Name: Drosophila Erwachsene olfaktorischen Schock Learning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T19:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Lernen Sie die olfaktorische Schock-Konditionierung bei erwachsenen Drosophila zur Messung assoziativer Gedächtnisleistungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Lernmechanismen und Gedächtnisprozessen im Modellorganismus.

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Wir erkennen an, Bloomington Lager Zentren für die Fliege Belastung. Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendium BBSRC (BB / G008973 / 1) unterstützt.

1. Fly Vorbereitung <ol><li> Auskreuzung alle Mutanten, Gal4 / Fachhochschulen und anderen Strecken mit einer Wildtyp-Stamm, wie CSW-, für mindestens sechs Generationen vor den Verhaltensexperimente für genetische Hintergrund 26 steuern. </li><li> Wachsen Fliegen auf einem Standard-Maismehl, Hefe und Melasse Ernährung unter einem 12:12 h Licht-Dunkel-Zyklus bei 25 ° C, wenn nicht gezielte Manipulationen erfordern eine andere Temperatur. <ol><li> Um zu bestimmen, die Auswirkungen der transgenen Expression: Verwenden Sie 18 ° C, um die Expression von Transgenen in Gal4 Gal80 ts (TARGET-System) durch Entwicklung zu verhindern und bewegen Sie dann die Fliegen zu einer 30 ° C-Inkubator 1-2 Tage vor dem Verhaltensexperiment. Führen das Experiment bei 30 ° C, um die Auswirkungen der Expression des Transgens 3,4,6,7,14 bestimmen. </li><li> Für Experimente unter Verwendung von wärmeaktivierten TRPA1 Kanäle Neuronen stimulieren Hebe die Fliegen bei 23 ° C, was eine Temperatur bekannt ist,einen inaktiven Kanal zu halten und dann zu einem Verhalten Zimmer verlagern bei 30 ° C, um die TRPA1 exprimieren Neuronen zu aktivieren. </li><li> Für Experimente mit temperaturempfindlichen shibire synaptische Ausgabe 11, 14,24 blockieren: Hinten die Fliegen bei 18 ° C und führen Tests bei 30 ° C. </li></ol></li><li> Sammeln die Fliegen 1-2 Tage vor dem Experiment und zählen sie in Gruppen von etwa 25 unter Licht CO 2 Anästhesie. Speichern die Fliegen mindestens O / N in der Lebensmittelgefäße (ohne Hefe) bei 25 ° C (wenn nicht gezielte Manipulationen erforderlich eine andere Temperatur) und 70% relativer Luftfeuchtigkeit in einem Klimaraum mit 12.12 h Licht: Dunkelheit, bis die Zeit des Experiments. Hinweis: Diese Lagerung ermöglicht die Fliegen an der anschließenden Lerntest im Klimaraum, die die optimalen Bedingungen für Lernen Drosophila durchgeführt hatte akklimatisieren und, besonders wichtig, entfernt alle täglich ENVIwelt Variationen, die die Verhaltens Phänotyp beeinflusst haben könnten. </li></ol> 2. Vorbereitung vor dem Experiment <ol><li> Führen Sie die Experimente in einem maßgeschneiderten Plexiglas T-Labyrinth (Abbildung 1). </li><li> Überprüfen Sie regelmäßig die Rohrverbindung, um sicherzustellen, dass eine luftdichte Abdichtung während des Experiments erhalten. Falls nötig, ändern Sie die O-Ringe, die die Innenfächer der T-Labyrinth zu versiegeln. </li><li> Zeigen maßgeschneiderte Kupfergitter im Inneren der Rohre Ausbildung. Kontrollieren und reinigen Sie diese Netze regelmäßig, und wenn oxidiert ersetzen. Befestigen Sie die Kupfergitter, Drähte über Krokodilklemmen, die an einem Schalter-Kasten mit einer elektrischen Stimulator verbunden laufen. Mit einem Voltmeter, um sicherzustellen, dass das Gerät liefert die erforderliche Schock. </li><li> G-Klemmen, um das Labyrinth fest zu halten, um die Luft Auslaufen zu verhindern. </li><li> Befestigen Sie die T-Labyrinth zu Schlauch, der mit einer Luftpumpe läuft, damit Gerüche, über die Fliegen ausgelost und anschließend von der T-Labyrinth entfernt. Pflegen milde Luftfließen bei ~ 2 L / min </li></ol> 3. Geruch Verdünnungen <ol><li> Verwenden Sie zwei verschiedene Gerüche in Konzentrationen, so dass die Fliegen zeigen eine gleiche Vorliebe für beide Gerüche. Verwenden Sie 4-methylcyclohexanol (1:67) und 3-Octanol (1: 100) in Mineralöl 7,13 verdünnt. Hinweis: Diese Konzentrationen, die durch Labor variieren werden sorgfältig zu bestimmen. Zum Beispiel andere verwenden 1.10 für beide Gerüche 24. Andere üblicherweise verwendete Gerüche umfassen Ethylacetat und iso-Amylacetat. </li><li> Pipette 30 ul der verdünnten Geruch in einem maßgeschneiderten Geruch in einer Tasse mit einem Kunststoffrohr mit einem perforierten Oberseite, die Luft über den Geruch in der Tasse gezogen werden können abgedeckt Geruch Block platziert, setzt dadurch die Fliegen zu einer Geruchswolke. </li></ol> 4. Training Protocol (Abbildungen 1 und 2) <ol><li> Für erwachsene olfaktorischen Schock Anlage, führen alle Versuche unter einem schwachen Rotlicht (dh., Rote LED), die der Forscher zu sehen, können aber verhindert, dass die fly vom Sehen, so dass die Fliegen auf den Geruchssinn konzentrieren, im Gegensatz zu visuellen Eingänge. </li><li> Einführung der Fliegen in die Ausbildung Rohr und dann dem T-Labyrinth zu befestigen und ihnen zu ermöglichen, um die Röhre und der Luftstrom 90 s anzupassen. </li><li> Präsentieren die erste Geruch (4-methylcyclohexanol, MCH) mit einem 60-V-Schock (bestehend aus zwölf 1,25 sec Pulse mit 3,75 sec Zwischenimpulsintervalle) für eine Gesamtdauer von 60 Sekunden. </li><li> Folgen Sie den Schock mit einem 30 sec Ruhezeit ohne Geruch oder Schock. </li><li> Präsentieren den zweiten Geruch (3-Octanol, OCT) für 60 Sekunden ohne eine Schock. </li><li> Folgen Sie den Schock mit einem 30 sec Ruhezeit ohne Geruch oder Schock. </li><li> Bewegen Sie die Fliegen aus dem Trainingsraum in der zentralen Kammer des T-Labyrinth durch Drehen des T-Labyrinth auf die Seite und schlug sanft die Unterseite der T-Labyrinth auf einer weichen Oberfläche wie einem alten Mäusematte. Pflegen Sie die Fliegen in der zentralen Kammer für 90 Sekunden. </li><li> Montieren Sie die Wahl Rohre in den bottom der Vorrichtung, um das T-Labyrinth bilden. </li><li> Lernen zu messen, zu bewegen, die Fliegen auf die Wahl Punkt der T-Labyrinth, wo sie gleichzeitig an beide Gerüche ausgesetzt und bewegen sich in Richtung eines. Führen Sie eine Testphase für 120 Sekunden. </li><li> Falle die Fliegen in den Röhren Wahl, indem Sie die zentrale Kammer bis blockieren dadurch die Enden der Rohre Wahl. Sammeln Sie die Fliegen in jedem Arm der T-Labyrinth und in der zentralen Kammer in Essen Fläschchen und Zahl. </li><li> Um Speicher zu messen, sammeln die Fliegen nach dem Training (4.6) und übertragen Sie sie von der T-Labyrinth, um Nahrung Fläschchen ohne Hefe. Shop fliegt im Dunkeln bei 25 ° C und 70% Luftfeuchte für die verbleibende Zeit notwendig, um die Speicherphase von Interesse zu bestimmen (siehe Einleitung). Wieder einführen, die Fliegen an der T-Labyrinth wie in Stufe 4.7. </li><li> Für das Langzeitgedächtnis, verwenden Sie eine benutzerdefinierte gebaut Labyrinth, die mehrere Chargen von Fliegen, gleichzeitig trainiert werden können. Verwalten 5 Zyklen der Ausbildung mit 15 min inter-Zyklusintervall (spaCED) oder ohne inter-Zyklusintervall (massiert). Halten die Fliegen bei 18 ° C und 70% Luftfeuchtigkeit in der Dunkelheit bis zur Prüfung. Vor der Prüfung zu bewegen, die Fliegen bis 25 ° C und es ihnen ermöglichen, für mindestens 1 Stunde akklimatisieren. Beurteilen Langzeitgedächtnis 24 Stunden nach dem Training. </li><li> Nach den Verhaltensexperimenten, reinigen Sie die Geruchs Tassen mit heißem Wasser und Reinigungsmittel geruchlos. Nach dem Trocknen Mantel die Tassen mit 10 ul Sigmacote. Trockne die Sigmacote durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen. Gelegentlich reinigen Sie den T-Labyrinth Plexiglasröhren und Geruch Blöcke mit heißem Wasser und Reinigungsmittel geruchlos. </li></ol> 5. Die Berechnung der Performance-Index: ein Maß für die Fliegen &#39;Memory <ol><li> Berechnung des Leistungsindex (PI) für jede Bedingung wie die Anzahl der Fliegen Vermeidung der Schock-gekoppelten Geruch (CS -) minus die Anzahl der Fliegen Wahl der Stoß gepaart Geruch (CS +), geteilt durch die Gesamtzahl der Fliegen (CS - + + CS) 1. Performance Index (PI) = (# CS - fliegt - # CS + fliegt) / (# Gesamtlinie) </li><li> Berechnen Sie die letzte PI des Experiments durch Mittelung der PI der Versuch, bei dem MCH war der Schock gepaarten Geruch und eine, in der Oktober war der Schock gepaarten Geruch. Dies entfernt jegliche Vorspannung der Fliegen, die eine höhere Präferenz für einen Geruch. </li></ol> 6. Sensomotorische Kontrollen <ol><li> Führen Geruchsschärfe durch die Einführung von ~ 40-50 Fliegen in der T-Labyrinth 6,7,17. </li><li> Nach 90 sec, bewegen die Fliegen auf die Wahl Punkt, und es ihnen ermöglichen 2 min zwischen reinen Gerüche und Luft wählen. </li><li> Sammeln und zählen Sie die Fliegen. Berechnen der Vermeidung Prozentsatz durch Dividieren der Gesamtzahl der Fliegen, die den Geruch von denen, die in dem Test teilgenommen gewählt. </li><li> Schock für Reaktivität 6,7,17, stellen die Fliegen in den Schockraum. </li><li> Nach 90 Sekunden der Ruhe, zu verwalten eine 60-V-DC-Stromschlag, von dem die Fliegen können zu einem ähnlichen entkommenRohr ohne ein Schock. </li><li> Lassen Sie 2 min für die Fliegen zu wählen; sammeln und zählen die Fliegen. Berechnen der Stoßvermeidungsprozent, indem die Anzahl der Fliegen, die den Schock vermieden durch die Flucht des Stoßwellenrohrs mit der Gesamtzahl der in dem Experiment entfernt. Sind die Fliegen, die in der zentralen Kammer in der Gesamt von denen, die den Elektroschock entgangen sein. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Drosophila erwachsenen Riech Schock Lern Assay ermöglicht hier vorgestellten Analyse der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen verschiedenen Phasen der Erinnerung, einschließlich Langzeitgedächtnis 15-17. Sowie die Bestimmung der Wirkung von circadianen Rhythmen 18, 19 Schlaf, Ernährung 20,21, Seneszenz 11-13, neurodegenerative Erkrankung, 5 und medikamentöse Behandlungen auf 5,6,19 Speicher. Viele mächtige Ansätze wurden vor kurzem für die funktionelle Bildgebung der neuronalen Schaltkreise, die olfaktorische Gedächtnis in Fliegen 3,4,7,11,16,27 vermitteln entwickelt. Diese optogenetischen Techniken verwenden, die große Repertoire der verschiedenen Promotoren in Drosophila 14,16. Diese Promotoren werden verwendet, um genetisch kodierte Kalzium und cAMP-Reporter in den Speicher Neuronen 16,27 äußern, um die Wirkung von bestimmten Gen-Mutationen auf Erinnerungsspuren zu untersuchen. The Einsatz von Promotoren und bedingte Mutationen bei Erwachsenen ermöglicht die Untersuchung des postEntwicklungs Rolle eines Genprodukts im Speicher 3,4,6,7,13,14. Bildgebung und Verhaltens Ansätze mit licht-und wärmeaktivierte Kanäle zu stimulieren oder zu hemmen verschiedene Neuronen in der Speicherschaltung 11,14,16,22-24 ihrer Funktion weiter aufzuklären kombiniert werden. Außerdem Pilzkörper Neuronen Speicher zugänglich sind Ganzzell Patch-Clamp-Aufnahmen 28 und mathematische und computergestützte Techniken werden eingesetzt, um Drosophila Riech Speicher 29 zu modellieren. Diese experimentellen Fortschritte, kombiniert mit den verschiedenen Formen der hier vorgestellten Assoziativspeicher Protokolle ermöglichen Drosophila verwendet werden, um die molekular und Schaltungsebene Veränderungen in assoziativen Speicher, die in Reaktion auftreten, zu belohnen, Strafe, Motivation, Sucht-Modell werden, Altern und Krankheit 5,6,11-13,16,30-31.

Die hier vorgestellte Methode ist, dass durch Tully und Quinn mit einigen kleinen Modifikationen 1 beschrieben. Der Versuch wird in zwei Phasen durchgeführt: die Fliegen in der ersten Phase ausgebildet und die ausgebildeten Fliegen werden in der zweiten Phase getestet. Während der Ausbildung sind eine Gruppe von Fliegen gleichzeitig Geruch ausgesetzt 1 (CS +) und einen elektrischen Schlag (US) in einem Trainings Röhre. Die Fliegen erhalten dann Geruch 2 (CS -) ohne einen elektrischen Schlag. Diese einzige Paarung von einem bestimmten Geruch mit einem Schock wird als 1-Zyklus-Ausbildung, und die Gerüche, die am häufigsten verwendet werden, sind 4-methylcyclohexanol (MCH) und 3-Octanol (OCT). Ein-Zyklus-Training führt zur Bildung eines labilen Phase des Speichers, der für bis zu 7 Stunden nachgewiesen werden kann; jedoch ist der Speicher in der Regel sofort getestet, um festzustellen, was bezeichnet Lernen, Erwerb oder 2 min Speicher. Speicher gemessen bei 30 min oder 1 h wird als Kurzzeitgedächtnis bezeichnet, während3 Stunden Speicher wird als Halbzeit-Speicher bezeichnet. Die Belichtung von Fliegen zu wiederholende Trainingszyklen mit Lücken zwischen den Trainingszyklen (Abstand Training) führt zu einer konsolidierten Form von Langzeitgedächtnis, das CREB-Transkriptions abhängig ist und dauert bis zu einer Woche. Training ohne Lücken (massierten Ausbildung) führt zur Bildung von Anästhesie-resistenten Speicher (ARM), die ähnlich wie das Langzeitgedächtnis, wird typischerweise nach 5 Zyklen Ausbildung 7,13,15-17,20,21 gemessen 24 Stunden. Mit diesem Ansatz kann die Wirkung verschiedener Gen-Mutationen in diesen verschiedenen Phasen des Speichers bestimmt. Der Promotor getriebene Expression von licht oder temperaturempfindlichen Transgene zu aktivieren oder blockieren die neuronale Aktivität bestimmter Nervenzellen erlaubt es, zu untersuchen, welche Nervenzellen für Speicher Akquisition, Konsolidierung und Wieder 3,4,11,15,16,20 erforderlich sind, 22-24. Speicher bei 1 h wird in der Regel gemessen, wenn das Studium altersbedingten Gedächtnisstörungen, da diese form von Speicher scheint besonders anfällig für die Auswirkungen der Alterung 11-13. Eine vollständige Palette von Verhaltens-und genetischen Kontrollen mit Memory-Experimente durchgeführt, um beispielsweise festzustellen, ob eine Leistung, Mangel wegen eines zentralen Speicher-Defekt oder eine periphere sensorische Defekt, der die Fliege verhindert Erfassung der Schlag oder olfaktorische Stimmung 5 -7, 1 7, 25,26.

<table><tbody><tr><td>3-Octanol</td><td>Sigma</td><td>218405</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylcyclohexanol</td><td>Sigma</td><td>15309-5</td><td></td></tr><tr><td>Benzaldehyd</td><td>Sigma</td><td>418099</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Fluka</td><td>BP2629-1</td><td></td></tr><tr><td>Hexylacetat</td><td>Sigma</td><td>108154</td><td></td></tr><tr><td>Fruktose</td><td>Sigma</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila erwachsene olfaktorischen schock learning

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila in klassischen Konditionierung Experimente über 40 Jahren verwendet worden, so stark erleichtert das Verständnis des Speichers, einschließlich der Aufklärung der molekularen Mechanismen der kognitiven Erkrankungen 1-7 beteiligt. Lernen und Gedächtnis in Larven, die Wirkung von Neuroentwicklungsgene 8-10 studieren und in Fliegen untersucht werden, um den Beitrag der Erwachsenen Plastizität Gene 1-7 messen. Darüber hinaus ist die kurze Lebensdauer von Drosophila erleichtert die Analyse von Genen der Vermittlung altersbedingten Gedächtnisstörungen 5,11-13. Die Verfügbarkeit von vielen Promotoren, die das Nervensystem zu unterteilen Drosophila macht es möglich zu bestimmen, wann und wo ein Gen von Interesse für normale Speicher sowie Relais verschiedener Aspekte des Verstärkungssignals 3,4,14,16 erforderlich. Studieren Speicher bei erwachsenen Drosophila ermöglicht eine detaillierte Analyse derVerhalten und Komponenten bestehen und eine Messung des Langzeitspeichers 15 -17. Die Länge der erwachsenen Stadium beherbergt längerfristigen genetischen, Verhaltens-, Ernährungs-und pharmakologische Manipulationen des Gedächtnisses, zusätzlich zur Bestimmung der Wirkung des Alterns und neurodegenerativer Erkrankungen auf der Speicher 3-6,11-13,15-21. Klassische Konditionierung wird durch die gleichzeitige Präsentation einer geruchsneutral Cue (bedingten Reiz, CS +) und einer Verstärkung Stimulus, wie zB., Einem elektrischen Schlag oder Saccharose, (unbedingter Reiz, USA), die miteinander durch das Tier assoziiert werden induziert 1,16. Eine zweite bedingten Reiz (CS -) wird anschließend ohne die USA vorgestellt. Während der Testphase werden Drosophila gleichzeitig mit CS + und CS-Gerüche präsentiert. Nachdem die Drosophila Zeit zwischen den Gerüchen wählen vorgesehen, ist die Verteilung der Tiere aufgezeichnet. Dieses Verfahren alTiefs assoziativ aversiven oder appetitive Anlage zuverlässig ohne Vorspannung, die durch die angeborene Vorliebe für eine der beiden Reize konditioniert eingeführt gemessen werden. Verschiedene Kontrollexperimente werden auch durchgeführt, um zu testen, ob alle Genotypen reagieren normalerweise auf Geruch und Verstärkung allein.

Der Leistungsindex (PI) dient als Maß für die Speicher. Tabelle 1 stellt eine repräsentative Berechnung PI. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MCH gepaart mit Schock </td><td> 3-OCT gepaart mit Schock </td></tr><tr><td> Fliegen vermeiden MCH (in OCT-Rohr) = 80 Fliegen lieber MCH (MCH in Rohr) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0,6 </td><td> Fliegen vermeiden OCT (MCH in Rohr) = 75 Fliegen lieber OCT (OCT Rohr) = 25 PI 2 = (75-25) / (75 + 25) = 0,5 </td></tr><tr><td> PI des Experiments = (0,6 + 0,5) /2=0.55 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Ein Vertreter Berechnung des Performance-Index mit anschaulichen Daten. Leistungsindizes für verschiedene Experimente können verglichen werden, um Memory-Effekte aufzuklären. Sobald solchVergleich ist in Figur 3, die die Ergebnisse einer Reihe von Experimenten mit Canton S erwachsenen Fliegen Wildtyp (WT) und mutierten dunce Lern erwachsenen Fliegen 1 ausgeführt enthält gezeigt. Der Mittelwert von 10 PIs vorgesehen ist, wobei die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung vom Mittelwert (SEM). Diese Ergebnisse zeigen, dass Narren Fliegen zeigen eine Reduktion in das Lernen im Vergleich zum Wildtyp. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die erwachsenen Versuchsaufbau. Die Fliegen sind geschult und in einem T-Labyrinth getestet. Die Ausbildung beinhaltet die Präsentation einen Geruch A mit elektrischer Schlag, gefolgt von einem zweiten Geruch B ohne elektrischen Schlag. Nach einer Ruhezeit in der mittleren Kammer die Fliegen mit den beiden Gerüche gleichzeitig präsentiert. Die Fliegen sind gefangenin den beiden Röhren und gesammelt und gezählt, um Lernen / Speicherstände zu erhalten. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Erwachsenenbildung Protokoll. Die Fliegen werden in zwei Schritten trainiert. Der erste Schritt, wo Fliegen erhalten einen Geruch (CS +), gepaart mit Elektroschock (US) für 60 Sekunden. Im nächsten Schritt erhalten fliegt eine zweite Geruch (CS) ohne elektrischen Schlag. Fliegen werden dann für 90 Sekunden, wonach sie für ihre Wahl zwischen CS und CS + getestet ruhen. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig3highres.jpg" width="400" /> Abbildung 3. Ein Vertreter Graph, der Dummkopf und Wildtyp Lernen in der Erwachsenen Drosophila. </strong&gt; WT und Narren Fliegen wurden folgende einer Sitzung der Ausbildung geprüft. Narren Fliegen zeigen eine Reduktion in Learning im Vergleich zum WT (n = 10).

Die Methode, die erwachsenen Drosophila Assoziativspeicher messen beschrieben. Der Test basiert auf der Fähigkeit der Fliege, einen Geruch mit einem negativen Verstärker (elektrischer Schlag) vorgestellt verbinden und dann erinnern diese Informationen zu einem späteren Zeitpunkt, so dass Speicher gemessen werden kann.

Drosophila Erwachsene olfaktorischen Schock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, assoziatives Gedächtnis mithilfe des olfaktorischen Schock-Assays an erwachsenen Drosophila zu messen. Zunächst werden die Fliegen unter Kohlendioxid-Anästhesie gesammelt. Im zweiten Schritt werden die Fliegen gleichzeitig einem elektrischen Schlag und einem ersten Geruch A im Team A ausgesetzt. Anschließend werden die Fliegen einem zweiten Geruch B ohne Schlag ausgesetzt. Schließlich werden die Fliegen an den Entscheidungspunkt im Team a gebracht, wo sie nach zwei Minuten Verteilungszeit gleichzeitig beiden Gerüchen A und B ausgesetzt werden. Die Fliegen, die Geruch A wählten, und jene, die Geruch B wählten, werden getrennt gesammelt und unter Kohlendioxid gezählt. Dies ermöglicht die Berechnung des Leistungsindex für jeden Geruch. Der endgültige PI wird durch Mittelung des PI aus zwei separaten Experimenten erhalten, von denen eines mit der Kombination von Geruch A und Reizstrom und das zweite mit der Kombination von Geruch B und Reizstrom durchgeführt wird.Diese Methode kann Einblicke in die Wirkung des inneren Zustands des Tieres und des Gedächtnisses geben. Indem beispielsweise das Alter, die Ernährung und der Schlaf variiert werden, kann sie zudem auf andere Systeme angewendet werden. So ist sie vergleichbar mit an Nagetieren oder Fabrik-vermittelten Angstkonditionierungstests, wobei die Gene und Mechanismen des Lernens zwischen Insekten und Säugetieren hochgradig konserviert sind.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das Vorbereiten der Fliegen für den Versuch sowie das Ein- und Ausbringen der Fliegen in bzw. aus den Teammates schwierig zu erlernen ist und allein anhand eines schriftlichen Protokolls nur schwer nachvollziehbar. Zunächst werden die Fliegen ein bis zwei Tage vor dem Experiment auf einer Standardkost unter einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus bei 25 °C gezüchtet. Die Fliegen werden anschließend mit Kohlendioxid betäubt und in vier Gruppen zu je 25 Stück aufgeteilt. Die Fliegen werden über Nacht in Futtergefäßen ohne Hefe bei 25 °C und 70 % Luftfeuchtigkeit in einem klimatisch kontrollierten Raum unter einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus aufbewahrt.Bereiten Sie als Nächstes maßgefertigte Perspex-Team-MAs vor und überprüfen Sie regelmäßig die Tubenverbindung, um sicherzustellen, dass während des Experiments eine luftdichte Abdichtung gewährleistet ist. Platzieren Sie individuell angefertigte Kupfergitter in die Trainingsrohre. Reinigen Sie die Gitter regelmäßig und ersetzen Sie sie, falls sie oxidiert werden. Verwenden Sie Krokodilklemmen, um die Kupfergitter an Drähten zu befestigen, die zu einer Schaltbox führen, die mit einem elektrischen Stimulator verbunden ist.Danach ein Voltmeter anbringen, um sicherzustellen, dass die Apparatur den erforderlichen Schock liefert. Anschließend das Labyrinth mit G-Klemmen festhalten. Um Luftlecks zu vermeiden, das T-Labyrinth mit einem Schlauch verbinden, der zu einer Luftpumpe führt, sodass Gerüche über die Fliegen gezogen und aus dem System abgeführt werden können.Halten Sie eine milde Luftströmung mit zwei Litern pro Minute aufrecht, verdünnen Sie anschließend vier Methylcycloethanol oder MCH im Verhältnis 1:67 und drei Octanol oder OCT im Verhältnis 1:100 in Mineralöl. Geben Sie danach 30 Mikroliter des verdünnten Geruchs in die Geruchskammer. Bereiten Sie eine speziell angefertigte Geruchskammer vor und bedecken Sie einen Geruchsblock mit einem Plastikrohr, das eine perforierte Oberseite aufweist.Platzieren Sie die speziell angefertigte Duftkammer in den Duftblock. Dieser Mechanismus ermöglicht es, dass Luft über den Duft in der Kammer geleitet wird, wodurch die Fliegen einer Duftfahne ausgesetzt sind. Führen Sie alle olfaktorischen Konditionierungsexperimente an erwachsenen Fliegen unter schwachem rotem Licht durch, das es dem Forscher erlaubt zu sehen, die Fliege jedoch am Sehen hindert und sicherstellt, dass die Fliegen sich auf alle olfaktorischen Reize statt auf visuelle Reize konzentrieren.Als Nächstes bringen Sie die Fliegen in die mit den TMAs verbundene Trainingsröhre und lassen Sie sich 90 Sekunden lang an die Röhre und die Luftström游戏副本Im Anschluss an den Schock folgt eine Ruhephase von 32 Sekunden. Geben Sie den zweiten Geruch (OCT) 60 Sekunden lang ohne Schock präsentieren. Im Anschluss an den Schock folgt eine Ruhephase von 32 Sekunden.Drehen Sie dann die Teammates auf die Seite und klopfen Sie vorsichtig den Boden auf einer Maus-Matte an, um die Fliegen aus der Trainingskammer in die zentrale Kammer zu befördern. Nachdem die Fliegen 90 Sekunden lang in der zentralen Kammer gehalten wurden, setzen Sie die Wahlröhren an die Unterseite der Apparatur, um das Team A zur Messung des Lernverhaltens zu bilden. Bringen Sie die Fliegen zum Entscheidungspunkt der Teammates und setzen Sie sie gleichzeitig beiden Gerüchen für 120 Sekunden aus.Fangen Sie die Fliegen in den Wahlröhren ein, indem Sie die zentrale Kammer nach oben schieben. Sammeln Sie anschließend die Fliegen aus dem zentralen Fach und aus jedem Arm der Teamkammern getrennt in verschiedene Nährstoffgefäße. Kennzeichnen Sie die Gefäße deutlich mit Angaben dazu, um welche Fliegen es sich handelt und welche Geruchswahl sie getroffen haben, und zählen Sie die Fliegen anschließend, um das Gedächtnis zu messen.Sammeln Sie die Fliegen nach dem Training und überführen Sie sie von den Teamkollegen in Nahrungsröhrchen ohne Hefe. Lagern Sie die Fliegen im Dunkeln bei 25 Grad Celsius und 70 % Luftfeuchtigkeit, wie in der begleitenden Textanleitung beschrieben. Führen Sie die Fliegen anschließend erneut dem Team aze zu.Für das Langzeitgedächtnis. Verwenden Sie ein speziell angefertigtes Labyrinth, das es ermöglicht, mehrere Gruppen von Fliegen gleichzeitig zu trainieren. Führen Sie fünf Trainingszyklen durch.Die Fliegen bis zur Untersuchung bei 18 Grad Celsius und 70 % Luftfeuchtigkeit im Dunkeln aufbewahren. Vor der Untersuchung die Fliegen auf 25 Grad Celsius überführen und mindestens eine Stunde lang akklimatisieren lassen.Langzeitgedächtnis bewerten. 24 Stunden nach der Schulung. Nach den Verhaltensversuchen die Duftgefäße mit heißem Wasser und geruchlosem Reinigungsmittel reinigen.Nach dem Trocknen 10 µL Sigma-Beschichtung auf die Geruchscups auftragen. Anschließend die Geruchscups in einem Mikrowellenofen erhitzen, um die Sigma-Beschichtung zu verfestigen. Führen Sie die Geruchsschärfeprüfung durch, indem Sie nach 90 Sekunden 100 Fliegen in das Team aze einführen, die Fliegen danach zum Entscheidungspunkt bringen und ihnen zwei Minuten Zeit geben, um zwischen reinen Gerüchen und Luft zu wählen.Danach die Fliegen sammeln und zählen. Für die Schockreaktivität: Die Fliegen in die Schockkammer bringen.Nach 90 Sekunden Ruhezeit einen 60 Volt Gleichstrom-Schock verabreichen. Einige Fliegen fliegen in ein ähnliches Gefäß ohne Stromschlag davon. Den Fliegen zwei Minuten Zeit geben, um sich zu entscheiden.Sammeln und zählen Sie anschließend die Fliegen, die dem Schohröhrchen entkommen sind, um Lerneffekte aufzuklären. Eine Reihe von Experimenten wurde mit adulten Wildtyp-Fliegen des Canton s und mit adulten DS-Mutant-Fliegen zur Untersuchung des Lernverhaltens durchgeführt. DS-Mutant-Fliegen zeigen eine verminderte Lernfähigkeit im Vergleich zu Wildtyp-Fliegen.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, genau im Auge zu behalten, welche Fliegen welche sind und was mit ihnen bereits durchgeführt wurde. Beachten Sie, dass Fliegen leicht gestresst werden können, während sie präpariert, trainiert und getestet werden. Stellen Sie sicher, dass Sie den Stress minimieren und dabei konsistent vorgehen.Vergessen Sie nicht, dass die Joslin-Erträge tagtägliche Schwankungen aufweisen können. Treffen Sie daher die Vorsichtsmaßnahme, Ihre Kontroll- und Versuchsdurchführungen ungefähr zur gleichen Tageszeit und unter denselben Bedingungen durchzuführen. Wenn Ihre Kontrollen nicht mehr lernen, versuchen Sie zu analysieren, was sich im Vergleich zu den Tagen, an denen das Experiment funktioniert hat, geändert hat.Nachdem Sie die Variable isoliert haben, versuchen Sie, bei der Durchführung des Gedächtnistests konsistenter mit dieser Variable umzugehen. In Zukunft viel Erfolg.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Drosophila-Larven sind in der Lage, um Geruch Reize mit geschmackliche Belohnung assoziieren. Hier beschreiben wir eine einfache Verhaltensänderungen Paradigma, das die Analyse von appetitive assoziative olfaktorische Lernen ermöglicht.

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Dieses Video beschreibt einen klassischen Konditionierungstest, der das Lernen und das Gedächtnis in Drosophila testet, die sogenannte Balzkonditionierung. Der Assay basiert auf der Verringerung der männlichen Balz nach einer Abstoßung durch ein nicht empfängliches präpaariges Weibchen. Das Beispielprotokoll zeigt einen Aufbau für das Verfahren, mit dem das Kurz- und Langzeitgedächtnis bewertet werden kann.

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Wir beschreiben hier eine Verhaltensaufbau- und Datenanalysemethode zur Untersuchung der Geruchsreaktionen von bis zu 100 Essigfliegen (Drosophila melanogaster). Dieses System kann mit einzelnen oder mehreren olfaktorischen Reizen verwendet werden und kann für die optogenetische Aktivierung oder Stilllegung neuronaler Untergruppen angepasst werden.

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Geschmack ist ein wichtiger sensorischer Prozess, der die Anziehungskraft auf nützliche Substanzen und die Vermeidung von giftigen Substanzen erleichtert.  Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen Ingestion-Assay zur Bestimmung der gustatorischen Präferenz von Drosophila für eine gegebene chemische Verbindung.

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Dieses Protokoll beschreibt eine Drosophila Lern-und Gedächtnis-Assay namens Balz Konditionierung. Dieser klassische Assay basiert auf einer Verringerung des männlichen Balzverhaltens nach sexueller Ablehnung durch eine nicht-rezeptive vorbereitete Frau. Diese natürliche Form der Verhaltens-Plastizität kann verwendet werden, um Lernen, Kurzzeitgedächtnis und Langzeitgedächtnis zu testen.

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem vor- und/oder postsynaptisches Kalzium im Kontext des Drosophila-Lernens und -Gedächtnisses visualisiert werden kann. In vivo Kalzium-Bildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren wird mit einem klassischen olfaktorischen Konditionierungsparadigma kombiniert, so dass die synaptische Plastizität, die dieser Art des assoziativen Lernens zugrunde liegt, bestimmt werden kann.

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Diese Arbeit beschreibt ein einfaches Verhaltensparadigma, das die Analyse des aversiven assoziativen Lernens bei erwachsenen Fruchtfliegen ermöglicht. Die Methode basiert auf der Unterdrückung des angeborenen negativen Geotaxis-Verhaltens aufgrund der Assoziation zwischen einem bestimmten Umweltkontext und einem elektrischen Schlag.

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Drosophila Erwachsene olfaktorischen Schock Learning

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