Name: Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Lernen Sie den Comet-Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in Hippocampus-Neuronen. Diese Methode nutzt Elektrophorese und Fluoreszenzmikroskopie, um einzelne Neuronen zu analysieren.

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Diese Arbeit wurde von der IMPACT Award vom Department of Radiation Oncology, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, The Fighting Kinderkrebsstiftung und der Gabrielle &#39;s Angel Foundation (zum ESY.) Unterstützt.

Ein. Cell Culture <ol><li> Kultur neuronalen Zellen und behandeln Sie sie nach Bedarf. </li><li> Ernte Zellen in 15 ml Röhrchen: Aspirat Medien, mit Phosphat spülen Kochsalzlösung (PBS, Calcium und Magnesium befreit), fügen Trypsin, sammeln sich in 15 ml Röhrchen und neutralisieren Trypsin mit geeigneten serumhaltigen Medien. </li><li> Spin bei 1.000 xg für 5 min. </li><li> Absaugen Medien. </li><li> Die Zellen in PBS. </li><li> Spin bei 1.000 xg für 5 min. </li><li> Absaugen Medien und resuspendieren Zellen in frischem PBS. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämacytometers oder Ihre bevorzugte Zelle Zähler. </li><li> Zellproben sollte unmittelbar vor Beginn des Tests vorbereitet werden. </li><li> Alle Proben sollten im Dunkeln oder gelbem Licht gehandhabt werden, um DNA-Schäden durch UV-Licht zu verhindern. </li></ol> 2. Comet Assay Ein. Slide Vorbereitung <ol><li> Schmelze 1% Agarose (1 g / 100 ml 1X Tris Base, Borsäure, EDTA, TBE) in einer Mikrowelle für 3 min bis alle Granulate verschwinden. </li><li> Objektträger in das geschmolzene Agarose und Wischen einer Seite mit einer Kimwipe reinigen. Lassen Sie die Agarose an der Luft trocknen, um eine transparente Folie. Dies kann im Voraus und Folien erfolgen kann gespeichert werden. </li></ol> 2. Neutral Comet Assay <ol><li> Chill Lyse-Lösung (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, pH 10, 10 mM Tris-Base, 1% Natriumlaurylsarcosinat und 1% Triton X-100, pH 10) bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Verwendung. </li><li> 2.2.2. Melt 1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (1 g / 100ml in 1X Tris Base, Borsäure, EDTA) in einer Mikrowelle für 3 min, bis alle Körner verschwinden. Die Agarose muss auf 37 ° C in einem Wasserbad abgekühlt werden, um künstliche Induktion Kometenschweif vermeiden. Idealerweise muß die Agarose eine halbe Stunde vor der Verwendung gekühlt werden. </li><li> 2.2.3. Verdünnen der Zellsuspension, so daß es 100.000 Zellen pro ml sind. Kombinieren der Zellsuspension mit der Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (bei 37 ° C) beiein Verhältnis von 1:10 (v / v), kurz vortexen und sofort pipettieren 50 ul auf die Comet Slide. Verwenden Sie die Seite der Pipettenspitze die Zellsuspension gleichmäßig über den Probenraum. Jede Behandlungsgruppe sollte mindestens in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Objektträger flach im Kühlschrank für 30 Minuten, bis ein Kreis erscheint in der Peripherie der Folie. </li><li> Prechill die Lyse-Lösung und tauchen Folien in dieser Lösung für 30 min im Dunkeln bei 4 ° C (oder im Kühlschrank). </li><li> Abgießen oder absaugen die Lyse-Lösung und fügen 1X neutral Elektrophorese-Puffer (Tris-Base, Borsäure, EDTA, 1X TBE). Lassen Sie Folien in diesem Puffer für eine halbe Stunde in den Kühlschrank stellen. </li><li> Fügen vorgekühlte 1X Neutral Electrophoresis Buffer (FSME) in Elektrophoresekammer, die Objektträger in der Elektrophorese Diamagazin. Richten gleitet, so daß sie äquidistant von Elektroden sind. </li><li> Gießen 1X neutral Elektrophoresepuffer bis zu 0,2 Zentimeter über Rutschen. Überschüssiger Puffer wird unterFere mit Elektrophorese. </li><li> Set Stromversorgungsspannung bis 1 V pro cm (gemessen Elektrode zu Elektrode) und führen für 30 min bei 4 ° C (oder der Kühlraum) im Dunkeln. </li></ol> 3. Alkaline Comet Assay <ol><li> Chill Lyse-Lösung (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, pH 10, 10 mM Tris-Base, 1% Natriumlaurylsarcosinat und 1% Triton X-100, pH 10) bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Verwendung. </li><li> Melt 1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (1 g / 100 ml in 1X Tris Base, Borsäure, EDTA) in einer Mikrowelle für 3 min, bis alle Körner verschwinden. Dann in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 30 min. </li><li> Kombinieren Zellen mit 1 x 105 / ml mit geschmolzenen Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (37 ° C) in einem Verhältnis von 1:10 (v / v), Vortex kurz und unmittelbar pipettieren 50 ul auf das Slide Comet. Verwenden Sie die Seite der Pipettenspitze die Zellsuspension gleichmäßig über den Probenraum. Jede Behandlungsgruppe sollte mindestens in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Aufschiebenes flach im Kühlschrank für 30 Minuten, bis ein Kreis erscheint in der Peripherie der Folie. </li><li> Objektträger in vorgekühlte Lyselösung und lassen bei 4 ° C für 1 h bis über Nacht im Dunkeln. </li><li> Die Objektträger aus der Lyselösung, abtropfen die Folien und spülen einmal mit kaltem Neutralisationspuffer für 5 min, um restliches Detergens und Salzen vor der Alkali-Abwickeln Schritt zu entfernen. </li><li> Die Objektträger in eine Gelelektrophorese Kammer mit vorgekühltem frisch zubereiteten Elektrophorese-Puffer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH&gt; 13) nicht bis 0,5 cm über Rutschen überschreiten gefüllt. Richten gleitet, so daß sie äquidistant von Elektroden sind. </li><li> Lassen Folien im alkalischen Puffer sitzen für 30 min im Dunkeln zum Abwickeln der DNA und der Expression von Alkali-ersatzpflichtigen ermöglichen. </li><li> Set Stromversorgungsspannung bis 1 V pro cm (gemessen Elektrode zu Elektrode) und führen für 30 min bei 4 ° C (oder der Kühlraum). </li></ol> 4. Befestigungs-und Staining Cells <ol><li> Überschüssiges Electrophoresis Buffer </li><li> Objektträger in vorgekühlte destilliertem Wasser für 5 min bei RT. </li><li> Objektträger in vorgekühlte 70% Ethanol 5 min bei RT. </li><li> Dry Proben über Nacht. Setzen Sie Folien helles Licht. Die Proben können für Monate bei Raumtemperatur vor Scoring zu diesem Zeitpunkt gespeichert werden. </li><li> Stain Objektträger durch Eintauchen in Sybr grün (1X in PBS verdünnt) für 20 min in den Kühlschrank stellen. </li><li> Objektträger und ihnen erlauben, vollständig trocknen im Dunkeln. Die Agarose wird transparent, wenn sie vollständig trocken. </li></ol> 4. Bild-Akquisition und Analyse <ol><li> Erwerben Sie Bilder mit Fluoreszenzmikroskop auf den grünen Filter (Zeiss AxioVision) und analysieren mit Comet Assay Software (Perceptive Instruments). </li><li> Klicken Sie auf den &quot;Kometen Kopf&quot; (der Kern) und die Software berechnet die Parameter einschließlich der mittleren Schwanz Moment und DNA-Menge in derKern. </li><li> Analysieren mindestens 200 Zellen pro Behandlung. </li><li> Exportieren von Daten in Microsoft Excel. </li><li> Berechnung der mittleren tail moment für jede Behandlungsgruppe und Plot-Daten als angemessen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für Comet Assay Analyse neuronaler Zellen ist in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt. In diesem Fall induziert Bestrahlung der neuronalen Zellen DNA-Schäden. Da die Zellen mit dem elektrischen Feld ausgesetzt werden, wandert die DNA mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten aufgrund der Unterschiede in der Größe, die anschließend analysiert wird unter Verwendung des Kometentest Software. Je mehr die DNA-Schäden, je weiter die DNA wandert aus dem Zellkern. Dies verringert die Fluoreszenzintensität in den Zellkern, die anschließend durch den Software und führt zu höheren Leitwerksmoment abgeholt. Tabelle 1 stellt eine Tabelle von repräsentativen Kometenassay Analyse und Abbildung 4 zeigt einen repräsentativentative Graph DNA-Schäden in neuronalen Zellen nach der Bestrahlung durch den Comet Assay gemessen. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Ablaufdiagramm des Comet Assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Repräsentative Bilder von neuronalen Zellen (A) ohne und (B) mit Kometenschweif. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Comet Assay-Analyse mit Comet Assay Software. (A) Repräsentative Schirmschüsse Bild aufgenommen mit Carl Zeiss Fluoreszenzmikroskop und mittels CometAssay Software. (B) Klick auf den Kern oder die &quot;Kometen Kopf&quot; (eingekreist in grün) erzeugt eine fluoreszierende Karte und Grafik (eingekreist in gelb) und eine (C) Datentabelle (rot eingekreist). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Repräsentative Graph durch Auftragen der mittleren Leitwerksmoment durch Analysieren DNA-Schädigung in bestrahlten und unbestrahlten neuronalen Zellen mit neutralen Kometenassay erhalten wird. Wie erwartet, induziert 3Gy Strahlung (Röntgenstrahlen) DNA-Schädigung, wie durch die höhere mittlere Leitwerksmoment in den bestrahlten neuronalen Zellen dargestellt. Dargestellt ist die mittlere tail moment (+ / - Standardfehler), ** P &lt;0,01. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="Tabelle 1"/> Tabelle 1. </strong&gt; Vertreter Tisch Comet Assay Analyse bestrahlten und nicht-bestrahlten neuronalen Zellen erhalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

<ol><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li>
<li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li>
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<li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li>
<li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li>
<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li>
<li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+hOGG1%2C+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+sensitivity%2C+H2AX+phosphorylation%2C+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li>
<li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5DH2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li>
<li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li>
<li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElectrophoresis%2C+FI+%22Pulsed-field+gel+electrophoresis%22">Pulsed-field gel electrophoresis</a>. , (2000).</li>
<li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Comet Assay hat die einzigartige Fähigkeit zur Analyse von einzelnen Zellen. Dies ist vorteilhaft bei der Identifizierung von Subpopulationen von Zellen, die differenzielle Reaktion auf zytotoxischen Mitteln demonstrieren. Einige praktische Einschränkungen zu berücksichtigen. Die Anzahl der Zellen, die einzeln ausgewertet werden kann je nach dem Individuum. Der Stichprobenumfang erhöht werden muss, wenn es Varianz in DNA-Schädigung innerhalb einer Population. Lebensfähigen Einzelzell-Suspension ist für diesen Assay ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> 1,5 ml Röhrchen </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc. </td><td> Sc-200.271 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE (Tris-Base, Borsäure, EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Tube </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Aluminiumfolie </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> Becher </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> Comet Assay-Software </td><td> Comet Assay IV Image Analysis System </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zylinder </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> Electrophoresis Kammer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Zeiss Axio Vision- </td><td></td><td> Jede Fluoreszenzmikroskop mit Grünfilter genügt </td></tr><tr><td> Hämazytometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrowelle </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phosphatgepufferter Kochsalzlösung, Calcium-freien, Magnesium kostenlos </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> Stromversorgung </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> Kühlschrank </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Herrscher </td><td> Staples </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gleiten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumlaurylsarcosinat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> Tablett </td><td> Fisihrem Scientific </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> Wirbel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad </td><td> Fisher Scientific </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

testen dna damage in hippocampus-neuronen mit dem comet assay

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Eine Reihe von Medikamenten gezielt die DNA Reparaturmechanismen und induzieren Zelle, indem sie DNA-Schäden zu töten. So wurden Prozesse direkt zu messen DNA-Schäden wurde ausgiebig evaluiert. Herkömmliche Methoden sind zeitaufwendig, teuer und erfordern ressourcenintensiv replizierende Zellen. Im Gegensatz dazu ist die Comet-Assay, eine einzelne Zelle Gelelektrophorese-Assay, ein schneller, nicht-invasiven, kostengünstigen, direkt und empfindliches Maß von DNA-Schäden und Reparatur. Alle Formen von DNA-Schäden sowie DNA-Reparatur kann an der einzelnen Zelle mit diesem leistungsstarken Technik visualisiert werden. Das Prinzip des Comet Assay ist, dass intakte DNA ist hoch geordnete wohingegen DNA Schädigung unterbricht diese Organisation. Die beschädigten DNA sickert in der Agarose-Matrix und, wenn sie einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, wandert der negativ geladenen DNA zur Kathode, das positiv geladen ist. Die großen unbeschädigten DNA-Stränge sind nicht in der Lage zu weit vom Kern migrieren. DNA-Schädenentstehen kleinere DNA-Fragmente, die weiter als die intakte DNA reisen. Kometentest eine Bildanalyse-Software, misst und vergleicht die gesamte Fluoreszenzintensität der DNA im Zellkern mit DNA, die aus dem Nukleus migriert ist. Fluoreszenzsignal aus der migrierten DNA ist proportional zur DNA-Schäden. Längere heller DNA tail bedeutet erhöhte DNA-Schäden. Einige der Parameter, die gemessen werden Leitwerksmoment die ein Maß für sowohl der Menge an DNA und Verteilung der DNA im Schwanz, Schwanzlänge und Prozentsatz der DNA in dem Endstück ist. Dieser Test ermöglicht es, DNA-Reparatur als auch messen, da Auflösung von DNA-Schäden bezeichnet Reparatur stattgefunden hat. Die Grenze der Empfindlichkeit liegt bei etwa 50 Strangbrüche pro diploid Säugetierzellen 1,2. Zellen mit irgendwelchen DNA-schädigende Mittel, wie zum Beispiel Etoposid behandelt wird, kann als eine positive Kontrolle verwendet werden. So ist die Comet-Assay ist eine schnelle und wirksame Verfahren, um DNA-Schäden zu messen.

Der Comet Assay ist ein effizientes Mittel zur Feststellung von Einzel-und Doppelstrang-Brüche, einschließlich Alkali-labile Websites und DNA-DNA/DNA-protein Cross-Links auf der DNA in allen Zellen, einschließlich Neuronen im Hippocampus. Die Methode nimmt den Vorteil dieser differentielle Migration von DNA in einem elektrischen Feld aufgrund von Unterschieden in Menge an DNA-Schäden.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Ausmaß der DNA-Schäden in Neuronen mit Hilfe des COMET-Assays zu messen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem die Neuronen zunächst verschiedenen DNA-schädigenden Bedingungen ausgesetzt werden, die Neuronen gesammelt und mit aros bei niedrigem Schmelzpunkt gemischt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Neuronen auf Objektträgern zu immobilisieren.Anschließend werden die Neuronen lysiert und im letzten Schritt einer Elektrophorese unterzogen. Die DNA ist mit Cybergrün gefärbt. Letztendlich werden die Fluoreszenzmikroskopie und die COMET-Assay-Software verwendet, um das Ausmaß der DNA-Schäden in einzelnen Neuronen sichtbar zu machen und zu quantifizieren.Hallo, mein Name ist Eddie Yang und ich bin Assistenzprofessor in der Abteilung für Radioonkologie an der University of Alabama in Birmingham. Heute stellen wir Ihnen den COMET-Assay vor, eine einfache Methode zum Nachweis von DNA-Schäden in Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie z. B. der Gamma H mit zwei A X Foki-Färbungen sowie der Pulsfeld-Gelelektrophorese, besteht darin, dass diese Technik eine direkte und empfindliche Methode zur Messung von DNA-Schäden ist.Darüber hinaus kann mit geringfügigen Modifikationen dieser Technik die Art des DNA-Schadens bestimmt werden, da viele Krebstherapien DNA-Schäden in Tumoren induzieren und oft die DNA-Reparaturkapazität verändern. Die Implikationen dieser Technik können auf die Wirksamkeit der Krebstherapie ausgeweitet werden. Frau Samara Noshin, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, wird das Verfahren heute vorführen. Beginnen Sie mit der Ernte von neuronalen Zellen, die unter den gewünschten experimentellen Bedingungen behandelt wurden, in 15-Milliliter-Röhrchen.Drehen Sie die Röhren fünf Minuten lang bei 1000 mal G und vier Grad Celsius herunter, nachdem Sie den Überstand abgesaugt haben. Suspendieren Sie das Pellet in PBS und schleudern Sie die Zellen nach dem zweiten Waschen wieder herunter. Reanimation suspendiert die Zellen in mehr PBS, zählt sie und bewahrt sie im Dunkeln auf, bis sie im Kometen-Assay verwendet werden.Um DNA-Schäden vor Beginn des Assays zu vermeiden, schmelzen Sie 1%aros drei Minuten lang in der Mikrowelle, bis alle Körnchen verschwunden sind. Tauchen Sie dann die Objektträger in die geschmolzene Agros und wischen Sie eine Seite mit einem Kim-Tuch sauber. Lassen Sie das Agros an der Luft zu einem transparenten Film trocknen, während das Agros die Lyselösung mindestens eine Stunde lang bei vier Grad Celsius kühlt und schmelzen Sie weiter.1% niedriger Schmelzpunkt Agros. Kühl. Diese Charge Agros wird eine halbe Stunde lang in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius getestet. Um die künstliche Induktion eines Kometenschweifs zu vermeiden, verdünnen Sie nun die geerntete neuronale Zellsuspension so, dass 100.000 Zellen pro Milliliter entstehen.Kombinieren Sie die Zellsuspension mit dem 37 Grad Celsius niedrigen Schmelzpunkt Agros bei einem Wirbel von eins zu 10 kurz und verteilen Sie sofort mit der Seite einer Pipettenspitze 50 Mikroliter der Zellsuspension gleichmäßig über den Probenbereich des luftgetrockneten Kometenträgers. Legen Sie die behandelten Objektträger flach für 30 Minuten in den Kühlschrank, bis am Rand des Objektträgers ein Kreis erscheint. Tauchen Sie die Objektträger dann in die vorgekühlte Lyselösung im Dunkeln bei vier Grad Celsius.Nach 30 Minuten aspirieren Sie die Lyselösung. Dann inkubieren Sie die Objektträger in einem x neutralen Elektrophoresepuffer für eine halbe Stunde im Kühlschrank. Geben Sie als Nächstes einen vorgekühlten x Neutral-Elektrophorese-Puffer in eine Elektrophoresekammer und legen Sie dann die Objektträger in die Elektrophorese-Objektträgerschale, wobei Sie die Objektträger so ausrichten, dass sie gleich weit von den Elektroden entfernt sind.Nachdem Sie die Kammer so weit gefüllt haben, dass die Objektträger mit 0,2 Zoll eines x neutralen Elektrophoresepuffers bedeckt sind, stellen Sie die Versorgungsspannung auf ein Volt pro Zentimeter ein und führen Sie den Assay 30 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius durch. Beginnen Sie damit, neue mit Agros und neuronalen Zellen behandelte Objektträger in frische, vorgekühlte Lyselösung zu tauchen und sie dann im Dunkeln bei vier Grad Celsius für eine Stunde bis über Nacht zu inkubieren. Nehmen Sie anschließend die Objektträger aus der Lyselösung, lassen Sie sie ab und spülen Sie sie dann einmal fünf Minuten lang mit kaltem Neutralisationspuffer aus, um alle Rückstände vor dem alkalischen Wickelschritt zu entfernen.Legen Sie dann die Objektträger in eine Gelelektrophoresekammer, die mit vorgekühltem, frisch hergestelltem Elektrophoresepuffer gefüllt ist, um nicht mehr als 0,5 Zentimeter über den Objektträgern zu liegen. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang im Dunkeln im alkalischen Puffer, um das Abwickeln der DNA und die Expression des alkalischen Schadens zu ermöglichen. Führen Sie dann den Assay 30 Minuten lang bei einem Volt pro Zentimeter bei vier Grad Celsius durch.Nachdem Sie den Kometen-Assay durchgeführt haben, lassen Sie den überschüssigen Elektrophoresepuffer ab und tauchen Sie die Objektträger dann in vorgekühltes destilliertes Wasser bei Raumtemperatur. Tauchen Sie die Objektträger nach fünf Minuten in vorgekühltes, 70%iges Ethanol ebenfalls bei Raumtemperatur. Nach weiteren fünf Minuten lassen Sie die Proben über Nacht trocknen und halten Sie sie von hellem Licht fern.Anschließend die Dias im Kühlschrank 30 Minuten in Cybergrün färben. Entferne nun die Dias und lass sie im Dunkeln vollständig trocknen. Der Aros wird transparent, wenn er vollständig getrocknet ist.Um Bilder aus dem Assay aufzunehmen, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, das auf den Grünfilter eingestellt ist. Öffnen Sie dann das COMET-Assay-Programm, um die aufgenommenen Bilder zu analysieren. Durch Klicken auf die Schaltfläche des Kometenkopfes berechnet die Software die Parameter, einschließlich des mittleren Schweifmoments und der Menge an DNA im Zellkern.Nachdem Sie mindestens 200 Zellen pro Behandlung analysiert haben, exportieren Sie die Daten nach Microsoft Excel, um das mittlere Schwanzmoment zu berechnen und die Daten darzustellen. Diese erste Abbildung zeigt ein Beispiel für eine COMET-Assay-Analyse von neuronalen Zellen mit und ohne Kometenschweif. In diesem zweiten Kometen-Assay, der mit der COMET-Assay-Software analysiert wurde, wurde bestimmt, dass die Bestrahlung der neuronalen Zellen DNA-Schäden induziert, wenn die Zellen dem elektrischen Feld ausgesetzt wurden.Die DNA wanderte aufgrund von Größenunterschieden unterschiedlich schnell und wurde anschließend mit der gängigen Assay-Software analysiert. Dieser erste Screenshot zeigt repräsentative Bilder, die mit dem Fluoreszenzmikroskop und dem COMET-Assay-Programm aufgenommen wurden. Ein Klick auf den Kern oder den Kometenkopf eines Bildes erzeugte eine Fluoreszenzkarte, ein Diagramm und eine Datentabelle.Je stärker die Schädigung der DNA ist, desto weiter wanderte die DNA aus dem Zellkern heraus. Dies führte zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität im Zellkern, die durch die grüne Farbe angezeigt wird, und wird anschließend von der Software detektiert, wodurch ein höheres Schweifmoment erzeugt wird. In dieser letzten Abbildung ist ein repräsentativer Graph des mittleren Schwanzmoments, der durch die Analyse der DNA-Schäden in bestrahlten und nicht bestrahlten neuronalen Zellen unter Verwendung eines neutralen COMET-Assays erhalten wurde, wie erwartet drei durch graue Strahlung induzierte DNA-Schäden dargestellt, wie durch das höhere mittlere Schwanzmoment in den bestrahlten neuronalen Zellen angezeigt.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen sorgfältig zu behandeln, um direkte Lichteinwirkung zu vermeiden und die Temperatur im pH-Wert zu kontrollieren. Auf diese Weise werden die Zellen nicht zusätzlich belastet, was Ihre Ergebnisse nach diesem Verfahren verändern könnte. Andere Methoden, wie z.B. die Analyse von DNA, Reparaturherden mittels Immunfluoreszenzfärbung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, welche DNA-Reparaturwege verändert sind.Zum Beispiel kann eine Immunfluoreszenzfärbung für RAD 51-Foki oder Phospho und DNA-PK-Foci durchgeführt werden, um die homologe Rekombinationsreparatur bzw. die nicht-homologe Rekombinationsreparatur bzw. die Joining-Reparatur zu messen.

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Das Video zeigt den Kometen-Assay zum Nachweis von DNA-Schäden nach Exposition gegenüber schädlichen Stoffen. Unter alkalischen Bedingungen wickelt sich die DNA ab und denaturiert, und bei der Elektrophorese wandern die unbeschädigte und die beschädigte DNA unterschiedlich im Agarosegel und bilden eine kometenförmige Struktur. Die langsam wandernde unbeschädigte DNA bildet den kreisförmigen Kometenkopf, während die schnell wandernden beschädigten DNA-Fragmente den länglichen Kometenschweif...

Comet Assay zur Detektion von DNA-Schäden in Zellen

Wir beschreiben hier eine Plattform, die Comet-Assay Nachweis von DNA-Schäden mit beispielloser Durchsatz ermöglicht. Die Gerätemuster Säugerzellen in einem Microarray und ermöglicht die parallele Verarbeitung von 96 Proben. Der Ansatz erleichtert Analyse der Ausgangsniveau von DNA-Schäden, die Exposition induzierten DNA-Schäden und DNA-Reparatur-Kinetik.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

Comet Assay misst DNA-Brüche, durch verschiedene Faktoren hervorgerufen. Wenn alle Faktoren (außer oxidativer Stress) DNA-schädigenden konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung ist eine gute indirekte Parameter von oxidativem Stress. Das Ziel des Protokolls ist es, Comet-Assay zur indirekten Messung von oxidativem Stress zu verwenden.

Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

Der alkalische Kometen-Assay misst DNA-Strangbrüche in eukaryotischen Zellen. Durch Hinzufügen eines Endonuklease III- oder humanen 8-Oxoguanin-DNA-N-Glykosylase-Verdauungsschritts kann der Assay oxidative DNA-Schäden effizient nachweisen. Wir beschreiben Methoden zur Verwendung dieser Assays zum Nachweis von DNA-Schäden in der Leber von Ratten.

In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber

Die Comet-Assay ist eine effiziente Methode um zu erkennen, dass DNA-Schäden einschließlich Einzel- und Doppelstrang-DNA bricht. Wir beschreiben basische und neutrale Comet Assays zur Messung der DNA-Schäden in den Krebszellen, die therapeutische Wirkung der Chemotherapie zu bewerten.

Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

Dieses Protokoll beschreibt mehrere Verfahren zur Herstellung hochwertiger gefrorener Gewebeproben zum Zeitpunkt der Nekropsie zur Verwendung im Kometentest zur Beurteilung von DNA-Schäden: 1) Hackfleisch, 2) abgekratzte Epithelzellen aus dem Magen-Darm-Trakt und 3) gewürfeltes Gewebe Eine Homogenisierung mit einem Gewebeminincing-Gerät erforderlich.

Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

Der Kometentest ist ein beliebtes Mittel zum Nachweis von DNA-Schäden. Diese Studie beschreibt einen Ansatz zum Ausführen von Objektträgern in repräsentativen Varianten des Kometenassays. Dieser Ansatz erhöhte die Anzahl der Proben signifikant und verringerte gleichzeitig die Assay-Laufzeit, die Anzahl der Objektträgermanipulationen und das Risiko einer Beschädigung von Gelen.

Ein Hochdurchsatz-Comet-Assay-Ansatz zur Beurteilung zellulärer DNA-Schäden

Dieses Protokoll beschreibt eine effektive Methode zur Quantifizierung des Unterschieds in der DNA-Schädigung, die durch Typ-I- und Typ-II-Inhibitoren in FLT3-mutierten Zellen durch Anwendung des Comet-Assays induziert wird.

Comet-Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in FLT3-Mutanten-exprimierenden 32D-Zellen nach Exposition gegenüber Typ-I- und Typ-II-FLT3-Inhibitoren

Assaying β-Amyloid-Toxizität mit Hilfe eines transgenen C. elegans Modell

Wir beschreiben ein Protokoll, das Bildgebung von Mitochondrien ermöglicht in lebenden Nervenzellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie über einen längeren Zeitraum. Imaging über längere Zeiträume durch Lentivirus-vermittelte Expression von mitochondrial gezielte fluoreszierendes Protein und Verwendung eines kostengünstigen Bühne-Top-Inkubator, entworfen und gebaut wurde in unserem Labor durchgeführt.

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

Lernen Sie den Comet-Assay zur Quantifizierung von DNA-Schäden in Hippocampus-Neuronen. Diese Methode nutzt Elektrophorese und Fluoreszenzmikroskopie, um einzelne Neuronen zu analysieren.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

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