Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, mit Hilfe eines autogenen Tumormodells des Zebrafisches nach Melanommodifikatoren zu suchen. Dies wird durch die Schaffung transgener Tiere erreicht, bei denen die Melanozyten ein interessierendes Gen exprimieren und die Fische für Melanome prädisponiert sind. Als nächstes wird der Melanombeginn bewertet, um zu beurteilen, ob das interessierende Gen die Tumorinitiierung verändert.

Anschließend werden Tumorinvasions- und zellspezifische Assays durchgeführt, um einen zusätzlichen Einfluss des interessierenden Gens auf Melanome und prämaligne Melanozyten zu bestimmen. Schließlich werden Melanomzellen transplantiert, um zu messen, wie sich das interessierende Gen auf die Häufigkeit von Melanom-initiierenden Zellen in etablierten Tumoren auswirkt. Die Ergebnisse zeigen, wie ein Kandidatengen verschiedene Eigenschaften von Melanozyten und Melanomen beeinflusst, einschließlich der Invasion zu Beginn und der Transplantationsfähigkeit.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Keimbahntransgenese zur Untersuchung von Krebskandidaten besteht darin, dass Zeit, Aufwand und Kosten gespart werden und der Durchsatz durch den Assay erhöht wird. Verschiedene Aspekte der Tumorgenese bei transgenen Tieren mit Glockenspiel Dieses Verfahren wird von Sherania Agar demonstriert, einem Doktoranden in meinem Labor, um Konstrukte für die Injektion zu generieren. Beginnen Sie mit der Erstellung von Gateway-Klonen mit mittlerem Eintritt durch PCR, amplifizieren Sie den offenen Leserahmen der interessierenden Gene in voller Länge und rekombinieren Sie zu P don R 2 21.

Verwenden Sie dann die Multi-Site-Gateway-Technologie, um das Melanozyten-spezifische Mifa-Promotor-Gen von Interesse und das Polyadenylierungssignal in den Mini-Cooper-Vektor zu rekombinieren, um Gene von Interesse unter die Kontrolle des Mifa-Promotors zu stellen. Injizieren Sie 25 Pikogramm von jedem Klon zusammen mit 25 Pikogramm TOL und transponiert mRNA in eine Zell-transgene, dreifach homozygote Zebrafischembryonen. Mifa BRAF FP 53. Mutierte Tiere haben einen Melanozytenmangel und neigen zur Transformation und Melanombildung.

Zusammen mit dem Gen von Interesse. Der Mini-Cooper-Vektor enthält ein rettendes MVA-Mini-Gen. So entwickeln erfolgreich injizierte Tiere gerettete Melanozyten, die das interessierende Gen exprimieren.

Inkubieren Sie die injizierten Embryonen bei 28,5 Grad Celsius 24 Stunden nach der Befruchtung oder HPF. Entfernen Sie alle toten Embryonen 72 Stunden nach der Befruchtung mit einem Präpariermikroskop unter Einlicht auf weißem Hintergrund. Auswahl transgener Tiere mit geretteten Melanozyten.

Wenn die Tiere vier Tage nach der Befruchtung erreicht sind, bringen Sie sie in ein Drei-Liter-Becken in der Kinderstube der Zebrafischanlage. Im Alter von zwei Monaten wählen Sie die Tiere aus, bei denen mindestens ein Melanozyten-Rettungsbereich größer als vier Millimeter im Quadrat ist. Untersuchen Sie die ausgewählten Tiere wöchentlich auf das Vorhandensein von Tumoren.

Isolierung tumortragender Tiere für Studienzwecke. Zeichnen Sie melanomfreie Überlebenskurven mit dem Alter in Wochen auf der Absa und dem prozentualen melanomfreien Überleben auf der Ordinate. Vergleichen Sie Tiere mit Melanozyten, die ein Gen exprimieren, das für die Kontrolle von Tieren, die EGFP und Melanozyten exprimieren, von Interesse ist.

Verwenden Sie einen logarithmischen Rangtest, um zu bestimmen, ob sich die beiden Kurven statistisch unterscheiden. Zur Durchführung eines Tumorinvasionsassays. Beginnen Sie mit der Auswahl isolierter Zebrafische, die dorsal Tumore in einer Region zwischen der hinteren Grenze des Hinterhirns und dem vorderen Rand der Rückenflosse entwickeln.

Zwei Wochen nach dem Auftreten des Melanoms verwenden Sie Trica, um den Fisch einzuschläfern, nachdem Sie den Fisch fixiert und in Paraffin eingebettet haben. Machen Sie fünf Mikrometer-Querschnitte durch die Läsionen. Eins. Alle 50 Mikrometer wird die gesamte Läsion durchtrennt, so dass der Punkt der tiefsten Invasion identifiziert werden kann.

Verwenden Sie Hämatin und Eoin, um die Abschnitte zu färben. Beurteilen Sie die Tumorinvasion, indem Sie messen, ob Tumorzellen außerhalb der kollagenen Schicht bleiben, in die Rückenmuskulatur eindringen oder weiter in die Wirbelsäule eindringen. Bestimmen Sie die statistische Differenz zwischen den beiden Probensätzen, um eine Immunfärbung durchzuführen.

Betäuben Sie den Fisch in 0,17 Milligramm pro Milliliter Trica mit einfallendem Licht unter einem Präpariermikroskop. Verwenden Sie eine scharfe Pinzette mit feiner Spitze, um die Rückenschuppen zu zupfen. Achten Sie darauf, die Melanozyten, die die Hälfte der Schuppe enthalten, nicht zu beschädigen.

Legen Sie die Schuppen direkt von der Pinzette in einen Milliliter Fixiermittel und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur, während Sie sie mindestens zwei Stunden lang drehen. Setzen Sie den Fisch in Fischwasser um und überwachen Sie den Fisch, um eine erfolgreiche Erholung von pigmentierten Melanozyten zu bestätigen. Waschen Sie zunächst feste Waagen in PBST zweimal für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Fügen Sie als nächstes einen Milliliter frisch hergestellte Bleichlösung hinzu und decken Sie sie mit Parfum oder Cap Locks ab, um zu verhindern, dass das Gas die Röhren aufplatzt. Bleiche weiter, bis das Pigment verschwunden ist. Dann viermal alle fünf Minuten bei Raumtemperatur in PBST waschen.

Mindestens 30 Minuten in Blocklösung inkubieren, dann über Nacht mit etwa 400 Mikrolitern Primärantikörper und Blocklösung inkubieren. Am folgenden Tag bei Raumtemperatur die Waage dreimal 30 Minuten lang in PBS bei Raumtemperatur waschen, mit Sekundärantikörper zwei Stunden lang inkubieren, zwei Stunden lang bis über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem Sie mit dpi gestanden haben, tragen Sie einen Tropfen Vektorschild auf einen Objektträger auf und montieren Sie die Skalen so, dass die konkave Seite der Skala nach unten gegen den Objektträger zeigt. Legen Sie einen Glasdeckglas über die Proben.

Verwenden Sie Klarlack, um die Ränder zu versiegeln, und betrachten Sie die Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop. Nach einem strahlenden Empfänger zwei bis drei Monate alter Casperfisch mit 25 Grays Gammabestrahlung einen Tag vor der Transplantation. Lassen Sie den Fisch sich im Fischwasser erholen.

Verwenden Sie Trica, um einen tumortragenden Fisch einzuschläfern, schneiden Sie den Tumor ab und legen Sie ihn in eine Petrischale mit etwa fünf Millilitern Filter, sterilisiert 0,9 XPBS mit 5% FBS, mit einem Rasiermesser, würfeln Sie den Tumor in Lösung, arbeiten Sie bei Raumtemperatur und iterieren Sie mit einer P 1000-Pipette, um einzelne Zellen zu erzeugen. Erhöhen Sie das Volumen auf 25 Milliliter. Die Lösung wird durch einen 40-Mikrometer-Maschenfilter filtriert und in einer Tischzentrifuge bei 453 RCF 10 Minuten lang geschleudert.

Suspendieren Sie das Pellet in 0,9 % PBS 5 % FBS auf die gewünschte Konzentration. Berechnen Sie mit einem Hämozytometer die genaue Zellzahl und verdünnen Sie die Zellsuspension so, dass das endgültige Injektionsvolumen etwa fünf Mikroliter beträgt. Wenn beispielsweise 50.000 Zellen injiziert werden sollen, sollte die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 10.000 Zellen pro Mikroliter verdünnt werden.

Schnippen Sie alle paar Minuten mit dem Röhrchen mit der Zellsuspension, um ein Verklumpen der Zellen mit 100 % Ethanol und 0,9 XPBS zu verhindern. Waschen Sie eine Hamilton-Spritze mit 26 s Gauge und 7, 0, 1 und 10 Mikrolitern zwei- bis dreimal, bevor Sie die Spritze mit fünf Mikrolitern der Zellsuspension befüllen. Nachdem Sie den bestrahlten Empfängerfisch in Trica betäubt haben, legen Sie ihn auf die Seite auf ein feuchtes Kim-Tuch.

Stabilisieren Sie den Fisch mit einer Hand und führen Sie die Nadel mit der Fase nach oben in einem 45-Grad-Winkel in die Flanke des Fisches oberhalb der Bauchhöhle ein. Etwa auf halbem Weg zwischen der hinteren Grenze des Hinterhirns und der vorderen Grenze der Rückenflosse. Drücke den Kolben vorsichtig nieder.

Lassen Sie den Fisch sich in frischem Fischwasser erholen und beobachten Sie den Fisch täglich auf Tumortransplantation. Ist eine Transplantation erfolgt, kann auch ein kontinuierliches Wachstum und eine Krankheitsentwicklung beobachtet werden. Einzellige BRAF FP 53 MIFA-Zebrafischembryonen wurden mit dem Mini-Cooper-Vektor injiziert, der den Melanom-Onkogensatz DB, jeweils eins oder EGFP, unter der Kontrolle des MFA-Promotors enthielt, wie hier gezeigt.

Die Tumorinzidenzkurven für die Erwachsenen zeigten, dass das SET DB 1 den Melanombeginn im Vergleich zur EGFP-Kontrolle, wie hier zu sehen, signifikant beschleunigte, die Hämatin- und EOSIN-Färbung zeigt, dass Melanome, die SET DB 1 exprimierten, lokal invasiver waren als EGFP-Kontrollmelanome. Diese Abbildung zeigt gebleichte oder ungebleichte Zebrafisch-Rückenschuppen, die mit einem Antikörper gefärbt wurden, der den nukleären lokalisierten Mifa-Transkriptionsfaktor erkennt, um die Transplantatfähigkeit des Tumors zu beurteilen. Melanomzellen wurden aus einem BRAF FP 53 mifa-Fisch isoliert, dem der Minibecher R-E-G-F-P 50 injiziert wurde, 000 Zellen wurden subkutan in eine Empfänger-Casper-Mutante injiziert, die am Vortag mit 25 Grautönen bestrahlt worden war, wie hier im Alter von zwei Wochen zu sehen ist.

Pigmentierte Spenderzellen waren leicht zu erkennen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsbiologie, um die funktionellen Folgen von Melanom-assoziierten genetischen Veränderungen anhand des Zebrafisches zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie anhand eines Zebrafisch-Autotumormodells auf Melanommodifikatoren mittels Assay, Unterschiede in der Tumorinvasion, der Genexpression und der Transplantationsfähigkeit untersuchen können.