Name: C. elegans Chemotaxis-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Lernen Sie ein kostengünstiges Chemotaxis-Assay zur quantitativen Bewertung des chemotaktischen Verhaltens von Caenorhabditis elegans. Diese Methode ermöglicht die Berechnung eines zuverlässigen Chemotaxis-Index für vergleichende Studien.

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Wir danken Life Sciences und der Fakultät der Künste und Wissenschaften an der Queens University für die Finanzierung dieser Arbeit. Ebenso danken wir der Chin-Sang Labor für die Bereitstellung der benötigten Reagenzien, Geräte und technische Unterstützung. Wir danken auch QGEM 2011 vor allem Tony Er für seinen Beitrag zu der Diskussion.

1. Vorbereiten / Waschen der Worms <ol><li> Synchronisieren Würmer jungen Erwachsenen 11. </li><li> Pipette 2 ml der S Basal auf eine 5 cm Chemotaxis Platte inszenierter Würmer, die nur den Rasen von OP50 E. gelöscht haben coli. Kippen Sie die Platte wie notwendig, um sicherzustellen, dass die Würmer aus der Plattenoberfläche in den Puffer gewaschen werden. </li><li> Je 1 ml der Wurm-S Basal Lösung in ein Reaktionsgefäß. </li><li> Zentrifuge für 10 sec mit einer PicoFuge bei 6.600 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Saugen Sie die S Basal, so dass die Pellets von Würmern ungestört. </li><li> 1 ml S Basal Lösung des Mikrozentrifugenröhrchens, kehren ein paar Mal, um die Würmer zu waschen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,4 bis 1,6 noch dreimal. </li><li> Zentrifuge für 10 sec ein fünftes Mal, diesmal Absaugen der Überstand auf ein Gesamtvolumen von ca. 100 ul. </li><li> Pipette 2 ul der Würmer auf eine NGM Platte, um sicherzustellen, gibt es zwischen 50 und 250 Würmer in jedem 2 ul Probe. Einstellendie Konzentration von Würmern in der S Basal durch Resuspendieren die Würmer in einem kleineren oder größeren Volumens von S Basal benötigt. </li><li> Verwenden Sie die Würmer in dem Test sofort nach dem Waschen die Würmer für bis zu 1 Stunde. </li></ol> 2. Vorbereitung der Test-Platten <ol><li> Kennzeichnung der Unterseite eines 5 cm Platte, teilen Sie die Schale in 4 gleich große Quadranten. Chemotaxis NGM-Agar oder verwendet werden. Ein Minimum von 3 Versuche pro genetische Belastung getestet erforderlich. </li><li> Markieren Sie einen Kreis mit einem Radius von 0,5 cm um den Ursprung (Abbildung 1). </li><li> Markieren Sie einen Punkt in jedem Quadranten entweder mit einem &quot;T&quot; für &quot;Test&quot; oder &quot;C&quot; für &quot;Control&quot;, um sicherzustellen, dass die Seiten gleich weit vom Ursprung und zueinander stehen. Die Punkte müssen mindestens 2 cm vom Ursprungs sein. Markieren Sie die oben links und unten rechts Quadranten als Test-Quadranten und dem oberen rechten und unteren linken Quadranten als Kontrollen (Abbildung 1). </li></ol> 3. Ausführen des Assay </p&gt; <ol><li> Mischen Sie die Testlösung durch die Kombination von gleichen Volumina der Testverbindung und 0,5 M Azid (ein Anästhetikum verwendet werden, um die Würmer bei Erreichen eines Quadranten verhaften). Mischen der Kontrolllösung durch Kombinieren des verwendeten Lösungsmittels, um die Testverbindung mit 0,5 M Azid verdünnen. </li><li> Pipette 2 ul der Wurm-Lösung (hergestellt in 1.8) aus dem Pellet auf die Herkunft (wo sich die beiden Linien schneiden). </li><li> Unmittelbar nach, Pipette 2 ul der Testlösung auf die beiden &quot;T&quot;-Websites. Ebenso pipettieren die gleiche Menge der Kontroll-Lösung auf die beiden &quot;C&quot;-Sites. </li><li> Sobald die Schnecke und Geruchsstoff Tropfen in den Agar absorbiert wurden, ersetzen Sie den Deckel und drehen Sie die Platten. </li><li> Nach 60 min, legen die Würmer in einem 4 ° C Inkubator. Nur nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator, wenn sie gezählt werden können. Weggehen Würmer bei Raumtemperatur kann es ihnen ermöglichen, wieder zu mobilisieren. </li><li> Notieren Sie sich die Anzahl der Würmer in jedem Quadranten, die vollständig überquert die innere circle. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.6 mit der Kontroll-Lösung sowohl in der Test-und Kontrollgruppe Quadranten. Dies wird als der Steuerscheibe dienen. Drei solcher Platten werden sollten, und laufen als entsprechende Steuerung dienen. </li></ol> 4. Die Interpretation der Ergebnisse / Bestimmung der Chemotaxis Index <ol><li> Berechnen Sie die Chemotaxis Index mit Gleichung 1. Dies ergibt eine chemotaktische Index zwischen -1.0 und +1.0. </li></ol> (1) Chemotaxis Index = (# Worms in beiden Versuchsreihen Quadranten - # Worms bei den Kontroll-Quadranten) / (Gesamtanzahl erzielter Worms) A +1.0 Punkte zeigt maximale Anziehungskraft in Richtung des Ziels und stellt 100% der Würmer Ankunft in den Quadranten mit der chemischen Ziel. Ein Index von -1.0 ist ein Beweis für maximale Abstoßung. Ähnliche Testverfahren wurden bereits 3 (Tabelle 1) eingesetzt. <ol start="2"><li> Melden Sie den Mittelwert Chemotaxis Index (CI) und Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Mache eine Student-T-Test Vergleich der Daten aus den Versuchs-und Kontrollgruppen Platten. </li></ol>

<ol><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li>
<li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+preference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li>
<li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li>
<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li>
<li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Positive+Butanone+Learning%2C+Short-term%2C+and+Long-term+Associative+Memory+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).</li>
<li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+chemotaxis+responses%3A+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li>
<li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467(2008).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods%3A+Synchronization+and+Observation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).</li>
<li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li>
<li>Hart, A. C. Behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHart%2C+AC+%22WormBook%22">WormBook</a>. , (1895).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Chemotaxis, obwohl durch eine komplexe Reihe von neuronalen und zellulären Mechanismen gesteuert werden, können leicht und objektiv quantifiziert mit Chemotaxisassays sein. Um die besten Ergebnisse aus den Tests zu erhalten, müssen bestimmte kritische Schritte unternommen werden. Erstens, die Inszenierung der Würmer ist wichtig, was in Einklang experimentellen Ergebnisse. Worms in verschiedenen Lebensphasen unterschiedlich verhalten 13; so gemischten Bühne Würmer können Skew experimentellen Ergebnisse. Zweite...

Ward entwickelte die erste Chemotaxisassay 1973 5, und seitdem hat weitreichende Anwendungen. Neurobiologie ist ein Feld, das von der Verwendung einer Vielzahl von Chemotaxisassays profitiert hat. Olfaktorischen Adaption, eine einfache Form von Lernen und Gedächtnis, hat in C nachgewiesen elegans mit Chemotaxisassays 6. Sie sind auch verwendet worden, um zu zeigen, dass C. elegans entwickeln können Ethanol-Toleranz ein Ergebnis, das zeigt nicht nur das Verhalten Plastizität der Würmer, aber das zeigt auch, dass die Würmer kann sehr nützlich sein bei der Untersuchung der Abhängigkeit von Alkohol in Menschen 3. Assays wurden auch entwickelt, um die Fähigkeit zu demonstrieren C. elegans zu speichern kurz-und langfristigen Speicher durch die zeigen, dass Verbände von den Würmern zwischen Lockstoffe und Nahrungsmittel (OP50) 7 gemacht werden. Darüber hinaus die umfangreichen derzeit verfügbaren Informationen über die C gegeben elegans Genoms, die chemotaxis Verhalten von C. elegans wurde mehrfach durch Mutationen induzieren 1,8 verändert. Dies ermöglicht viele spannende Möglichkeiten Engineering, wie die Entwicklung von C. elegans als bioremediation Tool. So, da die anfängliche Entwicklung des Chemotaxis-Assay im Jahr 1973 hat es sich häufig verändert und verwendet, um Geheimnisse in einer Vielzahl von Disziplinen aufzuklären. Bestimmte Tests zum Ziel, die spezifische Route von den Würmern zu einem Ziel gemacht zu entdecken. Die prototypische Assay dieser Art wurde von Ward 5 entwickelt. Drei Würmer wurden am geschmolzene Agar für 15 min platziert. Ihre Bewegungen wurden durch den Aufdruck sie bleiben, wie sie von der Peripherie der Platte bis zu einer Steigung ein Lockmittel in der Mitte der Platte reiste zurückverfolgt. Alle Würmer auf der Platte wurden verhaftet mit Chloroform am Ende jeder Studie. Ein Nachkomme dieser Methode platziert einen einzigen Wurm in der Mitte der Platte mit dem Lockstoff und der Kontrolle einert gleich und entgegengesetzt Abstände vom Ursprung 2. Pierce-Shimomura et al. entwickelte einen Test, um die genaue Art der Bewegung in Chemotaxis 9 beteiligt beobachten. Einzelne Würmer wurden in 9 cm Petrischalen entweder mit einer einheitlichen Konzentration der Lockstoff oder einer radialen geformten Verlauf angeordnet ist, die ihren Höhepunkt in der Quelle der Lockstoff. Ein Computer-Software-Programm, das die Schnecke erkannt wurde verwendet, um das beobachtete Verhalten aufzuzeichnen. Ein Video-Kamera, die an einem Mikroskop gearbeitet in Verbindung mit der Stufe, um die Petrischale automatisch als der Test lief, um sicherzustellen, die Schnecke blieb im Blickfeld. Daraus wurde mehr detaillierte Informationen über die Ursache entdeckt Pirouetten von C. angezeigt elegans. Andere Tests, ähnlich wie die hier beschriebenen, testeten die Reaktion von einer großen Population von Würmern zu testen Verbindungen. Zwei-Quadranten-Chemotaxis-Assays wurdenverwendet werden, um die Rollen zu erforschen, die verschiedenen Neuronen, Rezeptoren und Signaltransduktionsmoleküle wenn C gespielt elegans wurde verschiedenen Verbindungen 1 ausgesetzt. 20-50 gewaschenen Würmer in der Nähe der Mitte der Platte mit einem Lockstoff und eine Steuereinheit an polaren Enden zusammen mit dem Anästhetikum, Natriumazid (NaN 3) angeordnet ist. Nach 60 min wurde eine chemotaktischen Index mit Werten von -1,0 bis +1,0 der Grundlage der Differenz zwischen dem, wie viele Würmer wurden dem Lockstoff oder der Steuerung befestigt erzeugt. Eine ähnliche chemotaktischen Index wurde in dem Assay in diesem Artikel berichtet verwendet, obwohl die zuvor Assay nicht streng bewerten unbewegliche Würmer. Dieser Assay wurde dann weiter auf das Testen der Wirkungen von neuronalen Ablation auf die Chemotaxis aufgebracht. Eine weitere Variante des vorstehend genannten Assay wurde durchgeführt, wobei 100-200 Würmer in der Mitte einer Platte mit vier Quadranten 3 angeordnet wurden. Benachbarten Quadranten enthalten entweder den Test oderKontrollsubstanz. Wie in früheren Untersuchungen wurden die Würmer durch Einwirkung von Natriumazid bevor erzielt immobilisiert. Ein ähnliches Verfahren wird hier als eine Möglichkeit der Auswertung der Reaktion von C beschrieben elegans, um verschiedene Verbindungen. Jedoch hat das Verfahren unter den zusätzlichen Vorteil, nur die Bewertung Würmer, die einen Schwellenwert trennende Abstand von unbeweglichen Würmer mobilen bestanden haben. Andere Tests haben ähnliche Richtlinien zu ignorieren immobile Würmer eingearbeitet. Frøkjær-Jensen et al. entwickelten ein vielseitiges Assay, der zum Testen sowohl flüchtige als auch wasserlösliche Verbindungen 10 werden kann. Eine Petrischale wurde in vier Quadranten unterteilt. Die oberen und unteren Quadranten nicht enthalten Lösungsmittel. Die linken Quadranten enthalten Wasser und die rechte enthielt das Lockmittel. Beim Testen flüchtige Riechstoffe wurde der Analyt auf dem Deckel der Schale angeordnet ist, über den entsprechenden Quadranten, während wasserlösliche Verbindungen wurden direkt am aga platziertr. Die Verfahren, die derzeit existieren für die Bewertung der chemotaktischen Reaktion von C. elegans werden ständig verfeinert, um ihre Benutzerfreundlichkeit, Effizienz und Genauigkeit zu optimieren. Also, während der Test hier beschrieben hat die Fähigkeit zur Beurteilung der größten Anzahl von Würmern (maximaler Durchsatz:. 250 Würmer / Stunde pro Platte, etwas größer als der Durchsatz von Lee et al 3 gezeigt), die wahre Stärke dieser Methode ist die prägnanten Höhepunkt von vielen der Attribute der früheren Assays (Tabelle 1).

<table><tbody><tr><td>S Basal (- Cholesterin) [5,8 g NaCl; 1 M K Phosphat-Puffer, pH 6,0; dH2O auf 1 Liter.] Autoklavieren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoFuge</td><td>Stratagene</td><td>400552</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissektion</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Natriumazid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemotaxis-Agar [1,6% BBL-Agar (Benton-Dickinson) oder 2% Difco-Agar. Autoklavieren. Fügen Sie 5 mM Kaliumphosphat, pH 6,0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 hinzu]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol/Destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Testverbindungen (z.B. 0,5% Diacetyl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0600</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>CA97062-046</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>VWR</td><td>CA12001-120</td><td></td></tr><tr><td>NH4OH</td><td>BDH</td><td>CABDH8641-2</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans chemotaxis-assay

C. elegans Chemotaxis Assay

Viele Organismen verwenden Chemotaxis zu suchen, Nahrungsquellen, vermeiden Schadstoffe und finden mates. Caenorhabditis elegans hat eine beeindruckende Chemotaxis Verhalten. Die Prämisse Prüfung des Ansprechens die Würmer zu einem Duftstoff ist, sie in einem Bereich zu platzieren und beobachten die Bewegung in Reaktion auf einen Geruchsstoff hervorgerufen. Auch mit den vielen verfügbaren Assays optimieren Wurm Ausgangsposition relativ zu sowohl der Steuer-und Testflächen, bei gleichzeitiger Minimierung der Interaktion von Würmern mit einander, während eine signifikante Stichprobengröße bleibt ein work in progress 1-10. Die hier beschriebene Methode zielt darauf ab, diese Probleme durch Änderung der Assay durch Bargmann et al. 1 entwickelt anzugehen. Eine Petrischale in vier Quadranten unterteilt ist, sind zwei gegenüberliegende Quadranten mit der Aufschrift &quot;Test&quot; und zwei &quot;Control&quot; bezeichnet. Betäubungsmittel wird in allen Test-und Kontrollgruppe Websites platziert. Die Würmer sind in der Mitte der Platte mit einem circl platzierte um den Ursprung markiert, um sicherzustellen, dass unbewegliche Würmer werden ignoriert. Mit Hilfe eines Vier-Quadranten-System anstatt einer 2 oder zwei 1 eliminiert Verzerrungen bei der Bewegung der Würmer, da sie gleich weit von Test-und Kontrollproben sind, unabhängig davon, auf welcher Seite des Ursprungs sie begann. Dies umgeht das Problem der Würmer ist gezwungen, durch ein Cluster von anderen Würmern zu reisen, um zu einem Geruchsstoff, die Würmer verzögern können oder sie zu zwingen, einen Umweg zu nehmen, was zu einer falschen Interpretation ihrer vorgesehenen Weg zu reagieren. Diese Methode zeigt auch praktische Vorteile durch einen größeren Stichprobenumfang und so der Forscher, um die Assay unbeaufsichtigt laufen und schießen die Würmer, wenn die Redezeit ist abgelaufen.

Vergleich Wildtyp (N2) C. elegans zur odr-10 (KY10)-Mutante. Wir verwendeten Diacetyl, eine bekannte C. elegans Lockstoff, um Wildtyp-Würmern der einer Mutante, die den Rezeptor für Diacetyl 1,12 fehlt vergleichen. Für Wildtyp (N2) Würmer die chemotaktische Index war 0,100 ± 0,066 zu Ethanol und 0,839 ± 0,031 bis 0,5% Diacetyl. Wie erwartet, löst Diacetyl einen signifikanten chemoattractive Antwort von Wildtyp-Würmer (P &lt;0,003). Dagegen sind die...

Verfahren zur quantitativen Bewertung der chemotaktischen Reaktion von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Beschrieben. A chemotaktischen Index (CI) wurde als eine Möglichkeit, genau zu ermitteln Reaktion von Würmern zu bestimmten Zielen und als Plattform des Vergleichs zwischen Stämmen und Verbindungen von Interesse verwendet.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die chemotaktische Reaktion von C. elegans mithilfe eines einfachen und kostengünstigen Tests zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem inszenierte Würmer isoliert und in der Mitte einer markierten Platte platziert werden. Gleich weit entfernt von allen Test- und Kontrollstellen, die an jedem Standort abgelegt werden, befindet sich eine Substanz von Interesse oder eine Kontrollsubstanz, beide kombiniert mit einem Anästhetikum, das die Würmer beim Annähern stoppen wird.Nach 60 Minuten wird die endgültige Verteilung der Würmer auf der Platte erfasst und das Verhältnis der Würmer-Standorte verwendet, um einen Testindex zu liefern. Letztendlich kann die Quantifizierung der Anziehung von C. elegans auf bestimmte Verbindungen verwendet werden, um die Verhaltensfolgen zugrunde liegender experimenteller Manipulationen zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie viele vorteilhafte Aspekte ihrer Vorgänger einbezieht und gleichzeitig eine größere Benutzerfreundlichkeit ermöglicht.Dieser Test gibt Einblicke in das Verhalten von C. elegans und ist besonders nützlich in Kombination mit neurogenetischen Manipulationen und anderen neurobiologischen Tests. Beginnen Sie mit fünf Zentimeter Platten, die mit Chemotaxis-Agar oder NGM beladen sind. Markieren Sie die Unterseite der Platten in vier gleiche Quadranten.Bereiten Sie mindestens drei Platten für mindestens drei Versuche pro genetischer Stamm vor, die getestet werden, und pro getesteter Bedingung. Markieren Sie als Nächstes einen Kreis mit einem Radius von 0,5 Zentimetern um den Ursprung. Markieren Sie dann Punkte in den gegenüberliegenden Quadranten mit einem T für Test oder einem C für Kontrolle und stellen Sie sicher, dass die Stellen gleich weit vom Ursprung und voneinander entfernt sind.Die Punkte müssen für diesen Test mindestens zwei Zentimeter vom Ursprung entfernt sein. Bereiten Sie junge erwachsene Würmer in synchronisierter Entwicklung auf fünf Zentimeter Chemotaxis-Platten vor. Würmer, die sich in verschiedenen Entwicklungsstadien befinden, können unterschiedlich auf die Analyten reagieren.Daher ist es sehr wichtig, dass alle für den Test verwendeten Würmer sich in der gleichen Entwicklungsphase befinden. Sobald die Würmer einen Rasen von OP 50 E. coli entfernt haben, pipettieren Sie zwei Milliliter S-Basalpuffer auf die Platte. Manipulieren Sie die Platte, um alle Würmer in den Puffer zu bekommen, um die Würmer zu waschen.Pipettieren Sie ein Milliliter der Würmer im Puffer in ein Mikrozentrifugenrohr und zentrifugieren Sie sie 10 Sekunden lang. Verwenden Sie eine Pico-Fuge bei 6.600 U/min, um das Basilikum zu aspirieren und lassen Sie das Würmerpellett unberührt. Waschen Sie diese Würmer nun dreimal weiter mit derselben Methode.Beginnen Sie damit, den S-Basilikum-Puffer zum Rohr hinzuzufügen und das Rohr umzudrehen, um die Würmer wieder in Lösung zu bringen. Zentrifugieren Sie die Würmer nach dem letzten Waschgang noch einmal 10 Sekunden lang und aspirieren Sie dann das Überstand zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern. Stellen Sie als Nächstes eine ausreichende Dichte der Würmer sicher, indem Sie zwei Mikroliter der gewaschenen Würmer aus dem Pellet auf eine NGM-Platte pipettieren.Es müssen mindestens 50 Würmer sein, aber nicht viel mehr als 250 Würmer. Wenn es zu viele Würmer gibt, erhöhen Sie das Volumen der ESP-Basilikum-Lösung. Und wenn es zu wenige Würmer gibt, zentrifugieren Sie sie und suspendieren Sie sie in einem geringeren Volumen.Stellen Sie das Würmer-Röhrchen in eine Absaughaube. Sobald sie vorbereitet sind, können die Würmer für bis zu einer Stunde im Chemotaxis-Test verwendet werden. Bereiten Sie zuerst die Lösungen vor.Mischen Sie die Testlösung, indem Sie gleiche Volumina des Testcompounds mit dem Anästhetikum 0,5 molares Azid kombinieren. Mischen Sie als Nächstes eine Kontrolllösung des Lösungsmittels, das zur Verdünnung des Testcompounds verwendet wird, mit 0,5 molarem Natriumazid. Bereiten Sie nun eine Testplatte vor.Pipettieren Sie zuerst zwei Mikroliter Würmer-Lösung vom Pellet auf den Ursprung einer Testplatte. Fügen Sie als Nächstes die Odoranten hinzu: Pipettieren Sie zwei Mikroliter der Testlösung auf die beiden T-Stellen und pipettieren Sie zwei Mikroliter der Kontrolllösung auf die beiden C-Stellen. Sobald die Würmer und Odorant-Tropfen in den Agar absorbiert wurden, ersetzen Sie die Deckel, drehen Sie die Platten um und lassen Sie 60 Minuten für die Assay-Zeit.Um die Diffusionszeit des Natrium-ASI zwischen den Versuchen zu standardisieren. Es ist wichtig, dass die Würmer unmittelbar vor den Odoranten hinzugefügt werden.Außerdem sollte jede Platte vollständig vorbereitet und der Assay begonnen sein, bevor die nächste Platte vorbereitet wird. Legen Sie nach dem 60-minütigen Versuch die Würmer in einen Kühlschrank bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie später die Platte aus dem Kühlschrank, wenn sie gezählt werden kann.Wenn Sie sie nicht sofort zählen und die Würmer bei Raumtemperatur lassen, können sie sich möglicherweise mobilisieren. Erneut. Zeichnen Sie die Position von Würmern auf, die den inneren Kreis vollständig verlassen haben, aus den Daten auf. Berechnen Sie den Chemotaxis-Index.Der Wert reicht von negative eins bis positive eins und repräsentiert maximale Abstoßung bis maximale Anziehung. Wiederholen Sie den Vorgang mit der Kontrolllösung sowohl in den Test- als auch in den Kontrollquadranten. Dies wird als Kontrollplatte dienen. Drei.Solche Platten sollten für jede experimentelle Bedingung hergestellt und durchgeführt werden. Diacetyl. Ein bekannter C. elegans Chemo-Attraktor wurde verwendet, um Wildtyp-Würmer mit Mutanten zu vergleichen, denen der Rezeptor für Diacetyl fehlt. Wie erwartet, löste Diacetyl eine signifikante chemotaktische Reaktion bei Wildtyp-Würmern aus.Im Gegensatz dazu wurden die ODR 10-Mutanten nicht mehr von Diacetyl angezogen, als sie es für die Kontrollverbindung Ethanol waren. Sobald gemeistert, kann diese Technik in weniger als 90 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die chemotaktische Reaktion von C. elegans auf Analytlösungen effizient bewerten können.Achten Sie besonders darauf, sicherzustellen, dass alle getesteten Würmer ein synchronisiertes Entwicklungsstadium erreichen und dass eine ausreichende Anzahl von Würmern eingesetzt wird. Jeder Versuch.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir Methoden zu testen, C. elegans assoziativen Lernens sowie kurz-und langfristigen assoziativen Gedächtnisses. Diese Bevölkerung Assays verwenden die Würmer Fähigkeiten chemotax Richtung flüchtigen Geruchsstoffe und bilden positive Assoziationen bei Paarung Essen mit dem Lockstoff Butanon. Erhöhung der Zahl der Konditionierung Perioden induziert Langzeitgedächtnis.

C. elegans Positive Butanone Learning, kurzfristige und langfristige Assoziative Speicher Assays

Die ECIS / Taxis-System ist ein automatisiertes Echtzeit-Assay misst die zelluläre Chemotaxis. In diesem Assay verschieben Zellen unter einer Schicht aus Agarose auf ein Ziel Elektrode ankommt. Zelluläre Bewegung wird durch das Einsetzen des Widerstands in Wechselstrom 0 gemessen.

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Dieses Video stellt die Chemotaxis beim Fadenwurm C. elegans vor und zeigt ein Beispielprotokoll, das die chemotaktische Abneigung gegen Kupfersulfat testet.

C. elegans Chemotaxis-Assay: Eine Methode zum Testen der Chemoempfindung bei Würmern

Forscher können On-Demand-Bewegung in C. elegans auslösen, indem sie ein elektrisches Feld anlegen, das Würmer wahrnehmen und darauf reagieren. Dieses Video stellt elektrotaktisches Verhalten vor und zeigt ein Beispielprotokoll, das in einem mikrofluidischen Gerät durchgeführt wird.

Elektrotaxis-Assay: Eine Methode zur Beobachtung der Fortbewegung bei C. elegans

Eine halbautomatische mikroelektromechanischen fluidischen Verfahren zur On-Demand-Fortbewegung in...

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Wir beschreiben Methoden, um Aspekte der amylopathies in der Schnecke zu...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Wir stellen ein Verhaltensaufzeichnungs-Setup und -Protokoll vor, das eine automatisierte Analyse des Nematoden ermöglicht, Caenorhabditis elegans 'Präferenz für lösliche Verbindungen in einem Populations-basierten Assay. Dieser Artikel beschreibt den Aufbau einer Verhaltenskammer, das Verhaltenstestprotokoll und die Analyse der Videoanalyse.

Automatisierte Analyse eines Nematoden-Populations-basierten Chemosensorischen Präferenzassays

Wir haben zuvor Protokolle für Caenorhabditis elegans entwickelt, um kurz- und langfristige assoziative Erinnerungen durch massiertes bzw. räumliches Training zu bilden. Hier werden detaillierte Protokolle für die Konditionierung von C. elegans beschrieben, indem 1-Propanol und Salzsäure als konditionierte bzw. unkonditionierte Stimuli gepaart werden, um ein aversives assoziatives Gedächtnis zu bilden.

Aversives assoziatives Lernen und Gedächtnisbildung durch Paarung zweier Chemikalien in Caenorhabditis elegans

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um assoziatives Lernen durch klassische Konditionierung im Modellorganismus C. elegans zu testen. Das Paradigma basiert auf der Paarung der Salzkonzentration in der Umwelt mit dem Vorhandensein oder Fehlen von Nahrung, was ihre Chemotaxis in Richtung oder weg von Salz verändert.

Messung des assoziativen Lernens in der Chemotaxis des Fadenwurms Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll etabliert Methoden zur Extraktion und Quantifizierung von Reaktionen auf das flüchtige Sexualpheromon in C. elegans und stellt Werkzeuge zur Untersuchung der chemischen Kommunikation und Navigationsbahn zur Verfügung.

Extraktion von flüchtigen Sexualpheromonen und Chemoattraction-Assay bei Caenorhabditis elegans

Lernen Sie ein kostengünstiges Chemotaxis-Assay zur quantitativen Bewertung des chemotaktischen Verhaltens von Caenorhabditis elegans. Diese Methode ermöglicht die Berechnung eines zuverlässigen Chemotaxis-Index für vergleichende Studien.

C. elegans Chemotaxis-Assay

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