werden mit dem Neutral Density (ND)-Filter (Abbildung 1, Optical Component # 5) an Ort und Stelle abgebildet, um eine langsame Aktivierung Rate, so dass jedes einzelne Molekül genau identifiziert werden können erreichen die ND-Filter entfernt wird, wenn Echtzeit-Bildgebung Zellen, um die Aktivierung zu erhöhen, unter Beibehaltung einer geringen Wahrscheinlichkeit von zwei Molekülen, die gleichzeitig in einem beugungsbegrenzten Bereich aktiviert. Je schneller sich die an lebenden Zellen benötigt wird, um die gesamte Messzeit zu verringern, wodurch &quot;Einfrieren&quot; die Z-Ring in der Zeit und die Begrenzung der Wirkung von Lichtschäden an der Zelle. [4] Bemerkung: Die Zahlen von Rahmen akquiriert wurden für unser System optimiert und sind abhängig von der speziellen zellularen Struktur, Etikettieren Dichte, Aktivierungsrate und ob Absaugen der gesamte Pool von Fluorophoren für die Analyse wichtig. In lebenden Zellen, ist es wichtig, eine ausreichende Anzahl von Lokalisierungen in einer so kurzen Frist von ti zu erhaltenmir als möglich zu vermeiden, die Unschärfe des Bildes aufgrund einer Bewegung der Zellstruktur. 4. PALM Bild Construction <ol><li> Bestimmen Schwerpunkt Position jedes festgestellte Lichtpunkt. <ol><li> Laden Sie das Bild Stapel in Matlab (MathWorks, Inc). </li><li> Beschneiden Bildstapels auf einen Bereich um eine Zelle, die alle Fiducial Kügelchen ausschließt. </li><li> Wählen einer Intensität Schwelle für Spotdetektion über dem Hintergrund Ebene, aber unterhalb der durchschnittlichen Spotintensität ist. Wir berücksichtigen für die Variation in Hintergrundpegel während eines Experiments durch Berechnung des laufenden Durchschnitts der maximalen Intensität unter Verwendung eines Frame-Fensters 150. Die Intensität Schwellwert für jeden Rahmen wird dann interpoliert aus den laufenden Durchschnittswerte. </li><li> Subtrahieren Sie die jeweilige Schwelle von jedem Rahmen. Prospective Spots als drei benachbarte Pixel mit Intensitäten oberhalb der Schwelle identifiziert. </li><li> Den Fluoreszenzintensität jedem Interessenten vor Ort zu einem zweidimensionalen Gaussian Funktion [Gleichung # 1] unter Verwendung eines nichtlinearen Least-Squares-Algorithmus (Abbildung 2). Die Lokalisierung Präzision jedes Spots wird anhand der Gesamtzahl der detektierten Photonen [Gleichung Nr. 2]. Jede schlecht fit Spot mit einer Lokalisierung Genauigkeit größer als 20 nm (fixierten Zellen) bzw. 45 nm (lebende Zellen) wird verworfen (siehe Anmerkung Nr. 5). Jeder Spot mit einer Intensität größer als das Zweifache der mittleren Intensität, möglicherweise aufgrund überlappender Emittern, wird ebenfalls verworfen. </li><li> Für fixierten Zellen zu entfernen wiederholte Beobachtungen des gleichen Moleküls durch Nichtbeachtung jede Stelle, deren Schwerpunkt Position ist innerhalb von 45 nm einer anderen Stelle, die sie von 6 Frames oder weniger voraus. Für lebende Zellen, werden alle Stellen erhalten. </li></ol></li><li> Kalibrieren Probe Drift mit Bezugspunktmarkiereinrichtungsanordnung Bewegung. <ol><li> Crop aus einem 10x10 Pixel Bereich um eine Bezugspunktmarkiereinrichtungsanordnung. </li><li> Subtrahieren Sie die jeweilige Schwelle in 4.1.3 aus jedem Rahmen bestimmt. </li><li> Den Intensitätsprofil in jedemRahmen über kleinsten Quadrate Anpassungsalgorithmus Annahme einer zweidimensionalen gaußschen Form. </li><li> Berechnen Verschiebung zwischen Zentroidpositionen relativ zu dem Rahmen 1. </li></ol></li><li> Korrigieren des Schwerpunktes Position jedes einzigartigen Molekül in 4,1 mit der entsprechenden Probe in 4,2 Drift berechnet identifiziert. Vergleichen Sie die Hellfeld Bilder in 3,7 und 3,10 erworben. Wenn Zellen beobachtet werden, um relativ zu den Bezugsmarkierungen bewegen, werden die Daten verworfen. </li><li> Überlagern alle korrigierten Zentroidpositionen auf einem einzigen Bild von 15x15 nm Pixeln. Plotten jedes einzigartigen Molekül als Einheit-, zwei-dimensionalen Gauß-Profil an der Schwerpunktposition mit einer Standardabweichung gleich der Lokalisierungsgenauigkeit [Gleichung # 2] zentriert. Dies führt zu einer Wahrscheinlichkeitsdichte Karte, wo die Intensität eines Pixels proportional ist zur Wahrscheinlichkeit des Findens eines Moleküls in diesem Pixel (Abbildung 3Aiv). </li><li> Vergleicht PALM Bilder Ensemble Bildern. <ol><li> Replot das centroID Positionen wie in 4.4, aber in einer Ebene mit 150x150 Pixel nm und einer Standardabweichung von höchstens 250 nm aufweisen. Dies erzeugt ein Bild, das einen PALM beugungsbegrenzte Abbildung, die verwendet werden, um an den beugungsbegrenzten, Ensemble Bild in 3,8 (Abbildung 3Aiii) erworben werden kann Vergleichen nachahmt. </li><li> Um zu bestätigen, dass die detektierten Moleküle repräsentativ für die gesamte Bevölkerung sind, vergleichen Sie das rekonstruierte Ensemble Bild (Abbildung 3Aiii, Schritt 4.5.1) mit dem experimentellen Ensembles Fluoreszenz Bild (Abbildung 3Aii, Schritt 3,8), um zu bestätigen, dass beide Bilder Strukturen ähnlicher Gestalt zeigen , Orientierung und relative Intensität. </li></ol></li></ol> [5] Hinweis: Die mindestens erforderliche Lokalisierung Präzision wurde empirisch für jede bildgebenden Verfahren durch Auftragen der Genauigkeiten aller Moleküle für eine bestimmte Probe und die Auswahl eines geeigneten Cutoff bestimmt. 5. PALM Image Analysis <ol><li> Mess-Z-Ring Width und Durchmesser. <ol><li> Drehen Sie den PALM Bild, um so vertikal Orientierung der langen Achse der Zelle (Abb. 4A). </li><li> Crop aus dem zellulären Bereich, der die Z-Ring. </li><li> Berechnen des kumulativen Intensität durch Projizieren eines Intensitätsprofil entlang der Zelle Längsachse. </li><li> Montieren des Intensitätsprofils einer Gaußschen Verteilung. Die Ringbreite ist als die volle Breite halbes Maximum (FWHM) der angepassten Gaußverteilung (4B) definiert. </li><li> Projizieren Sie das kumulative Intensitätsprofil 5.1.2 entlang der Zelle kurzen Achse. Der Ringdurchmesser ist als die volle Länge des Intensitätsprofils (4C) definiert. </li></ol></li><li> Plotten FtsZ Dichte (siehe Anmerkung 6). <ol><li> Replot die Zentroidpositionen wie in (4.4), aber ohne das Gauss-Profil, so dass jede einmalige Molekül einen Wert von 1 gegeben wird und übertragen auf ein einzelnes Pixel entsprechend seiner Schwerpunktsposition. Auf diese Weise kann die Intensität von jedemPixel repräsentiert die Gesamtzahl der Moleküle in diesem Pixel detektiert. Die Dichte PALM Bild kann auch visualisiert werden als Kontur-Plot (Abbildung 5E). </li></ol></li><li> Bestimmung der räumlichen Auflösung. <ol><li> Theoretisch-erreichbare räumliche Auflösung: Erstellen Sie eine repräsentative PSF für die gesamte Stichprobe mit dem durchschnittlichen ermittelt Lokalisierungsgenauigkeit aller erkannten Moleküle und die Berechnung der FWHM (Gleichung # 3). </li><li> Experimentell erreicht räumliche Auflösung: Berechnung der durchschnittlichen Verschiebung zwischen repeat Beobachtungen desselben Moleküls. </li></ol></li></ol> [6] Bemerkung: Wir verwendeten Totalreflexion PALM (TIR-PALM, Abbildung 1 und 5), um die Aktivierung und Erregung, um eine dünne Schicht (~ 200 nm) oberhalb der Zelle / Glas-Grenzfläche zu beschränken. so dass nur FtsZ Moleküle mit der Membran am nächsten zu dem Deckglas assoziiert erkannt werden.

<ol><li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li>
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<li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li>
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<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

PALM Bilder enthalten Informationen über Molekül Zählungen und Positionen innerhalb einer Zelle, so dass detaillierte Analyse der Verteilung und Anordnung der Target-Protein-Moleküle, die nur schwer mit anderen Mitteln erreichen. Nachfolgend skizzieren wir Vorsichtsmaßnahmen getroffen, um eine genaue quantitative Informationen zu extrahieren und gleichzeitig die biologische Relevanz der PALM Bilder werden sollte. Wir auch die Informationen, die am besten erhalten werden kann mit live vs fixierten Zellen. Schließlich sch...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 50 x MEM Amino Acids </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM Vitamine </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td> Electron Micrsocopy Sciences </td><td> 15.710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG Agarose </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 nm Gold Perlen </td><td> Microspheres-Nanospheres </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 Imaging Chamber </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stufe Adapter </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Inverses Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1,45 NA, 60x Objective </td><td> Olymp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD Kamera </td><td> Andor Technology </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm Sapphire Laser </td><td> Kohärent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm Sapphire Laser </td><td> Kohärent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-nm CUBE Laser </td><td> Kohärent </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging der bakterien abteilung machinery

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bakterielle Zellteilung erfordert die koordinierte Anordnung von mehr als zehn essentiellen Proteine ​​bei midcell 1,2. Im Mittelpunkt dieses Verfahrens ist die Bildung eines ringähnlichen Suprastruktur (Z-Ring) durch die FtsZ Protein bei der Teilung Plan 3,4. Der Z-Ring besteht aus mehreren einsträngige FtsZ Protofilamenten, und das Verständnis der Anordnung der Protofilamente innerhalb der Z-Ring wird einen Einblick in den Mechanismus der Z-Ring Montage und ihrer Funktion als Krafterzeuger 5,6 geben. Diese Information ist bisher unklar in herkömmlichen Fluoreszenz-Mikroskopie und Elektronenmikroskopie aufgrund der aktuellen Einschränkungen. Konventionellen Fluoreszenzmikroskop ist nicht ein hochauflösendes Bild des Z-Ring aufgrund der Beugungsgrenze des Licht (~ 200 nm) bereitzustellen. Electron cryotomographic Bildgebung erkannt hat FtsZ Protofilamente in kleinen C. verstreut crescentus Zellen 7, ist jedoch schwierig, zu größeren Zellen wie geltenE. coli oder B. subtilis. Hier haben wir die Anwendung eines Super-Resolution-Fluoreszenz-Mikroskopie-Methode zu beschreiben, Photoaktiviertes Localization Microscopy (PALM), quantitativ zu charakterisieren die strukturelle Organisation des E. coli Z-Ring 8. PALM Bildgebung bietet sowohl eine hohe räumliche Auflösung (~ 35 nm) und spezifische Kennzeichnung für die eindeutige Identifizierung von Zielproteinen zu ermöglichen. Wir markierten FtsZ mit dem photoaktivierbaren Fluoreszenzprotein mEos2, die von grünen Fluoreszenz (Anregung = 488 nm) nach rot schaltet Fluoreszenz (Anregung = 561 nm) bei Aktivierung bei 405 nm 9. Während eines Experiments PALM werden einzelne FtsZ-mEos2 Moleküle stochastisch aktiviert und die entsprechenden Zentroidpositionen der einzelnen Moleküle sind mit &lt;20 nm Genauigkeit bestimmt. Ein Super-Resolution-Bild der Z-Ring wird dann durch die Überlagerung der Zentroidpositionen aller erkannten FtsZ-mEos2 Moleküle rekonstruiert. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde festgestellt, dass der Z-Ring einen festen Breite von ~ 100 nm aufweist und aus einem Bündel von losen FtsZ Protofilamenten, die miteinander überlappen, in drei Dimensionen besteht. Diese Daten liefern ein Sprungbrett für weitere Untersuchungen der Zellzyklus abhängigen Veränderungen der Z-Ring 10 und kann auf andere Proteine ​​von Interesse angewendet werden.

Veranschaulicht in 3Aiv ist eine zweidimensionale, Superauflösung Rendering der Z-Ring aus der PALM Bildgebungsverfahren oben beschrieben erzeugt. Im Folgenden fassen wir qualitative und quantitative Informationen, die von ihnen gewonnen werden können. Qualitativ beobachteten wir, dass die Z-Ring ein unregelmäßiger Struktur, die mehrere Konfigurationen (einzelnes Band oder schraubenförmigen Lichtbogens), die nicht in herkömmlichen unterscheidbar Fluoreszenzbilder (vergleiche...

Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine ​​des Zytoskeletts angewendet werden.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, quantitative Strukturinformationen über E-coli-Zellteilungsproteine in ihrer natürlichen Umgebung zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem ein photoaktives, fluoreszierendes Fusionsprotein in lebenden Zellen exprimiert und diese Zellen auf einem Acro-Gel-Pad immobilisiert werden. Die Zellen werden dann per Video-Streaming abgebildet.Während Anregungs- und Aktivierungslaser eingesetzt werden, um die Positionen einzelner Moleküle zu visualisieren, werden die resultierenden Filme rechnerisch analysiert, um die Molekülpositionen mit Nanometergenauigkeit zu extrahieren und sie zu überlagern, um ein hochauflösendes Bild zu erzeugen. Dieses Bild kann dann durch eine Vielzahl von quantitativen Messungen analysiert werden, die die interessierende Struktur beschreiben, einschließlich ihrer Abmessungen und Moleküldichte. Die photoaktivierte Lokalisierung, Mikroskopie oder Handflächenmikroskopie ist eine einfach zu implementierende hochauflösende Fluoreszenzmikroskopietechnik.Die Instrumentierung ist einfach, aber eine sorgfältige Optimierung der Datenerfassung und -analyse ist erforderlich, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Ein weiterer entscheidender Schritt ist der Umfang der Charakterisierung Ihres Fusionsproteins und des Expressionsniveaus, um sicherzustellen, dass Ihre Ergebnisse biologisch relevant sind. Das folgende Protokoll wurde für das FTSZ-Protein fused Muse two optimiert und sollte an Ihr interessierendes Protein angepasst werden.Zu Beginn inokulieren Sie das LB-Medium mit einer einzelnen Kolonie des interessierenden Stammes, die ein fluoreszenzgebundenes Protein enthält, das wie in dem schriftlichen Protokoll beschrieben hergestellt wurde. Zu diesem Video kannst Du am nächsten Tag über Nacht in einem Shaker bei 37 Grad Celsius anbauen. Verdünnen Sie die Kultur eins bis 1000 in M neun plus minimales Medium.Wachsen Sie in Gegenwart eines geeigneten Antibiotikums bei Raumtemperatur bis zur mittleren logarithmischen Phase und induzieren Sie dann die Kultur, zwei Stunden lang Protein mit 20 mikromolaren IPTG zu produzieren. In der Zwischenzeit wird die Bildgebungskammer zusammengebaut, indem eine 3%ige Agro-Lösung in M neun minus Medien hergestellt wird. Schmelzen Sie das Agros bei 70 Grad Celsius in einem Tischheizblock für 40 Minuten.Lagern Sie das geschmolzene Agros bis zu fünf Stunden bei 50 Grad Celsius. Platzieren Sie einen sauberen Mikro-Aquädukt-Objektträger mit den Elektroden nach unten in der oberen Hälfte der Bildgebungskammer. Richten Sie die untere Dichtung auf dem Mikro-Aquäduktschieber so aus, dass die Perfusionskanäle abgedeckt sind.Tragen Sie ca. 50 Mikroliter des geschmolzenen Aros auf die Mitte des Glases auf. Schieben Sie das Agros-Gel-Tröpfchen sofort mit einem sauberen, trockenen Deckglas auf. Lassen Sie das Gel nach der Proteininduktion mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur erstarren.Pelletieren Sie die Kultur in einer Mikrozentrifuge. Wiederbelebung. Das Pellet wird in einem gleichen Volumen von M neun plus wiederholter Zentrifugation und Reanimationssuspension nach der zweiten Reanimationssuspension suspendiert. Setzen Sie das Wachstum bei Raumtemperatur zwei Stunden lang fort.Als nächstes fixieren Sie die induzierte Kultur, indem Sie Paraformaldehyd in PBS hinzufügen, um eine Endkonzentration von 4 % Paraformaldehyd zu erreichen. Wenn Sie lebende Zellen bildgeben, lesen Sie das schriftliche Protokoll, das diesem Video beigefügt ist, um Abweichungen im Verfahren zu erfahren, lassen Sie die Kultur 40 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Pelletieren Sie die Kultur und resuspendieren Sie sie in einer gleichen Menge PBS.Als nächstes verdünnen Sie 50 Nanometer große Goldkügelchen, eine bis 10 mit resuspendierter Kultur. Um die Probe in die vorbereitete Bildgebungskammer aufzutragen, entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und lassen Sie das Gelpad auf dem Objektträger des Mikroaquädukts. Geben Sie sofort einen Mikroliter Zellkulturprobe auf die Oberseite des Gelpads.Warten Sie etwa zwei Minuten, bis die Lösung vom Gelpad absorbiert ist, und bedecken Sie das Gelpad mit einem neuen, sauberen, trockenen Deckglas. Fahren Sie mit dem Zusammenbau der gesamten Bildgebungskammer gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Bildaufnahme fort. Schalten Sie die Mikroskopkamera, die Kamera und die Laser ein.Offene Metamorph-Software durch molekulare Bauelemente. Platzieren Sie geeignete Anregungs- und Emissionsfilter im Abbildungsgang, wie in diesem Mikroskopschema dargestellt, das in der schriftlichen Prozedur zu diesem Video zu finden ist. Legen Sie als Nächstes die Laserleistung und die Erfassungseinstellungen fest.Verriegeln Sie die Bildgebungskammer über den ergänzenden Tischadapter entsprechend im Tisch. Konzentrieren Sie sich auf die Oberfläche der Zellen, die der Deckglaslippe am nächsten ist. Bestimmen Sie einen geeigneten Bildgebungsbereich, der von allen drei Lasern homogen ausgeleuchtet wird.Identifizieren Sie einen Probenbereich, der sowohl Zellen als auch Referenzmarker enthält, d. h. die Goldkügelchen in unmittelbarer Nähe, aber nicht überlappend. Nehmen Sie ein Hellfeldbild mit einer Integrationszeit von 50 Millisekunden auf und verschieben Sie den Fokus um 0,5 Mikrometer in die Probe. Nehmen Sie dann ein Ensemble-Grün-Fluoreszenzbild mit Anregung durch den 488-Nanometer-Laser mit einer Integrationszeit von 50 Millisekunden auf.Nehmen Sie als Nächstes Streaming-Videos mit kontinuierlicher Beleuchtung von 405-Nanometer- und 561-Nanometer-Lasern auf. Für feste Zellen wird eine Bildrate von 50 Millisekunden für insgesamt 20.000 Bilder verwendet. Mit der Laserleistung von 405 Nanometern, die hier alle 1000 Frames um ca. 10% erhöht wird, werden die ersten 500 Frames gezeigt.Beachten Sie, dass die Anzahl der erfassten Frames für dieses System optimiert wurde und von der jeweiligen Zellstruktur abhängt. Beschriftung der Aktivierungsrate der Dichte und der Angabe, ob die Erschöpfung des gesamten Pools von Stockwerken für die Analyse wichtig ist Zur Durchführung der Bildkonstruktion. Identifizieren Sie zunächst prospektive Spots im Bildstrom als drei benachbarte Pixel mit Intensitäten oberhalb eines empirisch bestimmten Schwellenwerts, um die Intensität jedes prospektiven Spots an eine zweidimensionale Gaußsche Funktion anzupassen.Um die Position des Moleküls und die Gesamtzahl der emittierten Photonen zu identifizieren, berechnen Sie die Lokalisierungsposition jedes Spots anhand der Gesamtzahl der detektierten Photonen. Als nächstes verwerfen Sie schlecht angepasste Spots, indem Sie einen Schwellenwert für die Lokalisierungsgenauigkeit anwenden, und entfernen Sie wiederholte Beobachtungen desselben Moleküls, indem Sie alle Spots ignorieren, die innerhalb von 45 Nanometern und sechs Frames von einem vorangehenden Spot liegen, der für die Probendrift korrigiert ist. Durch Subtraktion der rahmenabhängigen Verschiebung der Goldkügelchen von jeder Molekülposition werden alle korrigierten Molekülpositionen auf einem einzigen Bild aus 15 x 15 Nanometern überlagert, wobei jedes einzigartige Molekül als Flächeneinheit, zweidimensionales Gauß-Profil mit einer Standardabweichung gleich der Lokalisierungsgenauigkeit dargestellt wird.Das resultierende Bild ist eine Wahrscheinlichkeitsdichtekarte, bei der die Intensität eines Pixels proportional zur Wahrscheinlichkeit ist, ein Molekül zu finden. In diesem Pixel abgebildet. Hier ist ein zweidimensionales hochauflösendes Rendering des ZR, das mit der Palm Imaging Method erstellt wurde.Qualitativ wurde beobachtet, dass der Z-Ring eine unregelmäßige Struktur ist, die mehrere Konfigurationen annimmt, wie z.B. einzelne Banden oder spiralförmige Bögen, die in herkömmlichen Fluoreszenzbildern nicht unterscheidbar sind. Beobachtungen wie diese können verwendet werden, um den Prozentsatz der Zellpopulation zu bestimmen, der eine bestimmte strukturelle Konfiguration aufweist. Auch die Abmessungen des ZR können aus diesem Diagramm gemessen werden.Die Ringbreite wurde auf 113 Nanometer bestimmt. Dieser Wert ist breiter als die erwartete Breite eines einzelnen FDSC-Protofilaments, die auf der In-vitro-Elektronenmikroskopie fünf bis 10 Nanometer beträgt. Dabei wird der Ringdurchmesser mit 1050 Nanometern gemessen.Dieser Durchmesser kann verwendet werden, um den Grad der Verengung während der Zellteilung quantitativ zu beschreiben. Ein weiterer quantitativer Ansatz besteht darin, die Moleküldichte zu berechnen, indem die Anzahl der Moleküle gezählt wird, die in einem definierten Bereich lokalisiert sind. Da es sich bei Handflächenbildern um 2D-Projektionen von 3D-Objekten handelt, muss die Totalreflexion oder TIR-Handfläche verwendet werden, um die Erkennungsebene auf eine einzige Seite des Z-Rings zu beschränken.Da die aufgetragenen Moleküle eine Teilmenge der gesamten FDSC-Population darstellen, ist die ermittelte Dichte eine untere Grenze der tatsächlichen Dichte. Die maximale Dichte, die in den TIR-Bildern des Z-Rings beobachtet wurde, deutet darauf hin, dass einige Abschnitte überlappende Protofilamente enthalten. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellmorphologie und die Wachstumsrate zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Expression Ihres Fusionsproteins die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt.Sobald dieses Verfahren für das gewünschte Protein etabliert ist, kann es verwendet werden, um strukturelle Veränderungen zu testen, die mit dem Fortschreiten des Zellzyklus verbunden sind, oder weiter auf zweifarbige Bildgebung erweitert werden, um die Gesichtsverteilungen mehrerer Proteine zu vergleichen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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