Experimentelle Methoden zur Prüfung der Auswirkungen von Neurotrophic Peptide, ADNF-9, gegen den Alkohol-induzierte Apoptose während der Schwangerschaft in C57BL / 6 Mäuse

Ziel dieses Verfahrens ist es, die neuroprotektive Wirkung von trophischen Peptiden in einem fetalen Alkoholexpositionsmodell zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Versuchstiere verpaart und dann die trächtigen Weibchen mit trophischen Peptiden behandelt werden. In einem zweiten Schritt werden die Föten präpariert, um fötale Gehirne für experimentelle Zwecke zu isolieren. Als nächstes werden die fötalen Gehirne zum Schneiden in Gelatine eingebettet, gefolgt von einer Tunnelfärbung, um die Ergebnisse des Zelltods zu bestimmen.

Dies zeigt, dass eine pränatale Alkoholexposition die Anzahl der tunnelpositiven Zellen in der ganglionären Eminenz erhöht. Im Vergleich zur Verabreichung des trophischen Peptids in der Kontrollgruppe reduzierten a D und F neun signifikant den alkoholinduzierten Anstieg der tunnelpositiven Zellen im Vergleich zu mit Kontrollalkohol behandelten Tieren. Daher ist die visuelle Demonstration dieses Metalls von entscheidender Bedeutung, da die Dissektion des fetalen Gehirns und die eingebetteten Schritte schwer zu erlernen sind, da die Gehirne des Fötus sehr klein sind, um sie zu präparieren und für die Sektion der ersten Rasse C 57 zu verarbeiten: schwarze sechs Mäuse, indem sechs Wochen alte weibliche Mäuse von etwa 20 Gramm unmittelbar nach der Entnahme für zwei Stunden in männliche Heimkäfige gesetzt werden.

Überprüfen Sie jedes Weibchen auf das Vorhandensein eines Spermienpfropfens, um zu bestätigen, dass eine Paarung stattgefunden hat. Wenn ein Spermienpfropfen vorhanden ist, dann bestimmen Sie diesen embryonalen Tag Null auf E sieben Gewicht Match schwangere Weibchen in vier Gruppen. Eine alkoholische flüssige Diätgruppe wurde als einzige Nährstoffquelle als freier Zugang zur Verfügung gestellt.

Zwei Perfed-Kontrollgruppe drei Peptidbehandlungsgruppe, die neben der Alkoholexposition eine intraperitoneale Injektion eines DNF neun Peptids erhalten sollte. Flüssige Nahrung. Erfassen Sie die Menge an flüssiger Nahrung, die von den Tieren innerhalb von 24 Stunden aus 30-Milliliter-Spiralröhrchen mit abgestuftem Schraubverschluss aufgenommen wurde, um die tägliche Menge an Alkohol, flüssiger Nahrung oder gepaarter flüssiger Nahrung zu bestimmen, die über einen freien Überschuss als einzige Nährstoffquelle bereitgestellt werden kann.

Stellen Sie sicher, dass täglich frisch zubereitete flüssige Nahrung von E sieben bis E 13 bereitgestellt wird, nachdem die schwangere Myer E 13 durch Kohlendioxid-Euthanasiere, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation, geopfert wurde. Legen Sie den Kadaver in Rückenlage auf das Sezierbrett und reinigen Sie den Bauch mit 70%Ethanol. Verwenden Sie eine sterile Schere und Pinzette, um einen Bauchschnitt zu machen.

Sobald der Bauch geöffnet ist, halten Sie die Gebärmutter mit einer Pinzette fest und verwenden Sie eine zweite Pinzette, um das Endometrium langsam und sanft von der Gebärmutter wegzureißen, ohne die Embryonen zu punktieren. Entnehmen Sie die Embryonen vorsichtig aus der Gebärmutter und übertragen Sie sie in Hanks Balance-Sortierlösung. Stellen Sie die Schale und den Eisbehälter in einer 60 Millimeter x 15 Milliliter großen Zellkulturschale auf nassem Eis mit einer ultrafeinen Pinzette zur Mikrodissektion auf den Tisch eines Stereomikroskops. Ziehe die Haut der Embryonen im oberen Teil des Kopfes ab, um den Schädel freizulegen.

Sobald der Schädel freigelegt und unter dem Stereomikroskop deutlich sichtbar gemacht ist, fassen Sie die Schädelbasis auf Höhe des Rückenmarks und des Hirnstamms mit einer Zange und beginnen Sie, den Schädel abzuziehen. Fahren Sie fort, den Schädel Stück für Stück von den hinteren zu den vorderen Teilen des Kopfes abzuschälen. Sobald das Gehirn vollständig freigelegt ist, verwenden Sie eine Pinzette, um es zu extrahieren.

Präparieren Sie dann das Gehirn des Fötus von der Basis des Primordial- oder Fabrikkolbens bis zur Basis des Met Postfix, indem Sie alle präparierten fötalen Gehirne zwei bis drei Tage lang in 4%Paraldehyd präparieren. Fötale Gehirne können auch eingefroren werden, wenn sie auf Western Blot oder enzymatische Assays getestet werden. Nachdem Sie eine 10%ige Lösung von Gelatine der Güteklasse A in destilliertem Wasser hergestellt haben, füllen Sie eine abziehbare Einbettungsform zur Hälfte und warten Sie, bis die Gelatine fest wird.

Legen Sie das Kontrollgehirn und das pränatal behandelte Gehirn des Fötus nebeneinander auf die verfestigte Gelatine. Dies dient dazu, konsistente Bedingungen sowohl zwischen der Kontroll- als auch zwischen der Versuchsgruppe zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die Gelatine nicht zu heiß ist, und geben Sie flüssige Gelatine auf das Gehirn des Fötus, um eine vollständige Form zu bilden.

Die endgültige Form sollte diesem Bild ähneln, kühlen Sie die vorbereitete Gelatineform, in der sich das Gehirn des Fötus befindet, 15 Minuten lang. Ziehen Sie anschließend den Kunststoff der Einbettungsform ab. Die endgültige Form sollte so aussehen und dann die gelatinehaltige Gelatine des fötalen Gehirns für zwei Tage in 4%Paraldehyd umfüllen.

Am dritten Tag befestigen Sie einen Gelatineblock mit fixierten fetalen Gehirnen an das Stadium des Vioms. Schneiden Sie dann die Gehirne mit einem Viom mit einer Dicke von 25 bis 50 Mikrometern für den koronalen Schnitt. Sammeln Sie die fetalen Gehirnabschnitte in PBS, montieren Sie dann die fetalen Gehirnabschnitte auf Superfröste plus Objektträger in Wasser und lassen Sie sie 15 Minuten trocknen.

Nach Ablauf von 15 Minuten. Legen Sie die Objektträger in PBS, um am nächsten Tag die Tunnelreaktion zu testen. Tauchen Sie die Objektträger zunächst fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in eine Lösung aus 20 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase K und PBS.

Spülen Sie dann dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS auf einem Orbitalschüttler. Inkubieren Sie die Schnitte mit 3%igem Wasserstoffperoxid in Methanol für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Waschen Sie dann die Objektträger wie zuvor.

Inkubieren Sie anschließend die Abschnitte zwei Minuten lang in durchlässiger Lösung auf Eis. Nach der Inkubation zweimal in PBS gewaschen. Verwenden Sie wie zuvor ein Labortuch, um den Bereich des Objektträgers um die Schnitte herum zu trocknen.

Zeichnen Sie dann mit einem Tupfer um die Abschnitte auf der Folie herum. Dadurch wird ein Auslaufen der Färbelösung verhindert, so dass ein kleines Volumen verwendet werden kann. Eine Sektion in jedem Paar wird mit einem Tunnelreaktionsgemisch inkubiert, das nach den Anweisungen des Herstellers hergestellt wurde.

Geben Sie eine Trägerlösung ohne Tunnelreagenz in den Negativkontrollbereich. Dann inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach Ablauf der Inkubationszeit waschen Sie die Objektträger wie zuvor dreimal in PBS auf einem Orbitalschüttler.

Trocknen Sie dann den Bereich um das Gewebe mit einem Labortuch ab. Inkubieren Sie anschließend die Abschnitte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln. Spülen Sie dann die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit tris HCL aus.

Übertragen Sie die Objektträger in einen Halter und legen Sie sie in ein Coplin-Glas, das 0,05 % DAB und 0,003 % Wasserstoffperoxid enthält. Decken Sie das Glas mit Alufolie ab und stellen Sie es nach der Inkubation sieben Minuten lang auf einen Orbitalschüttler auf Eis, wobei Sie PBS nach Belieben wie zuvor waschen. Die Objektträger können in PBS aufbewahrt werden, bevor mit der Raketengegenfärbung fortgefahren wird, wie im Textteil des Protokolls beschrieben.

Die folgenden Bilder zeigen die Auswirkungen des neurotrophen Peptids A DNF neun gegen alkoholinduzierte Apoptose unter Verwendung eines Tunnelassays in der ganglionären Eminenz, da die pränatale Alkoholexposition im E 13-Stadium einen Anstieg des Zelltods induzierte, wie durch die Pfeilspitzen in der A-LC-Gruppe im Vergleich zur PF-Gruppe angezeigt. Die Verabreichung von D NF neun zusammen mit pränataler Alkoholexposition führte zu einer Abnahme der tunnelpositiven Zellen. Die statistische Analyse zeigte, dass die Verabreichung von AD und F 9 einen alkoholinduzierten Anstieg der tunnelpositiven Zellen verhinderte.

Die Werte werden als Mittelwert plus minus Standardfehler des Mittelwerts angezeigt. Ein einzelnes Sternchen gibt einen P-Wert von weniger als 0,052 an. Ein Sternchen zeigt einen P-Wert von weniger als 0,01 durch den Post-hoc-Test von Newman Coles an.

Jede Gruppe enthielt ein N von vier. Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik Forschern und dem Bereich der Gehirnentwicklung, die Auswirkungen von Medikamenten oder Verbindungen und der Gehirnentwicklung bei Mäusen zu untersuchen.