Name: Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Lernen Sie eine schnelle, enzymfreie Methode zur Herstellung hochwertiger Hodenzellsuspensionen aus Nagetieren für die Durchflusszytometrie. Dieses 15-minütige Protokoll bewahrt Zellviabilität und Makromoleküle für Genexpressionsstudien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde teilweise durch CSIC (I + D Projekt C022) und PEDECIBA unterstützt. Die Autoren wollen Mariela Bollati und Valentina Porro aus der Zellbiologie Unit (Institut Pasteur de Montevideo) danken für die großzügige Zusammenarbeit über die MoFlo Zellsortierer und Merial-Montevideo für sanft bietet alle Meerschweinchen Proben in diesem Projekt verwendet. Abbildung 1 Abbildungen 2 und 3 und Tabelle 1 mit Genehmigung der S. Karger AG, Basel;; wurde mit freundlicher Genehmigung von BioMed Central reproduziert und die Abbildungen 4 und 5 wurden reproduziert oder mit Genehmigung von John Wiley &amp; Sons, Inc. (Copyright im Besitz angepasst Wiley- Blackwell, 2011).

1. Herstellung von Zellsuspensionen <ol><li> Sacrifice die Probe entsprechend den Empfehlungen der Fachausschüsse wie IACUC oder gleichwertig verwendet werden (in Uruguay, Nationale Kommission für Tierversuche [CNEA]). In unserem Fall wurde eine Überdosis Pentobarbital verabreicht. </li><li> Präparieren Sie die Hoden nach der Norm zulässigen Verfahren und legen Sie sie in einem 96 mm Glas Petrischale auf Eis, mit 10 ml eiskaltem DMEM ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum. </li><li> Entfernen Sie die Tunica albuginea und schneiden Sie die entkapselten Hoden in quadratische Stücke von 2 - 3 mm auf jeder Seite. </li><li> Diese Stücke werden dann in einem Medimachine eine automatisierte mechanische Mühle, wo das Gewebe in einer austauschbaren Einheit, die eine perforierte Edelstahlsieb und ein Metall Rotor aufgeschlüsselt verarbeitet wird. 5 dieser Stücke in einem 50 um Einweg-Einheit, Schalter auf der disaggregator und Prozess - Um dies zu tun, Platz 1 ml kaltem DMEM und 4 ergänzt<html> für 50 Sekunden die folgenden, einfachen Anweisungen des Herstellers. </li><li> Wiederherstellen der resultierende Zellsuspension aus der Aufschlüsselung Gerät mit einer 3 - 5 ml Spritze ohne Nadel. </li><li> Man filtriert durch ein 50 um Nylon-Mesh, vorher eingeweicht mit 0,5 ml DMEM ergänzt. </li><li> Filtern Sie die Suspension wieder mit einem getränkten 25 um Nylon-Mesh und auf Eis stellen. </li><li> Zählen in einer Neubauer-Kammer und stellen zelluläre Konzentration auf 1 - 2 x 10 7 Zellen / ml mit DMEM ergänzt. Mindestens 4 x 10 7 Zellen / Gramm Hoden Material werden üblicherweise erhalten. </li><li> Schließlich, fügen NDA (2-naphthol-6 ,8-disulfonsäure Dikaliumsalz) bis zu einer Endkonzentration von 0,2%, um Zelle Verklumpung verhindern. </li><li> Optional: Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen der Hoden Zellsuspensionen mit einem kommerziell erhältlichen Kit Lebensfähigkeit für tierische Zellen, nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 2. Durchflusszytometrieanalyse ve_content &quot;&gt; Wir haben ein Becton-Dickinson FACSVantage Durchflusszytometer mit einer kohärenten Argon-Ionen-Laser Resonanz bei 488 nm für die Analyse von Zellen mit hohen Konzentrationen von Propidiumiodid (PI) gefärbt emittieren eingesetzt wird. ausgestellt (PI Eintritt in unfixierten Zellen unter Stress wurde an anderer Stelle 9,10) gerichtet. <ol><li> Für PI-Färbung, fügen Fluorochrom in einer Endkonzentration von 50 ug / ml der Zellsuspension, und Inkubation für 10 min bei 0 ° C in der Dunkelheit. </li><li> Laserleistung bis 100 mW und einen 575/26 Bandpass-Filter verwendet wird, um PI-emittierten Fluoreszenz in FL2 sammeln eingestellt. </li><li> Wir führen FC Messungen mit einem 70 um Düse. Für die Sortierung Spermatozyte Populationen gesetzt Sortierung Modus Normales-R oder normal-C, unter Verwendung von 3 sortiert Tropfen als Umschlag. Halten Sie Probe und Sammlung Röhrchen bei 3-4 ° C unter Verwendung einer Kühleinheit. Einstellen Probe Differential an Zellen mit einer Geschwindigkeit von 500 bis 1500 pro Sekunde zu analysieren. </li><li> Verwenden CellQuest Software (BD) zu analysieren,die folgenden Parameter: forward scatter (FSC-H); Seitwärtsstreuung (SSC-H); insgesamt emittierten Fluoreszenz-oder Puls-Bereich (FL2-A) und Dauer der Fluoreszenz-Emission oder Puls-Weiten (FL2-W). </li></ol> Alternativ haben wir die vitalen Farbstoff Hoechst 33342 in einer Endkonzentration von 5 ug / ml eingesetzt und inkubiert 10 min bei 37 ° C im Dunkeln. Zelle Analyse wurde mittels eines MoFlo Zytometer (DakoCytomation), ausgestattet mit einem UV-Anregungswellenlänge Laser, der bei 25 mW und mit einer Düse 70 um erfolgt. Datenmanipulation wurde mit Summit v4.3 Software (DakoCytomation) durchgeführt.

<ol><li>Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeistrich%2C+ML+%22Methods+of+Cell+Biology%22">Methods of Cell Biology</a>. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).</li>
<li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation%2C+physical+characterization%2C+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li>
<li>Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602(2011).</li>
<li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li>
<li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li>
<li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+but+not+dead%3F+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li>
<li>Spanò, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li>
</ol>

Die optimierte hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Herstellung von Zellsuspensionen aus Nagetier Hodengewebe in einem sehr schnellen und reproduzierbaren Weise vermeiden Enzym und Reinigungsmittel Behandlung und das Beibehalten der guten Integrität der Zelle und Art Proportionen. Die Kürze des Verfahrens (die 15 min Spannweite umfasst Hoden Dissektion, Schneiden von Gewebe und Verarbeitung), Aufwand ist minimal, und das Fehlen von enzymatischen Behandlungen sind nur einige der wichtigsten Vorteile. All dies würde...

<table><tbody><tr><td>Medimachine System</td><td>BD</td><td>340587</td><td></td></tr><tr><td>Medicon Einheit (50 &mu; m)</td><td>BD</td><td>340591</td><td></td></tr><tr><td>Filcon-Einheit (50 &mu; m)</td><td>BD</td><td>340603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>430-2100</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>PAA</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>NDA</td><td>Chemos BmbH</td><td>277081</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Stammlösung 5 mg/ml; verwendet in einer Endkonzentration von 5 μm; g/ml</td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>287075</td><td>Stammlösung 1 mg/ml; verwendet in einer Endkonzentration von 50 μm; g/ml</td></tr></tbody></table>

einfache und effiziente technik zur herstellung von hodenkrebs zellsuspensionen

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian Hoden sehr komplexe Organe, die mehr als 30 verschiedenen Zelltypen, einschließlich somatischen Zellen und Hoden verschiedenen Stadien der Keimbahn-Zellen enthalten. Diese Heterogenität ist ein wichtiger Nachteil bezüglich der Studie von den Basen der Säuger Spermatogenese, als reiner oder angereicherter Zellpopulationen in bestimmten Stadien der Entwicklung der Spermien für die meisten molekularen Analysen 1 benötigt. Verschiedene Strategien wie Staput 2,3, zentrifugale Elutriation 1 und Durchflusszytometrie (FC) 4,5 wurden eingesetzt, um angereichert oder gereinigt Hoden Zellpopulationen zu erhalten, um differentiellen Genexpression Studien zu ermöglichen. Es ist erforderlich, dass die Zellen in Suspension für die meisten Anreicherung / Reinigung möglich sind. Im Idealfall wird die Zellsuspension werden Vertreter des ursprünglichen Gewebes, haben einen hohen Anteil an lebensfähigen Zellen und nur wenige multinucleates - die dazu neigen, wegen der Form,Syncytial Natur des Samenepithels 6,7 - und der Mangel Zellklumpen 1. Frühere Berichte hatten bewiesen, dass Hoden Zellsuspensionen von einem ausschließlich mechanischen Verfahren hergestellt leichter verklumpt als diejenigen trypsinierten 1. Auf der anderen Seite, enzymatische Behandlungen mit RNasen und / oder Disaggregation Enzyme wie Trypsin und Collagenase führen zu Makromolekülen Abbau, was für die bestimmten Downstream-Anwendungen ist. Der ideale Prozess sollte so kurz wie möglich und beinhalten minimale Manipulation, um so eine gute Erhaltung der Makromoleküle von Interesse, wie mRNAs zu erreichen. Diese Protokolle zur Herstellung von Zellsuspensionen aus festen Geweben sind in der Regel zeitaufwendig, sehr bedienerabhängige und wahlweise beschädigen bestimmten Zelltypen 1,8. Das Protokoll hier vereint die Vorteile einer hoch reproduzierbar und extrem kurzen mechanischen Aufschluss mit dem einbsence der enzymatischen Behandlung, was eine gute Qualität Zellsuspensionen, die für die durchflusszytometrische Analyse und Sortierung 4 und anderweitige Genexpressionsstudien 9 verwendet werden kann.

Ein Beispiel für ein gut aufgeschlüsselten Zellsuspension aus Rattenhoden mit dem hier beschriebenen Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Im Vergleich zur enzymatischen Behandlungen 6,8 und den zuvor beschriebenen mechanischen Aufschluss Verfahren 2 ist die hier vorgestellte viel schneller beinhaltet weniger Handhabung ist leicht reproduzierbar (nicht bedienerabhängige) und macht knapp Zelltrümmer (insbesondere im Vergleich zu anderen mechanischen ...

Ein neuartiges Protokoll für die mechanische Aufbereitung von Hoden Zellsuspensionen von Nagetier Material, die Vermeidung Enzyme und Reinigungsmittel, beschrieben. Das Verfahren ist sehr einfach, schnell, reproduzierbar und macht gute Qualität Zellsuspensionen, die sich für Durchfluss Sortier-und RNA-Extraktion sind.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

In diesem Video wird ein sehr einfaches und effizientes Protokoll zur Gewinnung einer zellulären Suspension von Testmaterial aus Nagetieren innerhalb von nur 15 Minuten vorgestellt. Die Methode wurde an Hodengewebe von Maus, Ratte und Meerschweinchen angewandt und verwendet eine Metamachine-Vorrichtung, um das verkapselte Gewebe aufzulösen. Nach einer Filtration und Färbung der Zellen ist die Suspension für die Durchflusszytometrie bereit.Die Analyse oder Sortierung von Zellen mittels Durchflusszytometrie setzt eine homogene Zellpopulation voraus, was eine Grundvoraussetzung für die Untersuchung biochemischer und molekularer Vorgänge während der männlichen Gametogenese ist. Die Heterogenität des Hodengewebes mit über 30 verschiedenen Zelltypen stellt daher eines der Hauptprobleme bei der Erforschung der molekularen Grundlagen der Spermatogenese bei Säugetieren dar. Aus diesem Grund wurden verschiedene Methoden angewandt, um angereicherte bis gereinigte Populationen von Hodenzellen zu erhalten, einschließlich der Nutzung von PEG-Gradienten und zentrifugalen Trennverfahren.Der erste Schritt für jede Zellseparationsmethode ist die Herstellung einer zellulären Suspension. Die derzeitig

simple-efficient-technique-for-preparation-testicular-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Distanziert Zellen aus bestimmten Gewebearten erfordert spezifische Parameter für Gewebe aggitation zu einem hohen Volumen von lebensfähigen, kultivierbaren Zellen zu erhalten. Die Miltenyi gentleMACS Dissociator optimiert diese Aufgabe mit einem einfachen, praktischen Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird die Verwendung dieser Vorrichtung auf nerual Gewebe erklärt.

Generierung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus Nervengewebe

Dieses Video zeigt die Isolierung von Sertoli-Zellen aus Samenkanälchen der Maus, einer Komponente der Hoden. Enzymatischer Verdau und wiederholtes Waschen fördern die Freisetzung von Sertoli-Zellen in die Lösung, die zur Proliferation und zum Wachstum weiter kultiviert werden kann.

Isolierung immunregulatorischer Sertoli-Zellen aus Samenmagentubuli der Maus

Das Video zeigt die Herstellung einer Einzelzellsuspension von Immunzellen aus einem murinen Gehirngewebe. Es beinhaltet eine enzymatische Verdauung, um Zellen aus dem Gehirngewebe freizusetzen, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation, um die Immunzellen basierend auf ihrer Dichte zu isolieren und die Einzelzellsuspension zu erhalten.

Herstellung einer einzelligen Suspension von Immunzellen aus murinem Hirngewebe

Eine einfache Methode zur Ableitung und pflegen Spermatogonien Stamm-und Vorläuferzellen Zelllinien aus erwachsenen Mäusen wird hier vorgestellt. Das Verfahren nutzt Feeder-Zellen, die aus dem somatischen Zellkompartiment der adulten Maus Hoden. Diese Technik ist für die gemeinsame Mausstämmen, auch transgenen Knock-out und Knock-in Mäusen.

Serielle Anreicherung von Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) in der Kultur für die Ableitung des langfristigen adulten Maus SSC Linien

Die STA-PUT Verfahren ermöglicht die Trennung der verschiedenen Populationen von Zellen spermatogenic basierend auf Größe und Dichte.

Die Trennung der Spermatogenese Zelltypen Mit STA-PUT Velocity Sedimentation

Das Material beschreibt hier ein Verfahren, das entwickelt wurde, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Dies wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit für den Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die  Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) anwendbar.

Folienvorbereitungsmethode zur Erhaltung der dreidimensionalen Chromatinarchitektur von Hodenkeimzellen

Primäre Sertoli-Zellen sind für das Studium Hoden-Immun-Privileg, Signaltransduktion während der Entzündung oder Infektion und Nutzung ihrer immun Eigenschaften erforderlich. Hier beschreiben wir ein Enzym-basiertes Protokoll für die Isolierung von hoch gereinigten primären Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Rattenhoden.

Isolierung von Sertoli-Zellen und peritubulären Zellen aus Ratte Hoden

Diese Arbeit beschreibt die Standardisierung eines Verfahrens, um gereinigte Keimzellpopulationen aus Hodengewebe verschiedener Säugetierarten zu erhalten. Es ist ein einfaches Protokoll, das mechanische Hodendissoziation, Färbung mit Hoechst-33342 und Propidiumjodid und FACS-Sortierung kombiniert, mit breiten Anwendungen in vergleichenden Studien der männlichen Fortpflanzungsbiologie.

Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie

Präsentiert hier ist ein Protokoll zur Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten, runden Spermaatien und lästigen Spermaatiden aus erwachsenen Maushoden mit einem diskontinuierlichen Rinderserum-Albumin-Dichtegradienten mit Standard-Laborgeräten.

Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und Spermatien aus Maushoden mit Standard-Laborgeräten

Hier werden vier Methoden zur Erzeugung von Hodenorganoiden aus primären neonatalen murinen Hodenzellzellen beschrieben, d.h. extrazelluläre Matrix (ECM) und ECM-freie 2D- und 3D-Kulturumgebungen. Diese Techniken haben mehrere Forschungsanwendungen und sind besonders nützlich für das Studium der Hodenentwicklung und Physiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Lernen Sie eine schnelle, enzymfreie Methode zur Herstellung hochwertiger Hodenzellsuspensionen aus Nagetieren für die Durchflusszytometrie. Dieses 15-minütige Protokoll bewahrt Zellviabilität und Makromoleküle für Genexpressionsstudien.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Weitere Videos entdecken