Gene Trapping Mit Gal4 in Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mutierte Fische durch Genbrechende Transponierung auf Vektoren mit GAL vier, VP 16 als primärem Genfallenreporter zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Genfallenvektor zusammen mit zwei großen Transponierungen in Zebrafischembryonen injiziert wird. Injizierte Embryonen werden drei Tage nach der Befruchtung auf GFP-Fluoreszenz untersucht, und etwa 30% der hellsten Embryonen werden ausgewählt, um den F-Null-Pool zu etablieren.

Als nächstes werden die F-Null-Fische mit der U-A-S-M-R-F-P-Testerlinie gekreuzt, um nach Keimbahnübertragungen von Genfallenereignissen zu suchen. Der letzte Schritt besteht darin, die F1 zu durchkreuzen, um die F-Zwei-Generation zu etablieren und Embryonen für die molekulare Charakterisierung von Genfallenereignissen durch inverse PCR und Fünf-Prime-Rasse zu erzeugen. Letztendlich sollte etwa einer von 10 gescreenten F-Null-Fischen Nachkommen von Genfallen produzieren.

Genbrechende Transpos wurden so konzipiert, dass sie bei der Integration in Eingänge von proteinkodierenden Genen keine Mutationen erzeugen. Unsere GBT-Vektoren verwenden G vier P 16 als primären Genfallen-Reporter. Diese Modifikation erhöht die Sensitivität für Gene, die in niedrigen Konzentrationen exprimiert werden, und ermöglicht es uns, Genfallenmutanten ohne Übervermeidung von Phänotypen als G-4-Treiber für die gewebespezifische Expression anderer Transgene zu verwenden.

Wir glauben, dass der Hauptengpass unserer Methode darin besteht, ausreichend hohe Raten der Gen-Trapp-Integration in die Keimbahn von F-Null-Fischen zu erreichen. In dieser Demonstration werden wir mehrere kritische Schritte behandeln: DNA-Vorbereitung, MIKROINJEKTION und F-Null-Screening. Der GBTB-Ein-Gen-Fallen-Vektor verwendet GAL vier VP 16 als primären Genfallen-Reporter.

Minimal hohe zwei Transponierungen an den Enden werden für die Integration von Genfallen verwendet. Genfallenereignisse werden direkt von einem EGFP-Reporter unter der Kontrolle von 14 X GAL vier UAS detektiert. Die gesamte Genfallenkassette wird von P-Stellen mit direkten Sperren flankiert.

Dies macht Genfallenereignisse durch die Expression von Cree-Kämmen reversibel, um den Nachweis eines Kausalitätszusammenhangs zwischen einer spezifischen Genfallenintegration und einem beobachteten Phänotyp zu erbringen. Darüber hinaus wird die U-A-S-E-G-F-P-Kassette von direkten FRT-Stellen flankiert. Die Injektion von Flip-Combs-mRNA führt zur Exzision der U-A-S-E-G-F-P-Kassette, wodurch die Genfallenmutation nicht durch EGFP-Fluoreszenz markiert wird und ihre Verwendung in transgenen Linien ermöglicht wird, die bestimmte Gewebe oder Entwicklungsereignisse durch GFP-Fluoreszenz vor der Mikroinjektion markieren.

Bereiten Sie die Transponierung auf DNA und transponierte mRNA vor. Bereiten Sie die DNA des GBTB-Ein-Genfallen-Vektors vor. Bei Verwendung eines Standard-Mini-Vorbereitungskits und unter Befolgung des Herstellerprotokolls ist es wichtig, den PB-Waschschritt in die Vorbereitung der DNA einzubeziehen.

Andernfalls wird die Mini-Prep-DNA durch RNAs kontaminiert, A führt zu einer Degradation der transponierten Mr.NA, verdünnen Sie die DNA in RNAs freiem Wasser auf 10 Nanogramm pro Mikroliter. Um die beiden transponierten mRNA vorzubereiten, linearisierte sie zunächst PT drei, TS, T zwei mit xbo eins. Als nächstes transkribieren Sie die linearisierte DNA mit einem M Message Machine T drei In-vitro-Transkriptionskit mit einer Modifikation.

Fügen Sie 0,5 Mikroliter Rippen-Lock-RNAs-Inhibitor nach dem Behandlungsschritt der DNA hinzu, reinigen Sie die mRNA mit einem Standardkit und beurteilen Sie die Qualität der in vitro transkribierten mRNA durch Agros-Gelelektrophorese. Verdünnen Sie die mRNA in RNAs freiem Wasser auf 40 Nanogramm pro Mikroliter und lagern Sie sie als zwei Mikroliter-Aliquoten bei minus 80 Grad Celsius kurz vor der Mikroinjektion. Bereiten Sie die Injektionsmischung vor, indem Sie acht Mikroliter verdünnte Transponierung auf DNA zu einem Aliquot von zwei Mikrolitern transponierter mRNA hinzufügen.

Injizieren Sie drei Nanoliter D-N-A-R-N-A-Gemisch in das Eigelb von Zebrafischembryonen mit Standard-Mikroinjektionstechniken, die auf die Dotter-Blasphemier-Grenzfläche abzielen. Nach der Injektion werden fünf Mikroliter übrig gebliebene Injektionslösung zur Qualitätskontrolle auf ein 1%aros-Gel gegeben, um sicherzustellen, dass die transponierte mRNA etwa sechs bis acht Stunden nach der Injektion nicht abgebaut wurde. Entfernen Sie unbefruchtete und tote Embryonen und verteilen Sie die Embryonen auf 60 bis 80 pro 100-Millimeter-Petrischale. Abnormale und tote Embryonen werden einen Tag nach der Befruchtung, zwei Tage nach der Befruchtung und drei Tage nach der Befruchtung drei Tage nach der Befruchtung unter einem Stereomikroskop mit Fluoreszenz oder einem aufrechten Mikroskop entfernt.

Untersuchen Sie die Embryonen und entfernen Sie alle abnormalen Embryonen. Untersuchen Sie die verbleibenden Embryonen ohne offensichtliche Defekte. Für die GFP-Fluoreszenz wählen Sie die hellsten F-Null-Embryonen aus und ziehen sie mit den Standardverfahren zur Aufzucht von Zebrafischen in diesem Labor auf.

GBTs werden in der Regel in Linien mit Wildtyp- oder Leoparden-Pigmentmustern injiziert. Es ist davon auszugehen, dass 20 bis 30 % der für die Aufzucht ausgewählten injizierten Embryonen bis ins Erwachsenenalter überleben. Die Integration des GBTB-Ein-Gen-Trap-Vektors kann durch zwei verschiedene Mechanismen zur EGFP-Expression führen.

Das erste ist ein echtes Genfallen-Ereignis. Der Vektor integriert in ein Gen ein Fusionstranskript zwischen den fünf Primzahlen dieses endogenen Gentranskripts und dem GAL vier VP 16 wird hergestellt und in ein Fusionsprotein übersetzt, das den Endterminus des Proteins enthält und von dem insertierten mutierten Gen und GAL vier, VP 16 umhüllt ist. Dieses Fusionsprotein bindet an die 14 XUAS und aktiviert die Transkription von EGFP.

Das zweite, weniger wünschenswerte Ereignis ist eine Enhancer-Falle. Der Minimalpromotor vor EGFP fällt unter die Kontrolle eines Enhancers in der Nähe der Integrationsstelle, der in Abwesenheit von GAL vier, VP 16, zur Produktion von EGFP führt. Um zwischen diesen beiden Ereignisklassen zu unterscheiden, wurde eine transgene Linie mit 14 X-U-A-S-M-R-F-P hergestellt, die durch linsenspezifisches gammakristallines GFP markiert ist.

Genfallenereignisse werden durch Kreuzung von GBT-injizierten Fischen mit homozygoten U-A-S-M-R-F-P-Fischen und durch Screening auf Koexpression von GFP und RFP verifiziert, was nur möglich ist, wenn GAL vier, VP 16 gebildet wird und U-A-S-M-R-R-F-P in trans aktiviert, um das Verfahren zum Screening von F-Null-Fischen zu beginnen, die sich mit homozygoten U-A-S-M-R-R-F-P-Fischen kreuzen. Da die GBT-injizierten Fische Wildtyp- oder Leoparden-Pigmentmuster aufweisen und die homozygote U-A-S-M-R-F-P-Linie auf einem Messinghintergrund ist, können F-Null-Fische leicht von den U-A-S-M-R-F-P-Fischen unterschieden werden, wodurch die Notwendigkeit entfällt, aufzuzeichnen, ob es sich bei der untersuchten F-Null um ein Männchen oder ein Weibchen handelte, sowie um mögliche Fehler, die sich aus Fehlern bei der Aufzeichnung und/oder Bestimmung des Geschlechts jedes Fisches ergeben. Am nächsten Tag.

Setze den Messingfisch U-A-S-M-R-F-P in sein Aquarium zurück. Setzen Sie die F-Null-Fische, die Embryonen abgegeben haben, in einzelne statische Tanks ein, während die Embryonen für das Screening entnommen werden, reinigen und am Nachmittag des Tages Null in neue Petrischalen übertragen werden. Screenen Sie die Embryonen einen Tag nach der Befruchtung und drei Tage nach der Befruchtung auf GFP- und RFP-Fluoreszenz.

Entnehmen Sie Embryonen, die sowohl für GFP als auch für RFP positiv sind, und sortieren Sie sie nach G-F-P-R-F-P-Expressionsmuster. Wenn mehr als ein Muster in einer Kupplung beobachtet wird, und heben Sie sie an, um die F1-Generation zu etablieren. Beachten Sie, dass 3D-PF-Embryonen, die positiv für GFP, aber nicht für RFP sind, nicht entnommen werden, da sie Enhancer-Trap-Ereignisse darstellen.

Kreuzen Sie die F-Null-Fische, die G-F-P-R-F-P-positive Nachkommen hervorgebracht haben, erneut, um eine zweite Charge positiver Nachkommen zu erhalten. Die F1-Fische werden gescreent, um zwei Familien zu bilden, das Expressionsmuster der Gentrapps zu dokumentieren und Embryonenchargen für die molekulare Identifizierung von Genfallen-Loci einzufrieren. Erste Kreuzung einzelner F1-Fische mit den homozygoten U-A-S-M-R-F-P-Fischen am folgenden Tag. Setzen Sie die F1-Fische, die Embryonen abgegeben haben, in einzelne statische Tanks ein, während die Embryonen einen Tag nach der Befruchtung für das Screening entnommen werden.

Die RFP-Markierung ist möglicherweise noch nicht erfolgt, also screenen Sie die Embryonen auf GFP-Fluoreszenz und ziehen Sie die GFP-positiven Embryonen drei Tage nach der Befruchtung heraus, screenen Sie sowohl auf GFP- als auch auf RFP-Fluoreszenz und ziehen Sie die doppelt positiven Embryonen heraus. Fotografieren Sie dann die Embryonen, die sowohl GFP- als auch RFP-positiv sind, fünf Tage nach der Befruchtung, frieren Sie Chargen von 20 G-F-P-R-F-F-P-positiven und 20 G-F-P-R-R-F-P-negativen Embryonen ein, um die insertionsmutierten Gene durch inverse PCR und fünf Hauptrassen zu identifizieren. Ziehen Sie die verbleibenden G-F-P-R-F-P-positiven Embryonen auf, um die zweite Generation in einer erfolgreichen Injektion zu etablieren.

Mindestens 80% der Embryonen, die mit dem Genfallen-DNA-Mix injiziert wurden, weisen einen gewissen Grad an GFP-Fluoreszenz auf. Eine niedrige GFP-Expression deutet entweder auf eine erfolglose Injektion oder eine Degradation der transponierten RNA aufgrund einer RNA-Kontamination hin. Wenn die hellsten GFP-positiven Embryonen ausgewählt werden, um den F-Null-Pool zu etablieren, wird etwa einer von 10 gescreenten F-Null-Fischen Genfallen-Nachkommen unter den F-Null-Fischen hervorbringen, von denen die Genfallenereignisse wiederhergestellt werden.

Die meisten übertragen ein einzelnes Genfallenereignis zusätzlich zu mehreren nicht exprimierenden Transponierungs-On-Integrationen. Da die gesamte Genfallenkassette von P-Stellen mit direkten Sperren flankiert wird, sind alle Genfallenmutationen, die in diesem Diagramm mit blauen Kästchen dargestellt sind, die Exons des mutierten Gens darstellen, durch die Expression von CRE-Kämmen reversibel. Diese Bilder zeigen die Co-Expression von GFP und RFP im Nervensystem der NSF TP Six-Gen-Trap-Line-Injektion von Cree-RNA in N SF TP six-Embryonen führt zum Verlust der GFP- und RFP-Expression.

Es ist zu beachten, dass es erwartungsgemäß keine Verringerung der GFP-Expression in der Linse gibt. Die meisten der hier beschriebenen Verfahren sind sowohl auf andere Genfallen-Screens als auch auf reguläre Transgenese-Experimente mit TOL two und anderen Transposons anwendbar. Mit dem hier beschriebenen Genfallen-Verfahren. Das Einrichten von 20 bis 30 F Null-Out-Kreuzungen pro Woche sollte zur Wiederherstellung einer Genfalle pro Woche führen.

Das Verfahren kann jedoch leicht skaliert werden.