Name: Vorderhirn Elektrophysiologische Aufzeichnung im Larven Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Lernen Sie die extrazelluläre Elektrophysiologie im Vorderhirn von Danio rerio-Larven. Diese Methode ermöglicht die Aufzeichnung anfallsähnlicher Aktivität in vivo für Epilepsieforschung.

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Der Autor möchte Peter Castro und Matthew Dinday für ihre frühen Bemühungen, Zebrafisch im Labor zu etablieren danken. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health EUREKA-Stipendium (# R01NS079214-01) finanziert.

Ein. Ei-Produktion und Sammlung <ol><li> Zebrafisch Tierhaltung folgt Standardverfahren beschrieben 8. Kurz gesagt, werden erwachsene Zebrafisch in Zuchtbecken mit Trennwänden in Kraft gesetzt. Wenn die Lichter im Zimmer am nächsten Morgen kommen, sind Trennwände aus Zuchtbecken und Fisch etwa 20 bis 60 min von ungestörten Paarungszeit dürfen entfernt. </li><li> Eier aus Zuchtbecken werden in einem Sieb gesammelt und gespült mit Ei Wasser. Eier werden dann in eine Petrischale mit Ei Wasser übertragen. Unbefruchteten Eiern und Schmutz werden mit einem Transferpipette. </li><li> Ort Petrischale mit der gesammelten Eier in einem Inkubator (28-32 ° C). Nach Eiern schlüpfen etwa zwei Tage nach der Befruchtung (dpf), zu entfernen Chorion und andere Ablagerungen mit einer Pipette. </li><li> Am gewünschten Tag nach der Befruchtung (3 bis 8 dpf) entfernen Petrischale mit frei schwimmende Larven und Platz auf dem Labortisch bei Raumtemperatur. </li></ol><ol><li> Mit einem Feinpipettenziehvorrichtung, ziehen ein 1,2 mm OD Borosilikatglas in zwei Nadeln und an einem 150 mm Petrischale oder leere Pipette box Kapillare durch Verlegung über Silly Putty Rampen. Needles können im Voraus gezogen werden. Unterschiedliche OD Glaskapillaren kann je nach Art des Verstärkers Headstage verfügbar werden. </li><li> Tendieren, die Mikroelektrode mit extrazellulären Aufzeichnungslösung (2 M NaCl) unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer Nalgene Spritzenfilter (4-mm) und Microfil Filament (Warner Precision Instruments) befestigt ist. Schütteln oder tippen Sie den Bolus in Richtung der Nadelspitze bis es wenige oder gar keine Luftblasen mehr vorhanden sind. </li></ol> 3. Immobilisierung in Agar <ol><li> Eine frische Lösung von 1,2% niedrigen Schmelzpunkt Agar in Ei Wasser. Ort Agarlösung in einem Wasserbad set bei ~ 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine Deckglas mit Aufnahme Kammer und im Gefrierschrank (5-10 min). Die Aufnahme Kammer sollte MATCh, dass auf der Elektrophysiologie rig verwendet. Wir verwenden eine low-profile offene Raute Bad Bildgebung Kammer von Warner Instruments (Modell RC-26GLP). </li><li> Mit einer Pasteur oder Transferpipette, Ort ein Larvenstadium Zebrafisch in einem kleinen Tropfen von Ei-Wasser in einem sauberen Petrischale Platte. Zu dieser Tröpfchen, einen Tropfen Lösung, die ein Anästhetikum (0,02% Tricain) und lähmenden Mittels (1 mg / ml α-Bungarotoxin). </li><li> Überwachen Zebrafisch für den Verlust der Bewegung (5 bis 10 min). </li><li> Entfernen Sie das Deckglas / Aufnahme Kammer aus dem Gefrierschrank. Zeigen Kammer auf der Bühne ein Stereomikroskop. Mit einer Pipette, mischen einige ml von 1,2% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt mit Tropfen und Transfer-Lösung (mit Fisch) auf dem Deckglas / Aufnahme Kammer. </li><li> Mit einer Pipettenspitze oder feinen stumpfen Nadel, Position Larven unter dem Stereomikroskop, so dass die Dorsalseite der Fische zu dem Agarosegel Oberfläche ausgesetzt ist. Lassen Agarose zu härten (5-10 min), dann mit einem flachen Spatel Übertragung der Agar-bsperren, um eine Aufnahme Kammer auf einem elektrophysiologischen rig eingestellt. </li></ol> 3. Extrazellulären Feld Recording <ol><li> Fügen Sie 2-5 ml Zebrafisch Speichermedien zur Aufnahme Kammer. Wenn Arzneimittel Änderungen notwendig, perfuse Kammer mit Aufzeichnungslösung mit einer Rate von etwa 1 ml / min. Kein Oxygenierung des Aufzeichnungs-Lösung erforderlich ist. </li><li> Einfügen einer Mikroelektrode (ca. 1 um Spitzendurchmesser, 2-7 MOhm) in den Verstärker Headstage auf einem dreidimensionalen Mikromanipulator montiert. Prüfen Sie, ob der Mikromanipulator in der richtigen Position, um für eine Reihe von Bewegung und Anpassung zu ermöglichen. Bringt die Mikroelektrode Spitze in der Sichtebene des Mikroskops, hoch über der Bühne und mit Grobeinstellung geringeren zu einem Punkt unmittelbar über und etwas vor dem Kopf des Zebrafisch. </li><li> Mit dem Verstärker in &quot;Current-Clamp&quot;-Modus Null die Elektrode. </li><li> Mit Grobeinstellung niedriger die Elektrodenspitze so dass es berührt nur die surface des Zebrafisches, leicht vor dem Vorderhirn. </li><li> Mit Feineinstellung Schritte voran die Elektrodenspitze bis er die Haut des Zebrafisch durchsticht. Absetzen lassen und dann voran die Elektrode mehreren Mikrometern in Vorderhirn. </li><li> Notieren elektrische Aktivität im Current-Clamp-Modus mit Axoscope Software. Daten werden mit einer Abtastrate von 10 kHz erfasst. </li></ol>

<ol><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressing+zebrafish+for+behavioral+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stressing zebrafish for behavioral genetics.</a> Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49(2011).</li>
<li>Rinkwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+an+integrative+system+for+neurogenomics+and+neurosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences.</a> Progress in Neurobiology. 93 (2), 231(2011).</li>
<li>Penberthy, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for human disease.</a> Frontiers in Bioscience. 7, d1439(2002).</li>
<li>Letamendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+an+automated+high-throughput+system+for+zebrafish+in+vivo+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings.</a> PLoS One. 7, e36690(2012).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216(2000).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line.</a> Development. 123, 1(1996).</li>
<li>Suster, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Molecular Biology. 561, 41(2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior%2C+neural+activity+and+c-fos+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131 (3), 759(2005).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+mutagenesis+screen+to+identify+seizure-resistant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish.</a> Epilepsia. 48 (6), 1151(2007).</li>
<li>Williams, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+radiotelemetry+to+evaluate+electrographic+seizures+in+rats+with+kainate-induced+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39(2006).</li>
<li>Marsh, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interictal+EEG+spikes+identify+the+region+of+electrographic+seizure+onset+in+some%2C+but+not+all%2C+pediatric+epilepsy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients.</a> Epilepsia. 51 (4), 592(2010).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+application+of+modularly+assembled+zinc-finger+nucleases+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish.</a> Development. 138 (20), 4555(2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die extrazelluläre Aufzeichnung hier vorgestellte Methode ermöglicht eine sehr sensitive und schnelle Analyse der Hirnaktivität. Diese Aufnahmen sind analog zu elektroenzephalographischen (EEG) Überwachen häufig verwendet, um das Vorhandensein von anormalen elektrischen Entladung (dh Anfall) in Nagetier-Modellen von Epilepsie 11 und 12 Patienten auszuwerten. Extrazelluläre Aufnahmen können mit pharmakologischen Manipulationen kombiniert werden, wie hier gezeigt. Diese Arten von Aufzeichnun...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt </td><td> Fisher-Scientific </td><td> BP1360-100 </td><td> Man löst in Embryos Medien bei 1,2% </td></tr><tr><td> Speichermedien </td><td> Fisher-Scientific </td><td> BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 </td><td> 1 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,2 mM MgCl 2, 10 mM Dextrose, 2,1 mM CaCl 2 pH-Wert auf ca. 7,3 mit 1 N NaOH </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Argent Labs </td><td> MS-222 </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 2133 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Kapillare Glasröhren </td><td> Warner Instruments </td><td> G120TF-3 </td><td> Ziehen Sie auf einen Widerstand von 2 -7 MOhm </td></tr><tr><td> Patch-Clamp-Verstärkers </td><td> Warner Instruments </td><td> PC-505B </td><td> Wir verwenden ein Warner Verstärker Current-Clamp-Modus; Verstärkung bei 2 mV / pA und Bessel-Filter bei 2K eingestellt. Vergleichbare Modelle können nach den Anweisungen des Herstellers verwendet werden. </td></tr><tr><td> Filter / Verstärker </td><td> Cygnus Technologie </td><td> FLA-01 </td><td> Wir verwenden eine Cygnus Vorverstärker; Verstärkung bei 10-20 gesetzt; Cut-off Frequenz bei 1-2K eingestellt; Notch-Filter IN. Vergleichbare Modelle können nach den Anweisungen des Herstellers verwendet werden. </td></tr><tr><td> Axon A / D Board und Axoscope Software </td><td> Molecular Devices </td><td> Axon Digidata 1320A; Axoscope 8,2 </td><td> Daten werden in Axoscope Verwendung spaltfreie Erfassungsmodus gesammelt; Abtastung bei 10 kHz. Vergleichbare Modelle und Programme können nach den Anweisungen des Herstellers verwendet werden. </td></tr><tr><td> Egg Wasser </td><td&gt; Instant Ocean </td><td></td><td> 3 g Instant Ocean Meersalz, 2 ml 0,1% Methylenblau in 10 ml deionisiertem Wasser </td></tr></tbody></table>

vorderhirn elektrophysiologische aufzeichnung im larven zebrafisch

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsie betrifft fast 3 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und bis zu 50 Millionen Menschen weltweit. Definiert als das Auftreten von spontanen Anfällen unprovozierten kann Epilepsie als Folge einer Beleidigung zum Gehirn oder einer genetischen Mutation erworben werden. Die Bemühungen um Modell Anfälle bei Tieren haben vor allem genutzt Beleidigungen (convulsant Drogen, Stimulation oder Hirnverletzungen) und genetische Manipulationen (Antisense-knockdown, homologe Rekombination oder Transgenese) in Nagetieren erworben. Zebrafische sind ein Wirbeltier Modellsystem 1-3, die eine wertvolle Alternative zur Nagetier-basierte Epilepsieforschung bieten könnte. Zebrafische sind ausführlich in der Studie von Wirbeltier Genetik oder Entwicklung verwendet werden, weisen einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit genetischen Säugetieren und exprimieren Homologe für ~ 85% der bekannten menschlichen monogene Epilepsie Mutationen. Aufgrund ihrer geringen Größe (4-6 mm lang), kann Zebrafischlarven in Fluidvolumen so niedrig wie 100 ul werden während der frühen Entwicklung und arra gepflegtlungsgehilfen Multi-Well-Platten. Reagenzien können direkt zu der Lösung in dem Embryonen entwickeln, die Vereinfachung Arzneimittelverabreichung und die eine rasche in-vivo-Screening von Testverbindungen 4 zugesetzt werden. Synthetische Oligonukleotide (Morpholinos), Mutagenese, Zink-Finger-Nuklease und transgene Ansätze können verwendet werden, um rasch zu einer Gen-knockdown oder Mutation im Zebrafisch 5-7 werden. Diese Eigenschaften leisten Zebrafisch Studien eine beispiellose statistische Analyse Vorteil gegenüber Nagetieren in der Studie von neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie. Da der &quot;Goldstandard&quot; für Epilepsie Forschung ist es, zu überwachen und zu analysieren abnorme elektrische Entladungen, die in einer zentralen Struktur des Gehirns (dh, Krampfanfälle), ein Verfahren zur effizienten Aufnahme Hirnaktivität in larvalen Zebrafisch stammen wird hier beschrieben. Diese Methode ist eine Anpassung der herkömmlichen extrazellulären Aufnahmetechniken und ermöglicht einen stabilen langfristigen Überwachung der Hirnaktivität in intakten Zebrafisch-Larven. Sreichlich Aufnahmen werden für akute Anfälle durch Bad Anwendung convulsant Drogen und spontane Anfälle in einem genetisch veränderten Fischen aufgenommen induzierte gezeigt.

Beispiele für elektrografische anfallsähnliche Entladung im Vorderhirn eines Agar-embedded Zebrafischlarven aufgezeichnet sind in Abbildung 1 gezeigt. Oder 1 mM Picrotoxin (in B; 8 dpf); großer Amplitude Multi-Impuls-Burst-Entladung in diesen Proben wurde durch Anwendung eines Bades Konvulsivum Wirkstoff, 40 mM Pilocarpin (6 dpf in A) hervorgerufen. In diesen Aufnahmen, immobilisiert und Agar-Zebrafisch eingebettet werden kontinuierlich für bis zu 90 min verfolgt. Fisch bleibt unter diesen Aufnahmebedin...

Eine einfache Methode, um extrazelluläre Feldpotentiale in der larvalen Zebrafisch Vorderhirn aufnehmen beschrieben. Das Verfahren bietet eine robuste<em&gt; In vivo</em&gt; Auslesen der Beschlagnahme-artige Aktivität. Diese Technik kann mit gentechnisch veränderten Zebrafischlarven tragenden Epilepsie-verwandten Genen oder Anfälle durch Verabreichung von Medikamenten Konvulsivum evozierten verwendet werden.

Vorderhirn Elektrophysiologische Aufzeichnung im Larven Zebrafisch

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, extrazelluläre Feldaufnahmen aus dem Vorderhirn einer intakten Zebrafischlarve zu erhalten. Dies wird erreicht, indem die Larve des Zebrafisches zunächst in einem Arous-Block immobilisiert wird. Als nächstes wird eine Aufzeichnungsmikroelektrode unter direkter Visualisierung im Vorderhirn platziert.Der letzte Schritt besteht darin, die elektrische Aktivität des Vorderhirns aufzuzeichnen. Letztendlich können die Ergebnisse verwendet werden, um die abnormale elektrographische Anfallsaktivität bei intakten Zebrafischlarven zu überwachen. Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich zeigen wollte, dass Anfälle bei Zebrafischlarven ausgelöst werden können. Die Zebrafischhaltung folgt den zuvor beschriebenen Standardverfahren. Kurz.Ausgewachsene Zebrafische werden in Aufzuchtbecken mit Trennwänden untergebracht. Wenn am nächsten Morgen das Licht im Raum angeht, werden die Trennwände entfernt und die Fische dürfen 20 bis 60 Minuten ungestörte Paarungszeit haben. Die Eier werden dann aus den Tanks gesammelt, in eine Petrischale mit Eiwasser gegeben und mit einer Transferpipette von Schmutz befreit. Legen Sie die Eier in einen Inkubator, und i

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Das Protokoll beschreibt das Verfahren zur Durchführung der Elektrophysiologie bei erwachsenen Zebrafischen. Diese Methode kann zur Messung der neuronalen Aktivität in vivo verwendet werden.

Elektrophysiologie adulter Zebrafische: Eine Methode zur Messung der extrazellulären elektrischen Aktivität von Neuronen in vivo

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung von elektrischen Signalen von den afferenten Neuronen in einer gelähmten Zebrafischlarve, indem eine Mikropipette in der Nähe des Ganglions der Seitenlinie positioniert und eine lose Dichtung für die Signalerfassung gebildet wird. Die extrazelluläre Lösung erhält während dieses Prozesses die neuronale Lebensfähigkeit.

Überwachung der elektrischen Signale der afferenten Neuronen in einer immobilisierten Zebrafischlarve

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie die elektrische Aktivität von einzelnen Neuronen identifiziert in einer ganzen Gehirn Vorbereitung, die komplexe neuronale Schaltkreise bewahrt aufzeichnen. Wir verwenden transgene Fische in der Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Neuronen genetisch mit einem fluoreszierenden Protein zur Identifikation der intakten Zubereitung markiert sind.

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Dieses Papier beschreibt, wie ein erwachsenen Zebrafisch immobilisiert werden können, intubiert und für in vivo elektrophysiologischen Experimenten verwendet, um Aufnahmen und Manipulation der neuronalen Aktivität in einem intakten Tier zu ermöglichen.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Dieses Manuskript beschreibt Verfahren zur elektrophysiologischen Aufnahmen von spinalen Neuronen Zebrabärblingembryonen und Larven. Die Herstellung hält Neuronen in situ und beinhaltet oft minimale Dissektion. Diese Verfahren ermöglichen die elektro Untersuchung einer Vielzahl von spinalen Neuronen, von der ersten elektrischen Erregbarkeit Erwerb durch den frühen Larvenstadien.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Hier stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung und Charakterisierung eines Zebrafischmodells der Epilepsie vor, das aus der vorübergehenden Hemmung des DEPDC5-Gens resultieren.

Verhaltens- und physiologische Analyse in einem Zebrafischmodell der Epilepsie

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die die Messung von Licht evozierten Elektroretinogramm Antworten von Larven Zebrafisch vereinfacht. Eine neuartige kegelförmige Schwamm-Tip Elektrode kann dazu beitragen, das Studium der visuellen Entwicklung im Larvenstadium Zebrafisch mit Elektroretinogramm ERG mit einfacher zuverlässige Ergebnisse und geringere Kosten.

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