Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Ausmaß der DNA-Schäden in Neuronen mit Hilfe des COMET-Assays zu messen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem die Neuronen zunächst verschiedenen DNA-schädigenden Bedingungen ausgesetzt werden, die Neuronen gesammelt und mit aros bei niedrigem Schmelzpunkt gemischt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Neuronen auf Objektträgern zu immobilisieren.

Anschließend werden die Neuronen lysiert und im letzten Schritt einer Elektrophorese unterzogen. Die DNA ist mit Cybergrün gefärbt. Letztendlich werden die Fluoreszenzmikroskopie und die COMET-Assay-Software verwendet, um das Ausmaß der DNA-Schäden in einzelnen Neuronen sichtbar zu machen und zu quantifizieren.

Hallo, mein Name ist Eddie Yang und ich bin Assistenzprofessor in der Abteilung für Radioonkologie an der University of Alabama in Birmingham. Heute stellen wir Ihnen den COMET-Assay vor, eine einfache Methode zum Nachweis von DNA-Schäden in Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie z. B. der Gamma H mit zwei A X Foki-Färbungen sowie der Pulsfeld-Gelelektrophorese, besteht darin, dass diese Technik eine direkte und empfindliche Methode zur Messung von DNA-Schäden ist.

Darüber hinaus kann mit geringfügigen Modifikationen dieser Technik die Art des DNA-Schadens bestimmt werden, da viele Krebstherapien DNA-Schäden in Tumoren induzieren und oft die DNA-Reparaturkapazität verändern. Die Implikationen dieser Technik können auf die Wirksamkeit der Krebstherapie ausgeweitet werden. Frau Samara Noshin, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, wird das Verfahren heute vorführen. Beginnen Sie mit der Ernte von neuronalen Zellen, die unter den gewünschten experimentellen Bedingungen behandelt wurden, in 15-Milliliter-Röhrchen.

Drehen Sie die Röhren fünf Minuten lang bei 1000 mal G und vier Grad Celsius herunter, nachdem Sie den Überstand abgesaugt haben. Suspendieren Sie das Pellet in PBS und schleudern Sie die Zellen nach dem zweiten Waschen wieder herunter. Reanimation suspendiert die Zellen in mehr PBS, zählt sie und bewahrt sie im Dunkeln auf, bis sie im Kometen-Assay verwendet werden.

Um DNA-Schäden vor Beginn des Assays zu vermeiden, schmelzen Sie 1%aros drei Minuten lang in der Mikrowelle, bis alle Körnchen verschwunden sind. Tauchen Sie dann die Objektträger in die geschmolzene Agros und wischen Sie eine Seite mit einem Kim-Tuch sauber. Lassen Sie das Agros an der Luft zu einem transparenten Film trocknen, während das Agros die Lyselösung mindestens eine Stunde lang bei vier Grad Celsius kühlt und schmelzen Sie weiter.

1% niedriger Schmelzpunkt Agros. Kühl. Diese Charge Agros wird eine halbe Stunde lang in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius getestet. Um die künstliche Induktion eines Kometenschweifs zu vermeiden, verdünnen Sie nun die geerntete neuronale Zellsuspension so, dass 100.000 Zellen pro Milliliter entstehen.

Kombinieren Sie die Zellsuspension mit dem 37 Grad Celsius niedrigen Schmelzpunkt Agros bei einem Wirbel von eins zu 10 kurz und verteilen Sie sofort mit der Seite einer Pipettenspitze 50 Mikroliter der Zellsuspension gleichmäßig über den Probenbereich des luftgetrockneten Kometenträgers. Legen Sie die behandelten Objektträger flach für 30 Minuten in den Kühlschrank, bis am Rand des Objektträgers ein Kreis erscheint. Tauchen Sie die Objektträger dann in die vorgekühlte Lyselösung im Dunkeln bei vier Grad Celsius.

Nach 30 Minuten aspirieren Sie die Lyselösung. Dann inkubieren Sie die Objektträger in einem x neutralen Elektrophoresepuffer für eine halbe Stunde im Kühlschrank. Geben Sie als Nächstes einen vorgekühlten x Neutral-Elektrophorese-Puffer in eine Elektrophoresekammer und legen Sie dann die Objektträger in die Elektrophorese-Objektträgerschale, wobei Sie die Objektträger so ausrichten, dass sie gleich weit von den Elektroden entfernt sind.

Nachdem Sie die Kammer so weit gefüllt haben, dass die Objektträger mit 0,2 Zoll eines x neutralen Elektrophoresepuffers bedeckt sind, stellen Sie die Versorgungsspannung auf ein Volt pro Zentimeter ein und führen Sie den Assay 30 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius durch. Beginnen Sie damit, neue mit Agros und neuronalen Zellen behandelte Objektträger in frische, vorgekühlte Lyselösung zu tauchen und sie dann im Dunkeln bei vier Grad Celsius für eine Stunde bis über Nacht zu inkubieren. Nehmen Sie anschließend die Objektträger aus der Lyselösung, lassen Sie sie ab und spülen Sie sie dann einmal fünf Minuten lang mit kaltem Neutralisationspuffer aus, um alle Rückstände vor dem alkalischen Wickelschritt zu entfernen.

Legen Sie dann die Objektträger in eine Gelelektrophoresekammer, die mit vorgekühltem, frisch hergestelltem Elektrophoresepuffer gefüllt ist, um nicht mehr als 0,5 Zentimeter über den Objektträgern zu liegen. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang im Dunkeln im alkalischen Puffer, um das Abwickeln der DNA und die Expression des alkalischen Schadens zu ermöglichen. Führen Sie dann den Assay 30 Minuten lang bei einem Volt pro Zentimeter bei vier Grad Celsius durch.

Nachdem Sie den Kometen-Assay durchgeführt haben, lassen Sie den überschüssigen Elektrophoresepuffer ab und tauchen Sie die Objektträger dann in vorgekühltes destilliertes Wasser bei Raumtemperatur. Tauchen Sie die Objektträger nach fünf Minuten in vorgekühltes, 70%iges Ethanol ebenfalls bei Raumtemperatur. Nach weiteren fünf Minuten lassen Sie die Proben über Nacht trocknen und halten Sie sie von hellem Licht fern.

Anschließend die Dias im Kühlschrank 30 Minuten in Cybergrün färben. Entferne nun die Dias und lass sie im Dunkeln vollständig trocknen. Der Aros wird transparent, wenn er vollständig getrocknet ist.

Um Bilder aus dem Assay aufzunehmen, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, das auf den Grünfilter eingestellt ist. Öffnen Sie dann das COMET-Assay-Programm, um die aufgenommenen Bilder zu analysieren. Durch Klicken auf die Schaltfläche des Kometenkopfes berechnet die Software die Parameter, einschließlich des mittleren Schweifmoments und der Menge an DNA im Zellkern.

Nachdem Sie mindestens 200 Zellen pro Behandlung analysiert haben, exportieren Sie die Daten nach Microsoft Excel, um das mittlere Schwanzmoment zu berechnen und die Daten darzustellen. Diese erste Abbildung zeigt ein Beispiel für eine COMET-Assay-Analyse von neuronalen Zellen mit und ohne Kometenschweif. In diesem zweiten Kometen-Assay, der mit der COMET-Assay-Software analysiert wurde, wurde bestimmt, dass die Bestrahlung der neuronalen Zellen DNA-Schäden induziert, wenn die Zellen dem elektrischen Feld ausgesetzt wurden.

Die DNA wanderte aufgrund von Größenunterschieden unterschiedlich schnell und wurde anschließend mit der gängigen Assay-Software analysiert. Dieser erste Screenshot zeigt repräsentative Bilder, die mit dem Fluoreszenzmikroskop und dem COMET-Assay-Programm aufgenommen wurden. Ein Klick auf den Kern oder den Kometenkopf eines Bildes erzeugte eine Fluoreszenzkarte, ein Diagramm und eine Datentabelle.

Je stärker die Schädigung der DNA ist, desto weiter wanderte die DNA aus dem Zellkern heraus. Dies führte zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität im Zellkern, die durch die grüne Farbe angezeigt wird, und wird anschließend von der Software detektiert, wodurch ein höheres Schweifmoment erzeugt wird. In dieser letzten Abbildung ist ein repräsentativer Graph des mittleren Schwanzmoments, der durch die Analyse der DNA-Schäden in bestrahlten und nicht bestrahlten neuronalen Zellen unter Verwendung eines neutralen COMET-Assays erhalten wurde, wie erwartet drei durch graue Strahlung induzierte DNA-Schäden dargestellt, wie durch das höhere mittlere Schwanzmoment in den bestrahlten neuronalen Zellen angezeigt.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen sorgfältig zu behandeln, um direkte Lichteinwirkung zu vermeiden und die Temperatur im pH-Wert zu kontrollieren. Auf diese Weise werden die Zellen nicht zusätzlich belastet, was Ihre Ergebnisse nach diesem Verfahren verändern könnte. Andere Methoden, wie z.B. die Analyse von DNA, Reparaturherden mittels Immunfluoreszenzfärbung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, welche DNA-Reparaturwege verändert sind.

Zum Beispiel kann eine Immunfluoreszenzfärbung für RAD 51-Foki oder Phospho und DNA-PK-Foci durchgeführt werden, um die homologe Rekombinationsreparatur bzw. die nicht-homologe Rekombinationsreparatur bzw. die Joining-Reparatur zu messen.