Collection, Isolierung und Anreicherung von natürlich vorkommenden Magnetotaktische Bakterien aus der Umwelt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, magnetotaktische Bakterien aus einer Süßwasserumgebung zu isolieren. Dazu werden zunächst Wassersedimentproben vom Rand eines Flusses oder Sees entnommen. Der zweite Schritt besteht darin, die in der Umweltprobe enthaltenen magnetotaktischen Bakterien mit einem Stabmagneten zu isolieren.

Als nächstes werden die magnetotaktischen Bakterien mit einer Glaskapillarrennbahn und einem Magneten angereichert. Schließlich werden die magnetotaktischen Bakterien mittels optischer Mikroskopie charakterisiert. Letztendlich wird die Transmissionselektronenmikroskopie verwendet, um die Größe und Form der Bakterien und ihrer magnetithaltigen Magnetozonen darzustellen.

Diese Methode hilft uns, Schlüsselfragen der Umweltmikrobiologie zu verstehen, z. B. wie sich Magnetomechanik auf der Erde entwickelt hat und wie magnetotaktische Bakterien nanometergroße Magnete synthetisiert haben. Heute wird Zachary a Stryker das Verfahren vorführen. Zachary ist Doktorand in meinem Labor.

Er arbeitet mit meinem Bruder und mir hier an der Ohio State University. Wenn Sie sich für einen Süßwasserstandort entscheiden, um Magneto-Taktik-Bakterien oder MTB zu sammeln, ist es oft am besten, mit einem Teich oder einem langsam fließenden Bach zu beginnen, der eine weiche, schlammige Sedimentschicht aufweist. In dieser Demonstration haben wir eine Probe am Rande des Oland Tangy River auf dem Campus der Ohio State University in Columbus, Ohio, entnommen.

Suchen Sie sich einen Ort, an dem die Wassertiefe zwischen 10 und 100 Zentimetern liegt, und füllen Sie den Behälter mit einem durchsichtigen Behälter mit Schraubverschluss mit der obersten Sedimentschicht und den restlichen Raum mit Wasser, verschließen Sie den Behälter im Labor unter Wasser, lösen Sie den Deckel und lassen Sie ihn den Behälter bedecken, um die Verdunstung zu reduzieren, und lagern Sie ihn mehrere Stunden bis mehrere Tage im Dunkeln, damit das Sediment eindringen kann und Partikel finden, die sich absetzen können. Um Rennstrecken zu bauen, um das MTB zu bereichern. Beginnen Sie damit, mit einem Diamantstift oder einer Diamantfeile die Oberseite einer 5,75-Zoll-Glaspastierpipette abzuschneiden, sodass genügend Platz für ein bis zwei Milliliter Wasser bleibt.

Verwenden Sie anschließend einen Brenner, um den Tip-Autoklaven abzudichten. Mehrere Hebeschienen zusammen mit Baumwoll- und langen Metallnadeln. Wenn Sie bereit sind, MTB zu isolieren, platzieren Sie Magnete an den Seiten des Kunststoffbehälters, etwa einen Zentimeter über der Schnittstelle zwischen Sedimentwasser und Süd- und Nordpol auf gegenüberliegenden Seiten des Behälters.

Achten Sie darauf, das Sediment nicht zu stören. Warten Sie 30 Minuten bis mehrere Stunden, bis die Bakterien zum Magneten geschwommen sind. Verwenden Sie anschließend eine Spritze, um Flüssigkeit aus dem Probenbehälter in der Nähe der Grenzfläche des Sedimentwassers zu entfernen.

Befestigen Sie einen Filter an der Spritze und eine Metallnadel am Filter und stellen Sie dann sicher, dass sich keine Blasen in der Kapillare befinden. Verwenden Sie die Nadel, um das gefilterte Probenwasser mit steriler Watte und der Metallnadel auf eine Autoklaven-Rennstrecke zu geben. Verstopfen Sie die Rennstrecke, indem Sie die Watte in der Kapillare bis zu 0,5 bis einen Zentimeter vom versiegelten Ende weg schieben.

Entfernen Sie mit einer sterilen Pipette die Magneto-Taktik-Bakterien aus dem Behälter, wo sie sich in der Nähe des Südpols des Magneten befinden, und geben Sie das wasserhaltige MTB in das offene Ende der Rennstrecke. Sobald die Rennstrecke mit Probenflüssigkeit gefüllt ist, legen Sie sie auf die Seite auf eine horizontale Fläche und platzieren Sie den Südpol eines Stabmagneten neben der Dichtungsspitze der Rennstrecke. Warten Sie fünf bis 30 Minuten, bis das MTB durch die Watte wandert.

Mache mit einem Diamantmesser vorsichtig einen kleinen Kratzer in der Nähe des Wattestopfens und breche das Ende der Rennstrecke ab. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer schmalen Nadel, um die mit MTB angereicherte Flüssigkeit von der Spitze der Rennstrecke zu entfernen. Um das MTB lichtmikroskopisch zu betrachten, geben Sie einen Tropfen der angereicherten Probe auf ein Deckglas.

Legen Sie das Deckglas auf einen O-Ring, der auf einem Glasobjektträger ruht. Dies wird als hängender Tropfen bezeichnet. Der O-Ring sollte einen etwas kleineren Durchmesser als der Deckglas haben.

Legen Sie dann den Objektträger auf einen Lichtmikroskoptisch und fokussieren Sie auf eine Kante des Tropfens. Um das MTB dann auf eine Seite des Drops zu ziehen, platzieren Sie das südliche Ende eines Stabmagneten innerhalb weniger Minuten in der Nähe dieser Seite, viele MTBs sollten sich am Rand des Drops befinden. Um das MTB mit TEM zu beobachten, legen Sie ein var-stabilisiertes und kohlenstoffbeschichtetes 200-Mesh-Kupfergitter auf den Tropfen der angereicherten Bakterien und lassen Sie die Probe 10 Minuten lang absetzen.

Nachdem Sie die Probe 30 Sekunden lang mit einem Tropfen Wasser gewaschen haben, legen Sie sie 30 Sekunden bis fünf Minuten lang auf einen Tropfen 2%iges Urinalacetat und trocknen Sie die Proben dann mit einem Stück Filterpapier vollständig und analysieren Sie sie mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie bei 200 Kilovolt. Hier ist ein Transmissionselektronenmikroskop-Bild eines einzelnen magnetotaktischen Bakteriums zu sehen, das aus einer Sedimentprobe aus der Umwelt angereichert wurde. Die Spirale und die Morphologie der Zell- und Magnetozonen sind zusammen mit einem einzelnen Flegel deutlich sichtbar.

Sobald die magnetotaktischen Bakterien aus der Umwelt gesammelt wurden, dauert die magnetische Trenntechnik etwa drei Stunden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die 16 s ribosomale RNA-Analyse durchgeführt werden, die zusätzliche Fragen beantworten wird, wie z.B. welche phylogenetische Beziehung die neu entdeckten magnetotaktischen Bakterien zu anderen, zu anderen Mikroorganismen ist.