C. elegans Chemotaxis-Assay

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die chemotaktische Reaktion von C. elegans mithilfe eines einfachen und kostengünstigen Tests zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem inszenierte Würmer isoliert und in der Mitte einer markierten Platte platziert werden. Gleich weit entfernt von allen Test- und Kontrollstellen, die an jedem Standort abgelegt werden, befindet sich eine Substanz von Interesse oder eine Kontrollsubstanz, beide kombiniert mit einem Anästhetikum, das die Würmer beim Annähern stoppen wird.

Nach 60 Minuten wird die endgültige Verteilung der Würmer auf der Platte erfasst und das Verhältnis der Würmer-Standorte verwendet, um einen Testindex zu liefern. Letztendlich kann die Quantifizierung der Anziehung von C. elegans auf bestimmte Verbindungen verwendet werden, um die Verhaltensfolgen zugrunde liegender experimenteller Manipulationen zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie viele vorteilhafte Aspekte ihrer Vorgänger einbezieht und gleichzeitig eine größere Benutzerfreundlichkeit ermöglicht.

Dieser Test gibt Einblicke in das Verhalten von C. elegans und ist besonders nützlich in Kombination mit neurogenetischen Manipulationen und anderen neurobiologischen Tests. Beginnen Sie mit fünf Zentimeter Platten, die mit Chemotaxis-Agar oder NGM beladen sind. Markieren Sie die Unterseite der Platten in vier gleiche Quadranten.

Bereiten Sie mindestens drei Platten für mindestens drei Versuche pro genetischer Stamm vor, die getestet werden, und pro getesteter Bedingung. Markieren Sie als Nächstes einen Kreis mit einem Radius von 0,5 Zentimetern um den Ursprung. Markieren Sie dann Punkte in den gegenüberliegenden Quadranten mit einem T für Test oder einem C für Kontrolle und stellen Sie sicher, dass die Stellen gleich weit vom Ursprung und voneinander entfernt sind.

Die Punkte müssen für diesen Test mindestens zwei Zentimeter vom Ursprung entfernt sein. Bereiten Sie junge erwachsene Würmer in synchronisierter Entwicklung auf fünf Zentimeter Chemotaxis-Platten vor. Würmer, die sich in verschiedenen Entwicklungsstadien befinden, können unterschiedlich auf die Analyten reagieren.

Daher ist es sehr wichtig, dass alle für den Test verwendeten Würmer sich in der gleichen Entwicklungsphase befinden. Sobald die Würmer einen Rasen von OP 50 E. coli entfernt haben, pipettieren Sie zwei Milliliter S-Basalpuffer auf die Platte. Manipulieren Sie die Platte, um alle Würmer in den Puffer zu bekommen, um die Würmer zu waschen.

Pipettieren Sie ein Milliliter der Würmer im Puffer in ein Mikrozentrifugenrohr und zentrifugieren Sie sie 10 Sekunden lang. Verwenden Sie eine Pico-Fuge bei 6.600 U/min, um das Basilikum zu aspirieren und lassen Sie das Würmerpellett unberührt. Waschen Sie diese Würmer nun dreimal weiter mit derselben Methode.

Beginnen Sie damit, den S-Basilikum-Puffer zum Rohr hinzuzufügen und das Rohr umzudrehen, um die Würmer wieder in Lösung zu bringen. Zentrifugieren Sie die Würmer nach dem letzten Waschgang noch einmal 10 Sekunden lang und aspirieren Sie dann das Überstand zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern. Stellen Sie als Nächstes eine ausreichende Dichte der Würmer sicher, indem Sie zwei Mikroliter der gewaschenen Würmer aus dem Pellet auf eine NGM-Platte pipettieren.

Es müssen mindestens 50 Würmer sein, aber nicht viel mehr als 250 Würmer. Wenn es zu viele Würmer gibt, erhöhen Sie das Volumen der ESP-Basilikum-Lösung. Und wenn es zu wenige Würmer gibt, zentrifugieren Sie sie und suspendieren Sie sie in einem geringeren Volumen.

Stellen Sie das Würmer-Röhrchen in eine Absaughaube. Sobald sie vorbereitet sind, können die Würmer für bis zu einer Stunde im Chemotaxis-Test verwendet werden. Bereiten Sie zuerst die Lösungen vor.

Mischen Sie die Testlösung, indem Sie gleiche Volumina des Testcompounds mit dem Anästhetikum 0,5 molares Azid kombinieren. Mischen Sie als Nächstes eine Kontrolllösung des Lösungsmittels, das zur Verdünnung des Testcompounds verwendet wird, mit 0,5 molarem Natriumazid. Bereiten Sie nun eine Testplatte vor.

Pipettieren Sie zuerst zwei Mikroliter Würmer-Lösung vom Pellet auf den Ursprung einer Testplatte. Fügen Sie als Nächstes die Odoranten hinzu: Pipettieren Sie zwei Mikroliter der Testlösung auf die beiden T-Stellen und pipettieren Sie zwei Mikroliter der Kontrolllösung auf die beiden C-Stellen. Sobald die Würmer und Odorant-Tropfen in den Agar absorbiert wurden, ersetzen Sie die Deckel, drehen Sie die Platten um und lassen Sie 60 Minuten für die Assay-Zeit.

Um die Diffusionszeit des Natrium-ASI zwischen den Versuchen zu standardisieren. Es ist wichtig, dass die Würmer unmittelbar vor den Odoranten hinzugefügt werden.

Außerdem sollte jede Platte vollständig vorbereitet und der Assay begonnen sein, bevor die nächste Platte vorbereitet wird. Legen Sie nach dem 60-minütigen Versuch die Würmer in einen Kühlschrank bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie später die Platte aus dem Kühlschrank, wenn sie gezählt werden kann.

Wenn Sie sie nicht sofort zählen und die Würmer bei Raumtemperatur lassen, können sie sich möglicherweise mobilisieren. Erneut. Zeichnen Sie die Position von Würmern auf, die den inneren Kreis vollständig verlassen haben, aus den Daten auf. Berechnen Sie den Chemotaxis-Index.

Der Wert reicht von negative eins bis positive eins und repräsentiert maximale Abstoßung bis maximale Anziehung. Wiederholen Sie den Vorgang mit der Kontrolllösung sowohl in den Test- als auch in den Kontrollquadranten. Dies wird als Kontrollplatte dienen. Drei.

Solche Platten sollten für jede experimentelle Bedingung hergestellt und durchgeführt werden. Diacetyl. Ein bekannter C. elegans Chemo-Attraktor wurde verwendet, um Wildtyp-Würmer mit Mutanten zu vergleichen, denen der Rezeptor für Diacetyl fehlt. Wie erwartet, löste Diacetyl eine signifikante chemotaktische Reaktion bei Wildtyp-Würmern aus.

Im Gegensatz dazu wurden die ODR 10-Mutanten nicht mehr von Diacetyl angezogen, als sie es für die Kontrollverbindung Ethanol waren. Sobald gemeistert, kann diese Technik in weniger als 90 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die chemotaktische Reaktion von C. elegans auf Analytlösungen effizient bewerten können.

Achten Sie besonders darauf, sicherzustellen, dass alle getesteten Würmer ein synchronisiertes Entwicklungsstadium erreichen und dass eine ausreichende Anzahl von Würmern eingesetzt wird. Jeder Versuch.