Intact Histologische Charakterisierung von Brain-implantierten Microdevices und des umgebenden Gewebes

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Grenzfläche des intakten Hirngewebes um chronisch implantierte Mikrogeräte im Hirngewebe von Nagetieren abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst ein schnellzelliges Silikonelastomer und ein zweiteiliges Dentalacryl verwendet werden, um die Kraniotomie abzudecken und eine Schädelkappe um das implantierte Gerät des Gehirns zu bilden. Nach der Perfusion des Tieres mit Fixiermittel und der postmortalen Gewebeaufbereitung wird der vom Gehirn implantierte Teil des Geräts von der Kopfkappe getrennt, indem das Zahnacryl weggebrannt und die Schnellzelle durchtrennt wird.

Als nächstes wird das Gehirn entfernt und mit einem Viom geschnitten, um das Implantat in einem Gewebeschnitt zu erfassen. Der letzte Schritt besteht darin, das Gewebe für die Fluoreszenzbildgebung vorzubereiten, indem es gewaschen, markiert und dann den Gewebeschnitt in optischer Reinigungslösung gereinigt wird. Letztendlich wird die konfokale Mikroskopie verwendet, um die intakte biologische Reaktion, die das eindringende Hirnimplantat im umgebenden Gewebe hervorruft, auf subzellulärer Ebene zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Erklären, dem Gerät, besteht darin, dass die Technik vermeidet, das Gewebe zu stören, das das implantierte Gerät umgibt und an ihm haftet, so dass das Grenzflächengewebe intakt untersucht werden kann. Diese Methode beruht auf fortschrittlichen Immunhistochemie- und Mikroskopietechniken und führt zu konfokalen Mikroskopiedaten, die die Region um ein hirnimplantiertes Gerät detailliert beschreiben. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Neuroprothetik zu beantworten, wie z. B. das Ausmaß, in dem sich der lokale Zelltod, die Bildung von Glianarben und die Reorganisation von Blutgefäßen wirklich auf die Lebensdauer von im Gehirn implantierten Mikroelektroden auswirken.

Diese Methode kann jedoch Einblicke in die chronische neuronale Schnittstelle von hirnimplantierten Mikroelektrodenarrays geben. Die Techniken, die bei dieser Methode zum Einsatz kommen, können auch auf andere Bereiche der neurowissenschaftlichen Forschung angewendet werden, einschließlich implantierter Kanülen oder Glasfasern. Beginnen Sie den Eingriff in einem Abzug, indem Sie die Haut und anderes Gewebe um die Acrylschädelkappe herum vorsichtig entfernen, indem Sie eine Pinzette und eine kleine Schere verwenden, während Sie die hitzeunempfindlichen Handschuhe tragen. Verwenden Sie ein Löseeisen, um ein Fenster in der Delle des Acryls herzustellen und legen Sie einen Bereich mit der darunter liegenden Schnellversiegelung frei.

Das Gerät sollte sichtbar sein, wenn es von der durchsichtigen Schnelldichtung umschlossen ist. Schneiden Sie anschließend unter einem Operationsmikroskop mit einer gebogenen Mikroschere in das Silikonelastomer. Entfernen Sie dann kleine Stücke der Schnellversiegelung mit einer Pinzette und einer Mikroschere bis zu der Position, an der das Gerät in das Gehirn eintritt.

Schneiden Sie weiter entlang der Oberfläche der Kraniotomie, um die Gerätekomponenten, die an Polysilizium und den Schädel anhaften, von den im Gehirn implantierten Komponenten zu trennen. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die freiliegenden Gerätekomponenten durchschneiden. Vermeiden Sie es, die Implantate in das fixierte Gewebe zu schieben oder zu ziehen.

Entfernen Sie dann vorsichtig den Knochen um die Kopfkappe mit den rohen Tüchern. Trennen Sie das Gehirn mit dem implantierten Gerät mit einem Spatel vom Schädel. Legen Sie nun das Gehirn in eine mit HBHS gefüllte Petrischale aus Glas.

Verwenden Sie den Gehirnblock und das Rasierklingen, um das Gehirn zu durchtrennen und eine flache Ebene zu erzeugen, die dem Winkel der implantierten Geräte sehr nahe kommt. Drücken Sie danach zwei Rasierklingen durch das Gehirngewebe und legen Sie die flache Oberfläche frei, die auf dem Vibram montiert wird. Legen Sie als Nächstes etwas Eis unter die Vibram-Plattform.

Anschließend trocknest du die Tissue-Oberfläche kurz auf einem Papiertuch ab. Richten Sie danach die Probe so aus, dass die breiteste Abmessung parallel zur Bewegungsrichtung der Vibrationstonklinge verläuft, um zu vermeiden, dass die Klinge das Gewebe möglicherweise umwirft, und kleben Sie die flache Ebene sofort mit Sekundenkleber auf den Tisch. Nachdem der Kleber fixiert ist, wird ein gekühltes PBS in die Vibratoschale um das Gewebe herum gegeben.

Schneiden Sie nun die Gewebescheiben zwischen 250 und 500 Mikrometern mit der maximalen Vibrationsrate und einer langsamen Klingenprogressionsrate mit einem Klingenwinkel von 10 Grad aus der Horizontalen. Sammeln Sie dann die Scheiben vorsichtig mit einer Bürste und einem Schaufel und bewahren Sie ein HBHS in einer 24-Well-Platte bei vier Grad Celsius auf, während Sie die Scheiben sammeln, notieren Sie die Dicke und Position jeder Scheibe, wenn sie auf die 24-Well-Platte entfernt werden. Sobald das Insitu-Gerät sichtbar ist, entnehmen Sie eine etwa 500 Mikrometer dicke Gewebescheibe.

Um die Vorrichtung in einer einzigen Gewebescheibe zu erfassen, um einen dünneren Gewebeschnitt zu entnehmen, können 100-Mikron-Scheiben sorgfältig entnommen werden, um sich der Vorrichtung zu nähern. An diesem Punkt kann eine Scheibe mit einer Dicke von weniger als 500 Mikrometern mit dem Gerät im Inneren gesammelt werden. Beginnen Sie mit der Gewebeverarbeitung, indem Sie die Scheiben dreimal alle fünf Minuten pro Waschgang in HBHS waschen.

Dann inkubieren Sie sie 15 Minuten lang in Natrium-Borah-Hydrid. Drehen Sie die Scheibe auf jeder Seite der Scheibe langsam mit einem kleinen Pinsel und vermeiden Sie es, Bereiche um das implantierte Gerät herum zu berühren. Ein mit Edelstahl oder Teflon beschichteter Mikrolöffel kann auch zusammen mit dem kleinen Pinsel verwendet werden.

Waschen Sie die Scheiben nun dreimal à fünf Minuten pro Waschgang in Waschlösung bei Raumtemperatur. Blockieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in Waschlösung, während Sie die Scheiben wenden. Nach einer Stunde nach zwei Stunden inkubieren Sie die Scheiben in Primärantikörpern für etwa 48 Stunden bei vier Grad Celsius.

Führen Sie anschließend sechs schnelle dreiminütige Wäschen mit Waschlösung durch. Führen Sie dann sechs einstündige Wäschen in Waschlösung durch. Danach inkubieren Sie sie etwa 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius in Sekundärantikörpern.

Führen Sie auch hier sechs schnelle dreiminütige Wäschen durch, gefolgt von sechs einstündigen Wäschen in Waschlösung. Entfernen Sie anschließend die Waschlösung und fügen Sie die auf Glycerin basierende U2-Reinigungslösung hinzu. Den Teller mit Folie abdecken und bei vier Grad Celsius lagern.

Lassen Sie die dicken Scheiben etwa eine Woche lang oder sehr dicke Gewebeschnitte zwei bis drei Wochen lang bei vier Grad Celsius reinigen. Nach der Räumung montieren Sie die Gewebeschnitte auf Objektträger mit Reinigungslösung als Einbettmedium. Versiegeln Sie alle Objektträger mit klarem Nagellack und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius Lichtschutz mit Mikroskopobjektiven mit größerem Arbeitsabstand.

Beginnen Sie mit der Bildgebung mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop oder einem Zwei-Photonen-Mikroskop. Wir demonstrieren mit einer XS L SM seven 10 Carl Xi Send-Software und einem computergesteuerten XY-Translationstisch ein Bild Ein 3D-Panorama um ein Implantat zur Korrektur des Brechungsindex der Clearing-Lösung. In dieser Demonstration geben wir in der Leica Zen Mikroskopsoftware für die U2-Clearinglösung einen Brechungsindexwert von 1,4 ein.

Mit dieser Einstellung werden die Z-Schritt-Intervalle subtil angepasst, um eine Fehlanpassung des Brechungsindex im Gewebe in der Nähe des Geräts zu berücksichtigen. Bewerten Sie grob das geeignete Z-Achsen-Fenster und die Datenerfassungseinstellungen in der zdi-Dimension für jeden Fluoreszenzkanal mit geringer Laserleistung von etwa 0,5 bis 5 % und großen Z-Schrittgrößen. Verwenden Sie dann die Zen-Panorama-Software, um das Objektiv in der XY-Mitte des endgültigen Panoramas zu platzieren und die Anzahl der für die x- und y-Achse erforderlichen Sammelpositionen zu bestimmen.

Um den Interessenbereich abzudecken, bewerten Sie das Erfassungsfenster der Z-Achse neu, und schließen Sie es ab, indem Sie schnell den ersten und letzten Frame des Stapels überprüfen. Stellen Sie als Nächstes die Detektorempfindlichkeit und die Laserleistung manuell so ein, dass sie mit der zunehmenden Tiefe entsprechend ansteigen. Ziel ist es in der Regel, unabhängig von der Bildtiefe in den Gewebeschnitt ungefähr die gleiche Bildintensität beizubehalten und auch ein hohes Hintergrundrauschen zu vermeiden.

Erfassen Sie bei Bedarf jede Fluoreszenzbilddatenreihe, um überlappende Signale zu vermeiden, und führen Sie die Laserlinien nacheinander aus. Ändern Sie die Softwareeinstellungen, um die Daten oder die Transmissionsdaten zu erfassen, und verwenden Sie einen längeren, durchdringenderen Wellenlängenlaser, z. B. 6 33 Nanometer, um diese Kanäle zu erfassen. Bestimmen Sie dann die geeignete Laserleistung und ermitteln Sie eine Empfindlichkeit für die Reflexions- und Transmissionserfassung und wiederholen Sie die gleiche Sammelserie um das implantierte Gerät herum.

Exportieren Sie abschließend die Daten für die spätere Verarbeitung, Quantifizierung und Analyse. Die Bildgebung durch beide Seiten des Objektträgers kann es Ihnen ermöglichen, die Grenzfläche um ein Gerät herum zu beurteilen, wie hier gezeigt, wo Mikroglia entlang der Siliziumrückseite eines MEA auf der einen Seite und Mikroglia entlang der Elektrodenstellen und -spuren auf der anderen Seite sichtbar sind. Sobald das eingehängte Gewebe mit einem XY-Translationstisch abgebildet werden kann, können Übersichten über die fluoreszierenden Markierungen über die gesamte Gewebescheibe in der gewünschten Auflösung erstellt werden.

Hier wurden Zellkerne, die mit den Haken 3, 3, 3, 4, 2 gefärbt sind, und Monozyten, Mikroglia, die mit 3, 2, 9 markiert sind, gezeigt. Anti IBA one wurde gleichzeitig auf getrennten Kanälen abgebildet. Transmissionslicht und Reflexion wurden ebenfalls erfasst, um die Position des vierwöchigen Implantats in Bezug auf Haken und IVA One-Daten zu zeigen, die Überlagerung aller Kanäle, aber die Transmission ist hier dargestellt.

Eine detaillierte Untersuchung der morphologisch erhaltenen Gewebegrenzfläche um implantierte Mikrogeräte kann unter hoher Vergrößerung zur Analyse der lokalen Gewebereaktion durchgeführt werden, wobei der Reflexions- und Transmissionsgrad die Lokalisierung des Geräts ermöglicht, während fluoreszierende Antikörper oder chemische Markierungen eine detaillierte Abbildung von Gewebekomponenten entlang der intakten Gewebegrenzfläche ermöglichen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sich wirklich Zeit für die sorgfältige Trennung der implantierten Geräte durch die Kopfkappe zu nehmen und diesen Schritt bis zu 30 Minuten einzuplanen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gehirnschnitte mit implantierten Geräten sammelt und verarbeitet.

Sie sollten auch in der Lage sein, histologische Daten zu beschriften und zu sammeln, die die Neurobiologie rund um diese Geräte beschreiben.