Produktion von Disulfid-stabilisierte Transmembrane Peptid-Komplexe für Structural Studies

Dieses Protokoll erzeugt kovalent stabilisierte Komplexe von Transmembranpeptiden für Strukturstudien, die darauf abzielen, zu verstehen, wie Membranproteine über ihre in Lipide eingebetteten Domänen miteinander interagieren. Exprimieren Sie zunächst ein hist-markiertes Fusionsprotein, das die Transmembransequenz von Interesse in e coli enthält. Extrahieren Sie dann das Protein aus der Einschlusskörperfraktion mit Guine und Detergens mit einer Nickel-Affinitätsmatrix.

Das hist-markierte Fusionsprotein wird konzentriert und durch Disulfid mit der diametralen Form vernetzt, indem die Säule in einer Lösung mit Oxidationsmitteln gewaschen wird. Als nächstes eluieren Sie das vernetzte Fusionsprotein in Trifluoressigsäure und behandeln Sie es mit Cyanogenbromid, um den Fusionspartner freizusetzen, und fahren Sie fort, das vernetzte Peptidprodukt aus dem Verdauungsgemisch durch Umkehrphasen-HPLC zu isolieren. Letztendlich werden die Identität und Reinheit der Produkte durch SDB-Seiten- und Massenspektrometrie-Analysen überprüft.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass reine soziometrische Komplexe für Strukturstudien mit Techniken wie Lösungs- oder Festkörper-NMR hergestellt werden. Selbst wenn bekannt ist, dass zwei Transmembrandomänen interagieren, stehen Peptidlöslichkeit und Komplexbildung unter experimentellen Bedingungen oft im Widerspruch zueinander. Beginnend mit einem gut definierten kovalent stabilisierten Komplex kann das Spektrum der experimentellen Bedingungen, die für eine qualitativ hochwertige Datenerhebung getestet werden können, erheblich erweitert werden.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten beim Umgang mit diesen extrem hydrophoben Proteinfragmenten. Dieses Protokoll und die Ratschläge im begleitenden Manuskript sollen eine einfache Lösung für einige der häufigsten Herausforderungen im Vorhersage- und Reinigungsprozess bieten. Gaumen, eine Ein-Liter-Kultur von Bakterien, die die Kuttelpeptidfusion exprimieren und in 50 Millilitern Lysepuffer resuspendieren.

Führen Sie dann drei Beschallungszyklen bei maximaler Leistung für eine Minute durch und kühlen Sie sie fünf Minuten lang auf Eis ab. Das unlösliche Einschlusskörpermaterial durch Zentrifugation bei 20.000 g für 15 Minuten dekantieren und den Überstand beiseite stellen. Die Beschallungs- und Zentrifugationsschritte können wiederholt werden, wenn eine verbesserte Reinheit der IB-Fraktion erforderlich ist.

Reservieren Sie Proben des Pellets und des Überstandsmaterials für die SDB-Seitenanalyse, um die Reise zu bestätigen. Die Lokalisierung der TM-Fusion an den Einschlusskörpern löst nun die Einschlusskörperpellets in Perllösung mit 25 bis 50 Millilitern pro Liter Kultur auf. Verarbeitet mehrere Stunden bei Raumtemperatur schonend mischen und gelegentlich sonneneinstrahlen.

Als nächstes wird das Einschlusskörperlysat durch Zentrifugation bei 75.000 bis 100.000 G für eine Stunde gereinigt. Bei Raumtemperatur filtrieren Sie das Supernat durch eine 0,2-Mikron-Membran in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Kombinieren Sie das geklärte Einschlusskörperlysat mit einem Nickel-Affinitätsharz, das zu Guineenlösung äquilibriert wurde, um es zu binden.

Mischen Sie die Suspension vorsichtig über Nacht bei Raumtemperatur. Laden Sie die Einschlusskörper-Lysat-Nickelharz-Suspension in eine leere Schwerkraft-Strömungssäule mit poröser Bettstütze, bis das gesamte Volumen durchfließt. Sammeln Sie den Durchfluss, der möglicherweise noch ungebundenes Fusionsprotein enthält, und legen Sie ihn beiseite.

Waschen Sie dann das Nickelharz durch Schwerkraft. Strömung mit fünf Bettvolumina Harnstofflösung, die fünf Millimolar beam Mercaptoethanol enthält. Führen Sie für die dritte Wäsche eine zweite Wäsche ohne Strahl-Mercaptoethanol durch.

Verwenden Sie Harnstofflösung, die mit Kupfersulfat und oxidiertem Glutathion ergänzt ist. Dann den Säulenauslass schließen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um eine maximale Bildung von Disulfidbindungen zu ermöglichen. Waschen Sie die oxidierende Harnstofflösung mit 10 Bettvolumen Wasser aus.

Wenden Sie dann eine Vakuumleitung an, um das Säulenbett zu trocknen, und schließen Sie den Säulenauslass. Geben Sie nun in einer Chemikalienschutzhaube 1,5 Bettvolumen reine TFA, rühren Sie das Nickelharz mit einem kleinen Spatel um, um eine gleichmäßige Säureeinwirkung zu gewährleisten, und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Sammeln Sie das Säureeluat unter leichtem Druck mit einer komprimierten Luftlinie, falls erforderlich, um die gesamte Flüssigkeit herauszudrücken.

Wiederholen Sie den Säureverdünnungsschritt mit weiteren 1,5 Bettvolumina reinem TFA. Um die Proteinausbeute zu messen, verdünnen Sie das TFA-EIT in Trifluorethanol und messen Sie die Absorption bei 280 Nanometern gegen A-T-F-A-T-E. Verdünnen Sie die Säure elu auf 80 % TFA-Endkonzentration tropfenweise. Zugabe von Wasser unter schonendem Rühren.

Wenn du Formen ausfällst, füge eine kleine Menge TFA hinzu, bis die Lösung klarer ist. Korrigieren Sie dann mit Wasser auf 80 %. Reservieren Sie eine Probe von fünf Mikrolitern Vorverdauen für die SDS-Seitenanalyse und frieren Sie sie sofort in flüssigem Stickstoff ein.

Wiegen Sie anschließend Cyanogenbromidkristalle für etwa 0,2 Gramm pro Milliliter Probe. Achten Sie darauf, die giftige Chemikalie sicher zu wiegen. Geben Sie das Cyanogenbromid in einer Sicherheitshaube in die Probe und mischen Sie es vorsichtig, bis es sich vollständig aufgelöst hat.

Spülen Sie nun das Reaktionsgefäß mit einer Schutzgasdichtung und inkubieren Sie es drei bis vier Stunden lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt. Reservieren Sie eine Probe von fünf Mikrolitern nach dem Aufschluss für die SDS-Seitenanalyse, frieren Sie sie sofort in flüssigem Stickstoff ein und lyophilisieren Sie sie zusammen mit der Vorverdauprobe. Anschließend wird die Verdaureaktion auf eine Dialysekassette mit regenerierter Cellulose übertragen, was eine deutliche Volumenvergrößerung ermöglicht.

Dialysieren Sie die Probe über Nacht gegen vier Liter Wasser in der chemischen Haube. Am nächsten Morgen nehmen Sie die dialysierte Reaktionslösung mit suspendiertem Proteinniederschlag aus der Dialysekassette und überführen die Suspension in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Frieren Sie die Probe dann mehrere Tage lang ein und lyophilisieren Sie sie, um das Wasser und alle Spuren von Cyanogen, Bromid und TFA zu entfernen. Löse bis zu 100 Milligramm lyophilisierte Aufschlussprodukte in drei Milliliter reine Ameisensäure auf, indem du sie mischst, bis die Lösung vollständig geklärt ist.

Laden Sie die Probe auf eine präparative zoax SB 300 C3-Säule in einem Fluss von Lösungsmittel A unter Verwendung einer Fünf-Milliliter-Probenschleife. Anschließend werden die Aufschlussprodukte in einem Gradienten von Lösungsmittel B über mindestens fünf Säulenvolumina eluiert. Analysieren Sie die HPLC-Fraktionen anhand der SDS-Seite und der MALDI TOF-Massenspektrometrie, um die Spezies von Interesse zu identifizieren und die erwartete Massenlyophilisierung zu bestätigen.

Die HPLC-Fraktionen, die das vernetzte Peptidprodukt enthalten. Wenn das Produkt zu einem Film statt zu einem Pulver trocknet, kann es in einem kleinen Volumen HFIP wieder gelöst, in Flüssigkeit eingefroren und lyophilisiert werden. Auch hier ist das Ergebnis ein flauschiger weißer Zapfen, der leicht ausgekippt und gewogen werden kann. Eine DNA-Sequenz, die für die Transmembran und die markierenden Regionen des Immunrezeptor-Transmembran-Signalmoleküls kodiert.

DAP 12 wurde unter Verwendung von Hindi-3- und BAM H-Ein-Restriktionsstellen in den PMM-Peptidvektor kloniert. Das resultierende bakterielle Expressionskonstrukt produziert ein his tagged trip-Fusionsprotein mit einzigartigen internen Methionin- und Cystinresten für die Cyanogenbromid-Spaltung und oxidative Vernetzung. Das für Kuttelfusionen erreichte Expressionsniveau variiert je nach Aminosäuresequenz des angehängten Peptids.

Dieses Präparat ergab etwa 120 Milligramm reines intaktes Fusionsprotein aus einem Liter Kultur und vier Millilitern Nickelmatrix. Nach der Zelllyse wurde das Fusionsprotein an das Einschlusskörperpellet lokalisiert. Etwa 70 % der nickelgereinigten Kutteln DAP 12 TM-Fusion waren Disulfid, die mit der DME-Form vernetzt waren.

Obwohl die DAP 12 TM-Peptidprodukte in den gesamten CYANOGEN-Bromid-Aufschlussproben nicht ohne weiteres identifizierbar sind, deutet der Vergleich der intakten Fusions- und Trip-Fragment-Banden in der reduzierten Aufschlussprobe darauf hin, dass der Aufschluss der Fusion bei dieser typischen Trennung von Aufschlussprodukten zu etwa 60 % abgeschlossen war. Auf einer C3-Säule im präparativen Maßstab unter Verwendung der Umkehrphasen-HPLC wurden die gebundenen Produkte in einem zweistufigen Gradienten von Lösungsmittel B angedeutet. Das diss-sulfidvernetzte Peptidprodukt ist in der SDS-Seitenanalyse der wichtigsten HPLC-Fraktionen unter nicht reduzierenden und reduzierenden Bedingungen identifizierbar. Die Massenspektrometrie-Analyse von Maldi tof bestätigt die Identität des Deme-Peptids im vierten Peak mit dem Hauptprodukt bei 6729,2 Dalton.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Cyanogenbromid, organischen Lösungsmitteln und konzentrierten Säuren äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieser Verfahren sollte geeignete Schutzausrüstung getragen werden, und Cyanogenbromid sollte niemals außerhalb der zugelassenen Chemikalienschutzhaube gehandhabt werden. Diese Technik lieferte das Schlüsselmaterial für drei verschiedene Lösungs-n-mr-Strukturen von Transmembranpeptidkomplexen, die zeigen, wie sich Immunrezeptoren mit mehreren Untereinheiten durch Proteininteraktionen innerhalb der Lymphozytenmembran zusammensetzen.

Wir glauben, dass sich die Anwendung dieser Technik für andere Membranproteinsysteme als ebenso wertvoll erweisen wird.