Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Dieses experimentelle System bietet eine Hochdurchsatzmethodik zur Überwachung der T-Zell-vermittelten Zytotoxizität auf Einzelzellebene. Zuerst werden die Effektor-T-Zellen markiert und die Tumorzielzellen mit Fluoreszenzfarbstoffen sterben. Laden Sie beide Zelltypen auf die Nano-Well-Arrays und tauchen Sie den gesamten Chip in ein Medium, das Cyt-Grün und fluoreszenzmarkiertes Nexin enthält. Fünf.

Um sowohl nekrotische als auch apoptotische Zellen zu identifizieren, zeichnen Sie nun ein erstes Vorbild auf, um die Well-Belegung und die Zellviabilität zu Beginn des Assays zu bestimmen. Nach einer sechsstündigen Inkubation nehmen Sie ein zweites Bild auf. Verwenden Sie dann eine automatisierte Bildanalyse, um die antigenspezifische Lyse von EL vier CD 19-positiven T-Zellen zu quantifizieren.

Die Ergebnisse dieser Hochdurchsatzmethode können die antigenspezifische Lyse von Zielen durch Effektorzellen auf der Grundlage einer positiven Färbung mit Cytoxin screenen. Fünf. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Chrom-51-Freisetzungsassay besteht darin, dass echte effektive Eins-zu-Eins-Zielinteraktionen erzielt und die Satellitenfrequenz gemessen werden können. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie von Krebs, da sie es ermöglicht, Korrelate der Wirksamkeit in der autologen Zelltherapie zu untersuchen. Um Nano-Wells unter Verwendung des Silizium-Masters herzustellen, mischen Sie zuerst die Basis des Zigarren-180-4-Elastomer-Kits und das Härter gründlich bei einem 10 zu eins Gewichtsverhältnis in einem Einwegbecher mit einem Plastikmesser. Entgasen Sie das Gemisch eine Stunde lang in einer Vakuumkammer.

Gießen Sie dann die Mischung auf den Silikonmaster und lassen Sie sie 30 Minuten ruhen. Um das Elastomer auszuhärten, erhitzen Sie die Baugruppe nun zwei Stunden lang in einem 80 Grad Celsius Ofen, nachdem Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur abgekühlt sind. Entfernen Sie vorsichtig das PDMS-Nano-Well-Array vom Silizium-Master.

Decken Sie es mit Klebeband ab, bis Sie einen Tag vor dem Experiment 5 Millionen Zielzellen in fünf Millilitern verwenden. Der Tag des Experiments. 5 Millionen Zellen werden in einem sterilen konischen 15-Milliliter-Röhrchen durch Zentrifugation bei 340 g für fünf Minuten pelletiert.

Aspirieren Sie überschüssiges Medium und lassen Sie etwa 50 Mikroliter Medium zurück, um die Zellen zu markieren. Fügen Sie 150 Mikroliter der frischen Cell Tracker Red Arbeitslösung hinzu und mischen Sie gründlich mit einer P 200-Pipette, inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Mit einem Hämozytometer werden die Effektorzellen aufgezählt, die aus der Kultur entnommen wurden.

Pelletieren Sie dann 5 Millionen Zellen in einem sterilen konischen 15-Milliliter-Röhrchen durch Zentrifugation. Saugen Sie das überschüssige Medium an. Geben Sie dann eine frische Arbeitslösung aus fünf mikromolaren leuchtenden violetten Färbungen des D-Zyklus hinzu und suspendieren Sie sie mit einer P 200-Pipette.

Inkubieren Sie die Zellen und sterben Sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid bei 6,8 Millilitern und 6,0 Millilitern R-P-M-I-P-L-G-H zu den Ziel- bzw. Effektorzellen und mischen Sie sie durch Pipettieren. Schichten Sie dann langsam 3,5 Milliliter Fial-Pack plus auf den Boden jedes Röhrchens, zentrifugieren Sie beide Röhrchen 30 Minuten lang bei 340 GS ohne Pause und Beschleunigung während der Zentrifugation, bereiten Sie das Nano-Well-Array vor Übertragen Sie zunächst sieben Milliliter PBS aus der Vorkriegszeit auf eine Vier-Well-Platte. Reinigen Sie den Boden des Objektträgers mit Ethanol und einem Plasmaoxidationsmittel.

Behandeln Sie das PDMS 30 bis 45 Sekunden lang mit hoher HF-Einstellung. Platzieren Sie dann das Array in der PBS. Übertragen Sie die Platte in eine Biosicherheitswerkbank und aspirieren Sie überschüssiges PBS, tragen Sie warmes 1%edles Agar auf den oberen und unteren Rand des Glasobjektträgers auf, um das Array zu immobilisieren.

Stellen Sie sicher, dass Sie das PDMS nicht nach 10 Minuten bei drei Millilitern PBS trocknen lassen und aspirieren Sie den überschüssigen Agar. Geben Sie dann drei Milliliter R 10 auf die Oberseite des Nano-Well-Arrays und äquilibrieren Sie es etwa 10 Minuten lang. Im Anschluss an die Fial-Zentrifugation werden fünf Milliliter Medium aus der obersten Schicht jedes Röhrchens abgesaugt.

Achten Sie darauf, die Schicht, die die Zellen enthält, nicht mit einer P 1000-Pipette abzusaugen. Ernten Sie die weiße Zellschicht zwischen dem Fial und dem Medium. Übertragen Sie die Zellen in neue sterile konische Röhrchen.

Waschen Sie nun den geernteten Effektor und die Zielzellen zweimal mit drei Millilitern R-P-M-I-P-L-G-H aus der Vorkriegszeit. Nach der abschließenden Zentrifugation saugen Sie das überschüssige Medium an und resuspendieren das Zellpellet. In 500 Mikrolitern R 10 werden die lebensfähigen Zellen unter Verwendung der Trian-Blau-Ausschlussmethode auf einem Hämozytometer gezählt und das überschüssige Medium aus dem Nano-Array aspiriert.

Dann zwei Milliliter frisches R 10 Aspirat hinzufügen. Auch hier ist darauf zu achten, dass die Oberseite des Nano-Will-Arrays weder zu nass noch zu trocken ist, da dies die Verteilung der Zellen beeinflusst. Legen Sie nun einmal 10 bis ein Fünftel der Fektorzellen in 200 Mikroliter R 10 auf die Nano-Array-Oberfläche ab, damit sich die Zellen fünf Minuten lang absetzen konnten.

Überprüfen Sie dann mit einem Standard-Gewebekulturmikroskop die gewünschte Verteilung der Zellen. Als nächstes legen Sie eins mal 10 bis die fünfte Zielzelle in 200 Mikrolitern R 10 auf die Nanowell-Array-Oberfläche, die die Effektorzellen enthält. Beurteilen Sie nach fünf Minuten die Zellverteilung durch Mikroskopie.

Spülen Sie dann das Nano-Well-Array vorsichtig mit zwei Millilitern R 10 und saugen Sie überschüssiges Medium in einem separaten sterilen konischen 15-Milliliter-Röhrchen an. Pipettieren Sie drei Milliliter vorwarmes R 10 bei drei Mikrolitern 0,5 Millimolar Cyt, grüner Nukleinsäurefärbung und 60 Mikroliter eines X in fünf LOR 6 47, gründlich gemischt durch Pipettieren. Pipettieren Sie nun die Färbelösung vorsichtig auf die Vier-Well-Platte, wobei Sie darauf achten, dass die Zellen nicht aus den Vertiefungen verdrängt werden. Inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und nehmen Sie Bilder des Nano-Well-Arrays mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, wie dem zes observer Z one Mikroskop, das mit einem motorisierten Tisch und Lambda DG vier ausgestattet ist.

Initialisieren Sie die Software und das Mikroskop. Überprüfen Sie die Signalintensität am Sendelicht und den anderen Leuchtstoffkanälen. Passen Sie das Mikroskop-Setup an, um ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten und gleichzeitig eine Sättigung zu vermeiden.

Öffnen Sie nun die X- und Y-Positionsliste für das nelle-Array. Legen Sie die Position des XY-Nullpunkts fest und setzen Sie den Fokus auf die Mitte eines Blocks mit sieben x sieben Nelle-Arrays in der oberen linken Ecke des Stempels für das Nelle-Array. Legen Sie die XY-Positionen so fest, dass sie mit der Mitte jedes Blocks übereinstimmen, und den Z-Wert, um den Fokus auf jedem Block genau widerzuspiegeln.

Stellen Sie nun die Bildaufnahme in den linearen Modus und erfassen Sie Bilder. Nach der ersten Bildgebungsserie stellen Sie die Nano-Well-Arrays für sechs Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Die Pflege der Unruhe kann zu einer Zellverdrängung führen.

Wiederholen Sie dann die Aufnahme der Bilder zum zweiten Zeitpunkt. Dieser zytolytische Hochdurchsatz-Assay misst die Häufigkeit der antigenspezifischen Lyse von CD19-spezifischen CAR-positiven T-Zellen wurden mit markierten Maus-EL-4-Zielzellen in den einzelnen Vertiefungen eines Nano-L-Arrays inkubiert. Die Histogrammdiagramme der Zielzelle stellen Vertiefungen dar, die eine einzelne Effektorzelle und eine einzelne Zielzelle enthalten.

Nach sechsstündiger Co-Inkubation wurden übereinstimmende Histogramme von Zielzellen ohne Effektoren als Negativkontrollen verwendet, um die Häufigkeit des Zelltods im Hintergrund zu melden. Es ist wünschenswert, niedrige Frequenzen der unspezifischen Lyse im Bereich von zwei bis 4 % zu erreichen. Das Nano-Well-Array kann für die Zeitrafferbildgebung angepasst werden, um die Beobachtung des Effektors, der Zielkonjugation und des anschließenden Zelltods zu ermöglichen. Hier wurden unmarkierte autopositive T-Zellen mit NA LM sechs GFP-Zielzellen in einer NOL co-inkubiert und einem dynamischen Monitoring unterzogen.

Wenn ein Xin fünf zu den Kulturmedien hinzugefügt wurde, markierten die apoptotischen Zellen rot Sobald sie beherrscht waren. Diese Technik kann in 10 bis 12 Stunden nach diesem Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt werden. Andere Methoden wie Micro Grabbing können verwendet werden, um das Zytokinsekretionsprofil der Zellen zu bestimmen.