Name: Antigene geschützten funktionellen Red Blood Cells durch die Membran Pfropfung von Compact hyperverzweigten Polyglycerinen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Lernen Sie die Membranmodifikation von Erythrozyten mit hyperverzweigtem Polyglycerol zur Antigenmaskierung. Diese Methode ermöglicht die Herstellung funktioneller Blutkonserven für Transfusionsmedizin.

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Diese Arbeit wurde von der kanadischen Blood Services (CBS) und der Canadian Institutes of Health Science (CIHR) Research Partnership Fund finanziert. Die Autoren danken der LMB Makromolekül Hub an der UBC Centre for Blood Research für die Nutzung ihrer Forschungs-einrichtungen. Die Infrastruktur Einrichtung wird von der Canada Foundation for Innovation (CFI) und der Michael Smith Foundation for Health Research (MSFHR) unterstützt. R. Chapanian ist ein Empfänger (CIHR / CBS) Postdoc-Stipendien in Transfusion Wissenschaft und Empfänger von MSFHR Nachwuchsforscher Postdoc-Stipendium. JN Kizhakkedathu ist ein Empfänger MSFHR Career Investigator Scholar Award.

A. Hyperverzweigte Polyglycerin Modification (SS-HPG) <ol><li> Ort lyophilisiert HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) in einem Rundkolben und trocknen über Nacht unter Vakuum bei 90 ° C. </li><li> Gekühlt wird der Kolben auf Raumtemperatur und lösen das getrocknete HPG in wasserfreiem Pyridin (3 ml). </li><li> Bis etwa acht Hydroxylgruppen auf HPG mit Carboxylgruppen funktionalisiert, fügen katalytischen Menge von Dimethylaminopyridin (ein Tropfen von 5 mg / ml Lösung in Pyridin) zu der HPG Lösung. Zu dieser Mischung hinzuzufügen Bernsteinsäureanhydrid, (0,0067 g, 0,0664 mmol), gelöst in 0,5 ml Pyridin tropfenweise über 10 min. Rühren Sie die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon. </li><li> Ausfällen des Gemisches in 40 ml kaltem Aceton (4 ° C) in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren mit einem Beckman J2-MC-Zentrifuge bei 27.000 g für 15 min. Den Überstand umfüllen, und entfernen Sie Restaceton durch Spülen mit Argon bei Raumtemperatur. </li><li> Um die Aktivierung Carboxyl Gruppen mit Succinimidylsuccinat (SS)-Gruppen, löst den Carboxyl-funktionalisierten HPG in 3 ml wasserfreiem DMF. Add N-Hydroxysuccinimid (0,0077 g, 0,0664 mmol) und N, N&#39;-Diisopropylcarbodiimid (0,0084 g, 0,0664 mmol) der HPG-Lösung und rühren Sie die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon. </li><li> Reinigen die SS-HPG durch Fällung in kaltem Aceton. </li><li> Entfernen Restaceton durch Spülen mit Argon. </li><li> Bestimmen die Reinheit von modifizierten HPG und den Grad der Carboxyl-und SS Funktionalisierung durch Proton (1 H) - NMR-Analyse. </li></ol> B. Vollblut Sammlung und Trennung von Red Blood Cells (RBC) <ol><li> Vollblut (40% Hämatokrit, 3 ml) von zugestimmt gesunden menschlichen Spendern in ein Citrat Vacutainer-Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren Citrat Röhrchen bei 1.000 xg für 4 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, Plasma und Blutplättchen enthält, und die Zwischen-Buffy-Coat, der weißen Blutkörperchen und platele enthältts mit einer Pasteurpipette. </li><li> Übertragen aus roten Blutkörperchen (80% Hämatokrit, 1,2 ml) in ein 12 ml-Falcon-Zentrifugenrohr und fügen PBS-Puffer (8 ml, pH = 8,0), um Erythrozyten zu waschen. </li><li> Mix RBCs durch Inversion einheitlichen Zellverteilung erhalten. </li><li> Zentrifugieren Falcon-Röhrchen bei 1.000 xg für 4 min, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Waschen mit PBS RBCs zwei weitere Male durch Wiederholen der Schritte 5 und 6. </li><li> Ort gepackte Erythrozyten (100 ul) in 1,6 ml Eppendorf-Röhrchen, und fügen PBS-Puffer (300 ul, pH = 8,0) zu 20% Hämatokrit RBCs erhalten. </li></ol> C. HPG Pfropfen zu RBCs <ol><li> Unmittelbar nach der Fällung von modifizierten HPG in Aceton in Schritt A6 Ort SS-HPG (150 mg) in einem Glasfläschchen (1 dram) und löst ihn in PBS-Puffer (300 ul, pH = 8,0). </li><li> Hinzufügen SS-HPG Polymerlösung in 20% Hämatokrit gewaschen RBCs, um ein Endvolumen von 400 ul und SS-HPG Konzentration, die von 0,5 mm bis 3 mm reicht erhalten. Zum Beispiel zur Vorbereitung RBCs mit 0,5 mM behandelt SS-HPG, entfernen Sie 36 ul PBS aus der gewaschenen RBC und legen 36 ul der SS-HPG Polymerlösung. </li><li> Vortex die Aussetzung vorsichtig und legen Sie die Eppendorf-Röhrchen auf einem Schüttler bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Zentrifugieren Eppendorf-Röhrchen bei 1.000 xg für 4 min, und Pipette aus dem Überstand. </li><li> 1 ml PBS, um Erythrozyten zu waschen, zentrifugieren und den Überstand. </li><li> 1 ml Kochsalzlösung und waschen RBCs zweimal wie in Schritt 5. </li><li> Fügen Sie 300 ul Kochsalzlösung zu 100 ul roten Blutkörperchen (80% Hämatokrit) bis zu einer Endkonzentration von 20% Hämatokrit. </li></ol> D. Charakterisierung von HPG Modified RBCs I. Komplement-vermittelte Lyse <ol><li> Sammle rund 8 ml Vollblut von gesunden menschlichen Spendern in BD Vacutainer Glas Serum-Röhrchen, und erlauben die Blutgerinnung bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Zentrifugieren bei 2.000 xg für 10 min und sammeln rund 3 ml Serum. </li><li> Ein Milliliter der serum wurde in einem Wasserbad bei 60 ° C für 30 min bis hitzeinaktiviertes Serum vorzubereiten platziert. </li><li> Fügen Sie 60 ul frisches Serum oder Hitze inaktivierten Serum in ein Eppendorf-Röhrchen, die 60 ul 20% Hämatokrit HPG veränderten Erythrozyten oder unmodifizierte RBCs enthalten. </li><li> Inkubieren RBCs für 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Um die Menge an Hämoglobin in der Zellsuspension, erfolgt 5,9 ul 20% Hämatokrit von HPG modifizierten oder unmodifizierten RBCs Zellen in dreifacher Ausfertigung in 96-Well-Platte zu quantifizieren. Hinzufügen 294 ul Drabkin-Reagenz (ein Reagenz, mit dem die Menge an Hämoglobin spectrophotomerically quantifizieren ist). Mix-Zellen mit Drabkin-Reagenz durch Pipettieren in und out. Messen Sie die Absorption des Hämoglobins cyanoderivative bei 540 nm mit SPECTRA MAX 190 Plattenlesegerät. </li><li> Um die Menge an Hämoglobin im Überstand quantifizieren, zentrifugieren Zellen bei 13.000 × g für 1 min. Platz 50 ul des Überstandes in dreifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Platte. Fügen Sie 250 ul Drabkin-Reagenz. Mischung Zellen mit Drabkin-Reagenzdurch Pipettieren in und out. Messen Sie die Absorption des Hämoglobins cyanoderivative bei 540 nm mit SPECTRA MAX 190 Plattenlesegerät. </li><li> Quantifizierung der Menge an lysierten Zellen aus dem Verhältnis von Hämoglobin im Überstand (Schritt 7) und dem Gesamt-Hämoglobin in der Probe (Schritt 6) 8, 11, 12. </li></ol> II. Die Tarnung von Dur und Moll Antigene mit MTS-Karten <ol><li> Platz 50 ul der HPG modifizierte RBC (10% Hämatokrit) in ein Eppendorf-Röhrchen, Zentrifuge bei 1.000 xg für 1 min, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Fügen Sie 110 ul MTS Verdünnungsmittel zu dem Zellpellet und homogenisieren die Zellsuspension durch Pipettieren in und out. </li><li> Fügen Sie 11 ul der Zellsuspension in jedes Mini-Gel-Säule. Berühren Sie das Gel während der Zugabe. </li><li> Suchen Sie MTS-Karten in einer Zentrifuge Kartenhalter, und zentrifugieren bei 156 xg für 6 min. </li><li> Schutz der Oberflächenantigene von dem Standort der RBC in der Mini-Gel-Säule bestimmt, bezogen auf die Herstellungr Beschreibung. </li></ol> III. Wässrige Zweiphasen-Partition Messungen <ol><li> Planen Dextran 500 kDa / PEG 8 kDa Zweiphasentrennung System (5% Dextran 500k, 4% PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM Phosphat) nach Anspruch 13 besteht. </li><li> Zentrifuge bei 433 × g für 10 min bei Raumtemperatur, um eine Zwei-Phasen-System (Dextran im Boden) zu erhalten. </li><li> Die zwei Phasen sorgfältig. </li><li> Aliquot 1,0 ml der oberen PEG-Phase in einem markierten Rohr (mit konkaven unten), mit 20 ul 20% Hämatokrit HPG modifizierte RBC und mischen Zellen vorsichtig durch Ausklopfen. </li><li> 0,5 ml der Oberphase, die Zellen zu 0,5 ml einer unteren Phase enthalten, und Mischen des Systems sanft durch flicking. </li><li> Das Röhrchen wird auf der Bank für ca. 2 Min. für das System zu trennen, und den Ort von Zellen in dem System. Lokalisierung von RBCs (in der oberen PEG-Phase, im unteren Dextran-Phase oder in beide) Funktion, um den Grad der Modifizierung und molekularenGewicht der HPG. </li></ol> IV. Osmotische Fragilität Messungen <ol><li> Planen NaCl-Lösungen mit Konzentrationen, die von 0 bis 0,9 (w / v)% liegen. </li><li> Platz 0,4 ml NaCl-Lösungen in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Fügen Sie 20 ul Erythrozyten (20% Hämatokrit) in die NaCl-Lösungen. </li><li> Mischung Zellen sorgfältig durch Inversion und sie in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Suspend-Zellen vorsichtig durch Inversion. Nehmen Sie 50 ul RBC-Suspension und fügen Sie ihn in eine 1 ml Drabkin-Reagenz in einer Küvette. Mix-Zellen mit Drabkin-Reagenz durch Pipettieren in und out. Messen Sie die Absorption des Hämoglobins cyanoderivative bei 540 nm mit BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS-Reader. </li><li> Um die Menge an Hämoglobin im Überstand quantifizieren, zentrifugieren Zellen bei 1.000 × g für 1 min. Gib 200 ul des Überstandes auf 1 ml Drabkin-Reagens in einer Küvette. Mix-Zellen mit Drabkin-Reagenz durch Pipettieren in und out. Messen Sie die Absorption der hemoglobin cyanoderivative bei 540 nm mit BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS-Reader. </li><li> Berechnen der Menge an Zellen in verschiedenen NaCl-Lösung aus dem Verhältnis der Menge Hämoglobin im Überstand (Schritt 6) lysiert, um die Gesamtmenge von Hämoglobin in der Zellsuspension (Schritt 5). </li></ol> V. Durchflusszytometrie Messungen - Schutz der Rhesus-D (RhD)-Antigen <ol><li> Add 5 ul der Kontrolle oder HPG veränderten Erythrozyten (20% Hämatokrit) in dreifacher Ausfertigung an PBS-Puffer mit 0,5% BSA auf ein Gesamtvolumen von 25 ul ergänzt. </li><li> Fügen Sie 25 ul FITC monoklonalen Anti-Rhesus D (RhD) aus Quotient Biodiagnostics (PA, USA) erworben. </li><li> Inkubieren des Gemisches für 30 min bei 37 ° C im Wasserbad. </li><li> Das Gemisch wird mit 1,5 ml PBS-Puffer zweimal. Zentrifugieren bei 1000 × g für 1 Minute, um den Überstand zu entfernen. </li><li> Suspend RBCs in 1 ml Kochsalzlösung, und übertragen Sie die Suspension in 4 ml Flow BD Durchflusszytometrie Röhre. </li><li> Analysieren mit FACSCanto II flow Zytometer Erwerb 5.000 Veranstaltungen auf der RBC Steuergate, und verwenden Sie ganze Veranstaltungen für die Analyse. </li></ol> VI. Durchflusszytometrie Messungen - Expression von CD47 <ol><li> Hinzufügen 1,54 ul Steuerung oder HPG modifizierten RBCs (20% Hämatokrit) fach an PBS-Puffer mit 0,5% BSA auf ein Gesamtvolumen von 44 ul ergänzt. </li><li> Fügen Sie 6 ul Phycoerythrin (PE) markierten Maus anti-human CD47 von BD Biosciences (NJ, USA) erworben. </li><li> Inkubieren des Gemisches für 30 min bei 37 ° C im Wasserbad. </li><li> Das Gemisch wird mit 1,5 ml PBS-Puffer zweimal. Zentrifugieren bei 1000 × g für 1 Minute, um den Überstand zu entfernen. </li><li> Suspend RBCs in 1 ml Kochsalzlösung, und durch 26 G 5/8 Nadel Zelle Verklumpung zu minimieren. </li><li> Übertragen Sie die Suspension in 4 ml Flow BD Durchflusszytometrie Röhre. </li><li> Analysieren mit FACSCanto II Durchflusszytometer, Erwerb 10.000 Ereignisse auf der RBC Steuergate. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Universal-Spender RBCs haben ein großes Potenzial bei der Verbesserung der Blut-Verfügbarkeit und Sicherheit für Bluttransfusion Therapie. Erythrozyten sind auch vielversprechende Drug-Delivery-Fahrzeuge aufgrund ihrer langen Kreislauf und inhärente Biokompatibilität 14, 15 berücksichtigt. Experimente in diesem Papier vorgestellten Auswertung der in vitro Eigenschaften der HPG veränderten Erythrozyten. Die in vitro-Eigenschaften und in vivo Auflage von HPG veränderten Erythrozyten h...

<table border="1"><tbody><tr><td> Glycidol </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Trimethylolpropan </td><td> Fluka </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Kaliummethylat </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Wasserfreiem Pyridin </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> 4-Dimethylaminopyridin </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Bernsteinsäureanhydrid </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Wasserfreiem Dimethylformamid </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> N-Hydroxysuccinimid </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> N, N&#39;-Diisopropylcarbodiimid </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> MTS-Karten </td><td></td><td></td><td> Micro Typing System (MTS) Karten (FL, USA) </td></tr><tr><td> Dextran 500 kDa </td><td> Pharmacia Fine Chemicals </td><td></td><td> (Schweden) </td></tr><tr><td> PEG 8 kDa </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> FITC monoklonalen anti-Rhesus D (RhD) </td><td> Quotient Biodiagnostics </td><td></td><td> (PA, USA) </td></tr><tr><td> PE monoklonalen anti-CD47 </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td> (NJ, USA) </td></tr><tr><td> Drabkin-Reagenz </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle. Chemikalien und Reagenzien für die Pfropfung von HPG Polymere RBC Membran und ihre Analyse verwendet. </td></tr></tbody></table>

antigene geschützten funktionellen red blood cells durch die membran pfropfung von compact hyperverzweigten polyglycerinen

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Roten Blutkörperchen (RBC) Transfusion ist für die Behandlung einer Reihe von akuten und chronischen medizinischen Problemen wie Thalassämie major und Sichelzellenanämie 1-3. Aufgrund des Vorhandenseins der Vielzahl von Antigenen auf der RBC Oberfläche (~ 308 bekannten Antigene 4), Patienten im chronischen Bluttransfusion Therapie entwickeln Alloantikörpern aufgrund der Übereinstimmung von untergeordneter Fehltreffer Antigenen auf Erythrozyten transfundiert 4, 5. Pfropfung von hydrophilen Polymeren, wie Polyethylenglykol (PEG) und hyperverzweigten Polyglycerin (HPG) einen Ausschluss Schicht auf RBC Membran, die die Wechselwirkung der Antikörper mit Oberflächenantigenen ohne Beeinträchtigung verhindert den Durchtritt von kleinen Molekülen wie Sauerstoff, Glukose und Ionen 3. Gegenwärtig keine Methode ist für die Erzeugung von universellen Erythrozyten Donorzellen zum Teil wegen der großen Herausforderung durch das Vorhandensein einer großen Anzahl von Antigenen (Protein-und Kohlenhydrat-Basis) auf der Oberfläche und der RBC d vorgestelltntwicklung solcher Methoden wird erheblich zur Verbesserung der Transfusion Sicherheit und dramatisch verbessern die Verfügbarkeit und Nutzung von RBC. In diesem Bericht sind die Versuche, die verwendet werden, um Antigen geschützten funktionellen RBCs durch die Membran Pfropfung von HPG und deren Charakterisierung zu entwickeln vorgestellt. HPGs sind hoch biokompatibel kompakten Polymeren 6, 7, und werden voraussichtlich innerhalb der Zelle Glykokalyx, die die Lipid-Membran 8, 9 und Maske RBC Oberflächenantigene 10, 11 umgibt befinden.

Camouflage von Rhesus D-Antigen und CD47 RBC Oberflächenprotein wurden mittels Durchflusszytometrie mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern quantifiziert und ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 1 dargestellt. Im Falle der HPG-gepfropften RBCs (grau), verringerte sich die Intensität des Signals (Peak verschoben nach links) im Vergleich zur Kontrollgruppe RBCs (rot und grün), die eine Reduktion der Bindung an Antikörper gegen Zelloberflächen, die die Maskierung der Oberflächenproteine...

Die Zellmembran Modifikation von roten Blutkörperchen (Erythrozyten) mit hyperverzweigten Polyglycerin (HPG) präsentiert wird. Geändert RBCs wurden durch wässrige Zwei-Phasen-Partitionierung, osmotische Fragilität und Komplement-vermittelte Lyse gekennzeichnet. Die Tarnung der Oberflächenproteine ​​und Antigene wurde anhand der Durchflusszytometrie und Micro Typing System (MTS) Blut Phänotypisierung Karten.

Antigene geschützten funktionellen Red Blood Cells durch die Membran Pfropfung von Compact hyperverzweigten Polyglycerinen

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, antigengeschützte funktionsfähige rote Blutkörperchen zu präparieren. Dies wird erreicht, indem im zweiten Schritt zunächst das HPG-Polymer vorbereitet wird. Das HPG wird durch die Zugabe von Succinylsuccinatgruppen funktionalisiert.Als nächstes wird Vollblut von gesunden Spendern mit Kochsalzlösung gewaschen, um die roten Blutkörperchen abzutrennen. Im letzten Schritt werden die isolierten roten Blutkörperchen mit dem funktionalisierten HPG behandelt. Letztendlich wird der Schutz der Oberflächenantigene auf den modifizierten Zellen durch das funktionalisierte HPG mittels Durchflusszytometrie untersucht.Der Hauptvorteil unserer Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden besteht darin, dass HPG-Konjugationen funktionsfähige rote Blutkörperchen liefern, die normal zirkulieren. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf chronische Bluttransfusionen. Als HPG-modifiziert haben rote Blutkörperchen in vivo eine verringerte Antigenität und normale Durchblutung.Dr. Ian, ein Postdoktorand, Stipendiat und ständige Schule, ein Techniker in meinem Labor, wird das Verfahren drei Tage vor der Entnahme von Vollblut von einvernehmlichen gesunden Spendern trocken lyophilisiertes HPG in einem runden Bodenkolben über Nacht und einem Vakuum bei 90 Grad Celsius demonstrieren. Am nächsten Morgen nehmen Sie den Kolben aus dem Ölbad, lassen ihn auf Raumtemperatur kommen und lösen dann das getrocknete HPG in zwei Millilitern wasserfreiem Pyridin auf. Als nächstes fügen Sie der HPG-Lösung eine katalytische Menge Dimethylaminoparidin hinzu, um etwa acht der Hydroxylgruppen auf dem HPG mit Carboxylgruppen zu funktionalisieren.In den nächsten 10 Minuten das in 0,5 Millilitern gelöste Sicahydrid zugeben, tropfenweise in die Lösung geben und dann die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur unter Argonnen umrühren, am nächsten Tag das HPG-Gemisch in 40 Millilitern von vier Grad Celsius ausfällen. Aceton in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen für 15 Minuten bei 27.000 mal G bei vier Grad Celsius. Dann das Supinat dekantieren und den Niederschlag bei Raumtemperatur mit Argonnen spülen, um eventuelles restliches Aceton zu entfernen.Zur Aktivierung der Carboxylgruppen mit sächsischen und Mial-Succinatgruppen. Gruppen lösen das Carboxyl-funktionalisierte HPG in zwei Millilitern wasserfreiem DMF auf. Geben Sie dann NHS und Diop Profil CARBIMIDE zur HPG-Lösung und rühren Sie die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur unter Argonnen um.Am nächsten Morgen fahren Sie mit der Reinigung des S-S-H-P-G durch Ausfällung in kaltem Aceton fort. Anschließend mit Argonnen spülen, um eventuelle Acetonreste zu entfernen. Bestimmen Sie dann die Reinheit des modifizierten HPG und den Grad der Carboxyl- und Succinylsuccinat-Funktionalisierung durch Protonen-NMR-Analyse.Nachdem Sie die Einverständniserklärung eingeholt haben, entnehmen Sie dem gesunden Spender das Blut, während die Reinheit des S-S-H-P-G bewertet wird. Zentrifugieren sollte der Spender Vollblut für vier Minuten bei 1000-facher G-Temperatur und Raumtemperatur verwenden. Verwenden Sie eine Pasterpipette, um das Supinat und den Buffy Coat zu entfernen, und übertragen Sie dann die verpackten roten Blutkörperchen in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Geben Sie PBS zu den Zellen und mischen Sie dann durch Inversion, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu erhalten. Zentrifugieren Sie dann die Zellen in PB S3 mal, wobei Sie den SUP-Nativstoff entfernen. Übertragen Sie das pact RBC-Pellet nach jeder Wäsche in ein 1,6-Milliliter-Orph-Röhrchen und fügen Sie 300 Mikroliter PBS hinzu, um das Volumen auf 400 Mikroliter zu erhöhen, unmittelbar nachdem Sie die Reinheit des modifizierten HPG bestätigt haben. Übertragen Sie 150 Milligramm des S-S-H-P-G in ein Dr.Glass-Fläschchen.Geben Sie nach dem Wiegen des Polymers 300 Mikroliter PBS in das S-S-H-P-G und wirbeln Sie es, um das Polymer aufzulösen. Fügen Sie dann die S-S-H-P-G-Polymerlösung zu den 20%ige gewaschenen roten Blutkörperchen hinzu. Wirbeln Sie dann die Suspension vorsichtig vor und geben Sie dann das HPG-Gemisch der roten Blutkörperchen bei Raumtemperatur auf einen Orbitalschüttler.Waschen Sie die Lösung nach einer Stunde viermal mit PBS und Kochsalzlösung ab und entfernen Sie jedes Mal das Supinat. Fügen Sie dann 300 Mikroliter Kochsalzlösung zu den letzten 100 Mikrolitern gepackter roter Blutkörperchen hinzu, bis zu einer endgültigen Hämatokritkonzentration von 20 %. Lassen Sie nun acht Milliliter gespendete Vollblutzellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen.Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, sammeln Sie etwa drei Milliliter des Serums und geben Sie einen Milliliter des Serums in ein 60 Grad Celsius heißes Wasserbad. Zur Zubereitung von hitzeinaktiviertem Serum. Geben Sie nach 30 Minuten 60 Mikroliter frisches Serum und 60 Mikroliter hitzeinaktiviertes Serum in separate Eph-Röhrchen.Jeder enthält 60 Mikroliter 20%Hämatokrit-HPG-modifizierte rote Blutkörperchen. Geben Sie dann 60 Mikroliter davon in Röhrchen mit dem gleichen Volumen an unmodifizierten roten Blutkörperchen und inkubieren Sie alle roten Blutproben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Um die Menge an Hämoglobin in den Zellsuspensionen zu quantifizieren, geben Sie zunächst 5,9 Mikroliter jeder Probe in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Platte.Mischen Sie dann jede Probe mit 294 Mikrolitern Drabist-Kins-Reagenz und lesen Sie die Absorption des Hämoglobin-Sano-Derivats mit einem Spektralphotometer bei 540 Nanometern ab, um die Menge an Hämoglobin in der Supinatzentrifuge und den Rest der Zellproben zu quantifizieren, und plattieren Sie dann 50 Mikroliter jedes Supinats in dreifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Platte. Nachdem Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern Drabin-Kins-Reagenz gemischt haben, messen Sie die Absorption des Hämoglobin-Ano-Derivats, wie gerade für diesen Schritt gezeigt. Beginnen Sie mit der Zentrifugation von 50 Mikrolitern HPG-modifizierten Erythrozyten mit 10 % Hämatokrit in einem Orph-Röhrchen.Nachdem Sie den S-Überstand bei 110 Mikrolitern MTS verworfen haben, verdünnen Sie es mit dem Zellpellet und pipettieren Sie die Lösung einige Male auf und ab, um die Zellsuspension zu homogenisieren. Laden Sie nun 11 Mikroliter der Zellsuspension in jede Säule eines Mini-Gels. Legen Sie dann MTS-Karten in einen Zentrifugen-Kartenhalter und drehen Sie die Karten sechs Minuten lang bei 156 mal G. Der Schutz der Oberflächenantigene lässt sich dann anhand der Lage der roten Blutkörperchen in den Mini-Gel-Säulen gemäß Herstellerbeschreibung bestimmen.Für diesen Schritt wird nach dem Einrichten eines zweiphasigen Dextran-PEG-Trennsystems die Dextran-PEG-Lösung geschleudert, um das zweiphasige System zu erhalten. Aliquotieren Sie dann vorsichtig einen Milliliter der oberen PEG-Phase in ein beschriftetes Röhrchen mit konkaven Boden. Geben Sie 20 Mikroliter 20 bis 30%hemog crypt HPG modifizierte RBC in das Röhrchen und mischen Sie die Zellsuspension durch leichtes Schnippen.Fügen Sie dann 0,5 Milliliter der Zelle mit der oberen Phase zu 0,5 Millilitern der unteren Dextranfläche hinzu und mischen Sie das System dann erneut mit einem sanfteren Schnippen. Legen Sie nun das Rohr auf die Bank, damit sich das System nach zwei Minuten trennen kann. Die roten Blutkörperchen sollten sich in der oberen PEG-Phase, in der unteren Dextra-Phase oder in beiden roten Blutkörperchen lokalisieren.Derivatisierte HPG-Konzentrationen befinden sich in der oberen PEG-Phase, um den Schutz von Oberflächenantigenen der roten Blutkörperchen durch durchflusszytometrische Analyse zu bewerten. Geben Sie zunächst 20 Mikroliter Kochsalzlösung in drei Faktenröhrchen für jede Probe. Geben Sie dann jeweils fünf Mikroliter unmodifizierte und HPG-modifizierte rote Blutkörperchen in dreifacher Ausfertigung in die Röhrchen.Geben Sie anschließend 25 Mikroliter monoklonales Anti-Reus-D fit C in jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Waschen Sie die Proben nach 30 Minuten in 1,5 Milliliter Kochsalzlösung, entfernen Sie das Supinat zweimal, jedes Mal nach dem zweiten Waschen biegt Reese die roten Blutkörperchen in einem Milliliter Kochsalzlösung. Erfassen Sie schließlich mindestens 5.000 Ereignisse auf dem Kontrolltor der roten Blutkörperchen, um den Schutz von Oberflächenantigenen zu analysieren.In diesem Histogramm wird die normale Expression des Resus-e-Antigens, dargestellt durch den grünen Peak auf unmodifizierten roten Blutkörperchen von gesunden menschlichen Spendern, gezeigt: Wenn die roten Blutkörperchen auf HPG transplantiert werden, nimmt die Intensität des Reese-e-Antigen-Signals ab, was durch die Verschiebung der Expression nach links belegt wird, die durch den grauen Peak gekennzeichnet ist. Die Modifikation der roten Blutkörperchen durch HPG tarnt auch die Expression von CD 47, wie die ebenfalls in diesem Histogramm beobachtete Linksverschiebung des grauen Peaks zeigt, was darauf hindeutet, dass die Maskierung der Oberflächenproteine in Gegenwart von HPG erfolgt. Nach diesem Verfahren können Blutzellen als HPG-Modifikator bei Bluttransfusionen und der zellvermittelten Verabreichung von Therapeutika eingesetzt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Polymere an rote Blutkörperchen konjugiert werden können, um die Antigenität zu modifizieren und die Basis für die Verabreichung von Medikamenten zu bilden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Papier beschreibt eine einfache Technik, um Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen zu induzieren. Die Technik kann klinisch angewendet werden, um nicht alloreaktive Spenderzellen zu generieren. Infusion dieser Zellen verbessern könnte Immunrekonstitution und reduzieren Toxizität nach allogener Stammzelltransplantation.

Induktion von Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen durch Alloantigen Stimulation mit Co-stimulatorische Signal Blockade

Ein neuer DC unabhängige Methode zur Induktion und Expansion von Antigen-spezifischen T-Zellen beschrieben. HLA A2-Ig Basis künstlicher Antigen-präsentierende Zellen (AAPC) sind mit HLA-A2 restringierte Peptide effizient erweitern CTL verschiedener Antigen-Spezifität geladen. Diese Technologie birgt ein großes Potenzial für die CTL-basierte adoptiven Immuntherapie.

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Function-Spacer-Lipid (FSL) Konstrukte erlauben die Oberflächeneigenschaften von lebenden Zellen und Virionen ohne Verlust der Vitalität geändert werden. Die Methode erfordert nur einfache Berührung eines FSL konstruieren Lösung mit einer Zelle / Virion und spontan und stabile Oberfläche Einarbeitung erfolgt.

FSL Konstrukte: Eine einfache Methode für das Ändern von Cell / Virion Oberflächen mit einer Reihe von biologischen Markern, ohne die Durchführung

Die Exposition von Blut gegenüber polymeren Blutkanälen löst die Fremdkörperreaktion aus, die mit klinischen Komplikationen in Verbindung gebracht wird. Hier wird die Chandler Loop Apparatus beschrieben, ein experimentelles Werkzeug, das die Blutperfusion durch diese Kanäle nachahmt. Die Anhängung von rekombinantem CD47 führt zu einer verminderten Evidenz der Fremdkörperreaktion an diesen Kanälen.

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Ernte von Endothelzellen von Sprechblasentipps Swan-Ganz Katheter nach rechts Herzkatheter

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Wir beschreiben ein Modell der heterotopischen Bauchherztransplantation bei Ratten, was Veränderungen der aktuellen Strategien impliziert, die zu einem vereinfachten chirurgischen Ansatz führen. Zusätzlich beschreiben wir ein neuartiges Abstoßungsmodell durch In-Ear-Injektion lebenswichtiger Herzmuskelzellen, das weitere transplantierte immunologische Analysen bei Ratten ermöglicht.

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