Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

In diesem Video wird ein sehr einfaches und effizientes Protokoll zur Gewinnung einer zellulären Suspension von Testmaterial aus Nagetieren innerhalb von nur 15 Minuten vorgestellt. Die Methode wurde an Hodengewebe von Maus, Ratte und Meerschweinchen angewandt und verwendet eine Metamachine-Vorrichtung, um das verkapselte Gewebe aufzulösen. Nach einer Filtration und Färbung der Zellen ist die Suspension für die Durchflusszytometrie bereit.

Die Analyse oder Sortierung von Zellen mittels Durchflusszytometrie setzt eine homogene Zellpopulation voraus, was eine Grundvoraussetzung für die Untersuchung biochemischer und molekularer Vorgänge während der männlichen Gametogenese ist. Die Heterogenität des Hodengewebes mit über 30 verschiedenen Zelltypen stellt daher eines der Hauptprobleme bei der Erforschung der molekularen Grundlagen der Spermatogenese bei Säugetieren dar. Aus diesem Grund wurden verschiedene Methoden angewandt, um angereicherte bis gereinigte Populationen von Hodenzellen zu erhalten, einschließlich der Nutzung von PEG-Gradienten und zentrifugalen Trennverfahren.

Der erste Schritt für jede Zellseparationsmethode ist die Herstellung einer zellulären Suspension. Die derzeitigen Protokolle sind jedoch meist zeitaufwändig und können den Verlust kurzlebiger Moleküle wie RNAs mit sich bringen, was für nachfolgende Expressionsanalysen unerwünscht ist. Der Hauptvorteil des hier vorgestellten Protokolls besteht darin, dass es die Schritte zwischen der Tötung des Versuchstiers und den auf spezifische Spermastadien ausgerichteten molekularen Untersuchungen eliminiert, gleichzeitig aber eine hohe Qualität und exzellente Repräsentation der Zelltypen in den zellulären Suspensionen gewährleistet.

Den Vorgang wird Dr. Ana Rodriguez, Forscherin am AL-Laboratorium, die die Methode entwickelt hat, und Federico San Lopez aus der Durchflusszytometrie demonstrieren, die für die zytometrische Analyse verantwortlich waren. Das Verfahren erfordert eine kleine Geräteausstattung, das Meach-System, mit seinen Medicon- und Fcon-Zubehörteilen. Die Fcon-Zubehörteile können jedoch problemlos durch Nylonmembranen gleicher Porengröße ersetzt werden.

Die einzigen weiteren benötigten Materialien und Reagenzien sind ein Glasverteiler, zwei Schalen, Schere und Pinzette, eine drei bis fünf Milliliter fassende Spritze, eine Darmkammer, DMM-Kulturmedium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und NDA. Falls geplante nachfolgende Anwendungen RNA-Manipulationen beinhalten, sollten alle Materialien und Lösungen entsprechend behandelt werden, um den Protokollschritt durchzuführen. Legen Sie die dissektierte Hodenprobe in eine 96 Millimeter durchmessende Glaspetrischale auf Eis, die 10 Milliliter des ergänzten Kulturmediums namens dm enthält.

Entfernen Sie die TAL Virginia, schneiden Sie den dekapitierten Hoden in quadratische Stücke von zwei bis drei Millimetern Kantenlänge. Geben Sie vier bis fünf dieser Stücke zusammen mit einem Milliliter Kode, ergänzt durch D, in eine Einweg-Medikon-Zentrifugenkabine und verarbeiten Sie sie 50 Sekunden lang im Meta-Maschinen-System. Jede Medikon-Einheit enthält ein festes Edelstahlsieb mit etwa hundert sechseckigen Löchern, die jeweils von sechs Mikromessern umgeben sind.

Das Gewebe wird durch einen Metallrotor innerhalb der Medicon-Kammer zu jedem Loch transportiert und durch das Überströmen über die geschärften Löcher und durch den Metallsieb zerkleinert, während eine Mikropumpe unter dem Sieb Flüssigkeit zuführt und die Hülsen auswäscht. Sammeln Sie das Ergebnis als Zellsuspension aus dem Medicon mit einer Spritze von drei bis fünf Millimetern Länge ohne Nadel auf. Benetzen Sie anschließend ein 50-Mikrometer-Falcon- oder Nylonfilter gleicher Größe mit einem halben Milliliter Medium und filtrieren Sie die Suspension damit.

Wiederholen Sie den Schritt, jedoch unter Verwendung eines 25-Mikrometer-Nylonfilters oder eines äquivalenten Falcon-Geräts, und stellen Sie es auf Eis. Entnehmen Sie eine ALI-Aliquot der Zellsuspension, um die Zellen in einer Neubauer-Kammer zu zählen, und stellen Sie die Zellkonzentration auf ein- bis zweimal 10⁷ Zellen pro Milliliter in Kulturmedium ein. Fügen Sie abschließend NDA in einer Endkonzentration von 0,2 % hinzu, um Zellpumpung sowie Muskelverstopfung während nachfolgender Durchflussuntersuchungen zu vermeiden. Falls die Zellviabilität evaluiert werden soll, kann dies mithilfe des Live-Dead-Vitalitätskits für tierische Zellen gemäß den Herstelleranweisungen vor der Durchflusszytometrie durch Zugabe eines fluoreszierenden Farbstoffs erfolgen.

Die Wahl des Fluorochroms hängt von den verfügbaren Lasern ab. In dieser Demonstration wird die Verwendung verschiedener Farbstoffe gezeigt, die an DNA binden. Obwohl Propidiumiodid üblicherweise bei niedrigen Konzentrationen als Farbstoff für fixierte oder tote Zellen verwendet wird, haben wir festgestellt, dass es bei hohen Konzentrationen in unfixierte Hodenzellen in den nach der hier vorgestellten Methode hergestellten Suspensionen eindringt.

Das liegt vermutlich an der damit verbundenen mechanischen Belastung, die in Kombination mit der sensorischen Natur des semialen Epithels bei minimaler Manipulation zum Bruch der zellulären Verbindungsbrücken führen könnte. Für die Propidiumiodid-Färbung 10 Minuten vor der Probenauswertung die Lösung mit einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter zur Zellsuspension hinzufügen und bei null Grad Celsius im Dunkeln inkubieren, um propidiumiodid-gefärbte Zellen zu analysieren. Zur weiteren Sortierung verwenden wir einen FACS-Vantage-Durchflusszytometer, der mit einem auf 488 Nanometer emittierenden Argon-Ionen-Laser von Coherent ausgestattet ist. Die Laserleistung wird auf hundert Milliwatt eingestellt, und die von Propidium I emittierte Fluoreszenz wird über einen FL2-Detektor mit einem 575/26-Bandpassfilter erfasst.

Verwenden Sie eine 70-Mikrometer-Düse für die Durchflusszytometriemessungen und die SQUA-Software zur Analyse der folgenden Parameter: Vorwärtsstreuung, Seitwärtsstreuung, gesamte emittierte Fluoreszenz oder Pulsfläche sowie Dauer der Fluoreszenzemissionen oder Pulsbreite. Die Ergebnisse werden in Gramm dargestellt, was die Anzahl der Ereignisse auf jedem Fluoreszenzniveau repräsentiert, sowie in D-Diagrammen, die Seitwärtsstreuung gegen Fluoreszenz-Pulsfläche und Fluoreszenz-Pulsfläche gegen deren Breite anzeigen.

Doppelte werden mittels DO-Diagrammen des fluoreszierenden Impulsbereichs gegenüber dessen Breite aus der Analyse ausgeschlossen, um SM-Monozytenpopulationen mit dem Sortiermodus „fax vantage“ im normalen R- oder normalen C-Modus zu sortieren, wobei drei sortierte Tropfen als Umhüllung verwendet werden. Stellen Sie den Probendifferenzdruck so ein, dass Zellen mit einer Rate von 500 bis 1500 pro Sekunde analysiert werden. Halten Sie Proben- und Sammelröhrchen durch Verwendung einer Kühleinheit auf drei bis vier Grad Celsius.

Alternativ können die Zellen in der Suspension mit anderen Fluorochromen gefärbt werden. Beispielsweise kann der Vitalfarbstoff HER 3 3 3 4 2 in einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter verwendet und für mindestens 10 Minuten bei 37 Grad im Dunkeln inkubiert werden, um Hirsch zu erhalten.

3, 3, 3, 4, 2 Färbeproben. Die Zellanalyse wurde mit einem MO-Flusszytometer durchgeführt, das mit einem UV-Anregungslaser mit einer Leistung von 25 Milliwatt und einer 70-Mikrometer-Düse ausgestattet ist. Verwenden Sie die Summit-4.3-Software oder eine vergleichbare Software, um dieselben zuvor angegebenen Parameter zu analysieren, wenn die Zellsuspensionen unter Phasenkontrastoptik untersucht werden, wobei Suspensionen von geschnittener Qualität beobachtet werden.

Die Hauptvorteile dieses Protokolls liegen vor allem in der Herstellung von Hodenzellsuspensionen mithilfe der vielen Maschinen und der ausschließlichen Dauer von nur 15 Minuten, einschließlich Test-Sektion, Gewebeschnitt, ach, maschineller Verarbeitung und Filtration – diese Zeitspanne beträgt etwa ein Achtel der Zeit, die üblicherweise von anderen Protokollen benötigt wird. Die Kürze dieses Protokolls zusammen mit einem minimalen manuellen Aufwand erklärt die gute Erhaltung kurzlebiger Makromoleküle, was entscheidend ist, wenn eine repräsentative Probe der in der ursprünglichen Zellpopulation vorhandenen Verbindungen benötigt wird. Da die Methode einen geringen manuellen Aufwand erfordert, ist sie leicht reproduzierbar, wie in dieser Tabelle dargestellt.

Die relativen Anteile der verschiedenen Hodenzellpopulationen für sieben unabhängige Experimente, die an adulten Ratten durchgeführt und mittels Durchflusszytometrie analysiert wurden, sind beispielhaft dargestellt, um die Reproduzierbarkeit der Methode zu zeigen. Im Gegensatz zu den meisten derzeit verwendeten Partikeln zur Herstellung von Hodenzellsuspensionen erfordert die hier vorgestellte Methode keine enzymatische Wirkung. Obwohl Kollagenase-Tropfen in RNAs, die zu den allgemein eingesetzten Enzymen gehören, zur unzureichenden Trennung des Gewebes beitragen, können sie die Erhaltung der interessierenden Makromoleküle beeinträchtigen.

Der Verzicht auf enzymatische Behandlungen begünstigt nicht nur die Erhaltung von RNA und Proteinen, sondern macht das Protokoll auch kostengünstiger. Obwohl bereits früher berichtet wurde, dass mechanisch hergestellte Zellsuspensionen stärker neigen zu agglomerieren als trypsinierte, haben wir festgestellt, dass dieses Protokoll in Abwesenheit enzymatischer Wirkung zu gut entflockten Zellsuspensionen führt. Der Zusatz von NDA hat sich als sehr hilfreich bei der Verhinderung von Zellagglomerationen erwiesen.

Die hohe Qualität der Suspensionen zeigt sich ebenfalls in der zytometrischen Analyse, wie durch den minimalen Zelltrümmergehalt beurteilt werden kann. Laut veröffentlichten Angaben werden etwa 13 % der runden Spermien als mehrkernig gefunden, unabhängig davon, ob die Zellsuspensionen ausschließlich durch mechanische Methoden oder in Gegenwart von Trypsin hergestellt wurden. Viele maschinell hergestellte Suspensionen weisen jedoch sehr selten mehrkernige Zellen auf, wahrscheinlich aufgrund einer geringeren Verklumpung, da mehrkernige Zellen hauptsächlich als Folge der Gewebemanipulation entstehen.

Ein Beispiel einer mit vielen Maschinen hergestellten Zellsuspension aus Rattenhoden ist auf diesem Bild zu sehen. Wie ersichtlich ist, sind die Zytoplasmen gut erhalten, und die relativen Anteile der C2- und C4-Zellpopulationen in maschinell hergestellten Hodensuspensionen verschiedener Nagetiere entsprechen denen der intakten PEs.

Dies untermauert die Annahme, dass die hier beschriebene Methode keine selektive Schädigung eines bestimmten Zelltyps verursacht. Überraschenderweise wird die Repräsentanz der Zelltypen in vielen maschinell hergestellten Suspensionen deutlich besser erhalten als bei den klassischen Tropfpräparationsmethoden. Wie zu sehen ist, weichen die Zytographien, die für meine aufbereitete testikuläre Zellsuspension erhalten wurden, nicht wesentlich von zuvor publizierten ab.

Tatsächlich zeigen die erhaltenen Histogramme und Punktdiagramme die drei charakteristischen vier C- zu C-Testikelzellpopulationen basierend auf dem DNA-Gehalt sowie die scheinbare subhaploide Population, die die hochkondensierten haploiden Spermatozoen repräsentiert. Diese Profile wurden sowohl für hergestellte als auch für Propidiumiodid-gefärbte Suspensionen beobachtet und gelten sowohl für erwachsene als auch für juvenile Proben. Die Sortierung von spermatogetischen Zellen wurde mit einer Reinheit von über 98 % erfolgreich durchgeführt, und zwar sowohl für ausgewählte testikuläre Populationen basierend auf dem DNA-Gehalt als auch für Subpopulationen mit gleichem DNA-Gehalt, jedoch unterschiedlichem Grad der Chromatin-Kondensation, wie beispielsweise sleep-tine und tine Myozyten.

Wie wir in den Meerschweinchen-Testissuspensionen beobachten konnten, ergibt sich bei sortierten Populationen eine gute RNA-Qualität und ermöglicht differentielle Genexpressionsstudien, selbst bei mit Propidiumiodid gefärbten Populationen, da das Protokoll keine RNA-Behandlung einschließt. In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass Propidiumiodid im Gegensatz zu anderen Farbstoffen sowohl DNA als auch doppelsträngige RNA anfärbt. Doch in dieser Grafik einer Analyse der Meerschweinchen-Testissuspension zeigen die vergleichbaren Profilverläufe bei Verwendung von Propidiumiodid parallel zu Vibrant DyeCycle Orange – einem vitalen, DNA-spezifischen Farbstoff –, dass die RNA-Färbung die zytometrischen Histogrammmuster nicht signifikant beeinflusst.

Diese Liste fasst die wichtigsten Vorteile des beschriebenen Protokolls zusammen. Die hier beschriebene optimierte Methode ermöglicht es, geeignete Hodenzellsuspensionen zur zytometrischen Analyse verschiedener Spermienstadien von Nagetieren innerhalb von nur 15 Minuten herzustellen, einschließlich der Hodenisolation, Gewebeschnitt und Verarbeitung mittels des ME-Maschinensystems. Die Kürze des Verfahrens, die höhere Reproduzierbarkeit sowie die qualitativ besseren Zelltypverhältnisse in den Zellsuspensionen machen es zu einer guten Alternative gegenüber anderen, aufwändigeren und zeitraubenderen selbst durchgeführten Methoden, die derzeit verwendet werden.

Außerdem ist diese Methode aufgrund des geringen manuellen Aufwands und des Verzichts auf Enzyme und Detergenzien ideal für empfindliche nachgeschaltete Anwendungen wie Genexpressionsstudien geeignet.