Name: Produktion von Disulfid-stabilisierte Transmembrane Peptid-Komplexe für Structural Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung disulfid-stabilisierter Transmembran-Peptidkomplexe für Strukturbiologie mittels NMR. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Membranprotein-Interaktionen in Lipidumgebungen.

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Und der Regierung von Victoria (VESKI Innovation Fellowship MEC; Finanzierung dieser Arbeit wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (Independent Research Institute Infrastructure Support Scheme [IRIISS] Zuschuss an WEHI NHMRC Projektförderung 1011352 zur MEC und MJC) vorgesehen ist; Victorian State Government Operational Support der Infrastruktur, um WEHI). MEC ist ein Queen Elizabeth II Fellow des Australian Research Council. EFXB dankt für die Unterstützung aus der Norma Hilda Schuster Scholarship Program an der University of Melbourne.

Ein. Klonierung und Construct Design- Klonen die Sequenzen von Interesse in der PMM-Peptid-Vektor (die auf Wunsch zur Verfügung gestellt werden) mit HindIII und BamHI Restriktionsstellen (siehe Abbildung 1). Die doppelsträngige DNA-Insert sollte aufzunehmen, in der folgenden Reihenfolge: eine HindIII-Stelle; eine einzige Codon für Methionin CNBr-Spaltung, die E. coli-Codon-optimierte kodierende Sequenz, einen Stoppcodon, eine BamHI-Stelle. Alle anderen Methionine im Peptid sollten beseitigt werden und die Dipeptidsequenz Asp-Pro sollte vermieden werden, da es auch in sauren Bedingungen gespalten werden. Ein einzigartiges Cysteinrest sollten in jedem Peptid-Sequenz entsprechend der gewünschten Positionierung des Disulfid Vernetzungsdichte im fertigen Komplex eingeführt werden, und alle anderen Cysteinen sollte zu Serin mutiert werden. Das Plasmid trägt eine Kanamycin-Resistenzkassette zur Auswahl. 2. Die Expression von trpLE-peptide Fusion <ol><li> Make-up und Sterilfilter M9/Kan minimal Wachstumsmedium (0,1 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / l NaCl, 1 g / l NH 4 Cl, 4 g / l Glucose, 50 mg / l Kanamycinsulfat). Supplement mit Centrum Komplett von A bis Zink, B-Vitamine und Spurenelemente liefern: 1 Tablette in 40 ml H 2 O mit dem Mischen für 30 min, Zentrifuge, um unlösliches Material und Sterilfilter die orangefarbene Überstand zu entfernen. Lagerung der Stammlösung bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 2 Wochen und verwenden 4 ml / L in M9. Hinweis: 15 N-angereicherten NH 4 Cl, 13 C-angereicherte Glukose oder anderen stabilen Isotopen-markierten Vorstufen können in M9-Medium in dieser Phase aufgenommen werden, falls gewünscht. </li><li> Beimpfen von 100 ml Vorkultur aus frisch transformierten BL21 (DE3)-Stamm E. coli in M9/Kan Medium. Wachsen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 200 rpm. </li><li> Am nächsten Morgen, überprüfen Sie die OD 600 der Starter-Kultur - dies sollte im Bereich von 2 oder größer sein. Verdünnen Sie die 100 ml Starterkultur in 1 L Gesamtvolumen von Centrum-ergänzt M9 Medium. Aufgespalten in zwei 2 L Schikanekolben (500 ml Kultur in jedem Kolben) und wachsen bei 37 ° C unter Schütteln bei 140 rpm, bis die OD 600 erreicht 0.6. </li><li> Stellen Sie den Schüttler Temperatur auf 18 ° C und weiter Schütteln für 1 Stunde, so dass Kulturen vollständig abkühlen, bevor Induktion. </li><li> Nehmen Vorinduktion Probe für die SDS-PAGE-Analyse (Äquivalent von 50 ul aus einer Kultur bei OD 600 = 1), dann Hinzufügen von IPTG bis zu 0,1 mM Endkonzentration um die Expression des trpLE-Peptid-Fusion zu induzieren. Weiter wachsen bei 18 ° C/140 rpm über Nacht (16-20 h) unter IPTG-Induktion. </li></ol> 3. Inclusion Body Vorbereitung und Nickel Matrix Binding <ol><li> Die endgültige OD 600 der Übernachtungen Ausdruck Kulturen in Minimalmedium ist variabel und should zwischen 2,5 und 5,0 liegen. Eine Probe für die SDS-PAGE-Analyse (Äquivalent von 50 ul aus einer Kultur bei OD 600 = 1) und zu sammeln Zellen durch Zentrifugation für 20 min bei 5.000 x g beträgt. </li><li> Zellpellet aus 1 l-Kultur in 50 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Zellsuspensionen können eingefroren für spätere Verarbeitung werden. </li><li> Lysieren Zellen durch Beschallung auf Eis bei maximaler Ausgangsleistung für 1 min und Rest auf Eis für 5 min. Wir verwenden eine Misonix Sonicator 3000 (max Leistung 600 Watt) mit einem ½-Zoll-High-intensity austauschbaren Spitze. Wiederholen Beschallung / Kühlung für drei Zyklen. </li><li> Sammeln unlöslicher Einschlusskörper (IB) Material durch Zentrifugation für 15 min bei 20.000 × g und der Überstand verworfen. Ein loses, dünne Schicht aus helleren Zelltrümmern kann sichtbar auf der Oberseite des dichten IB-Pellet, dies kann weggewaschen werden unter Verwendung von Wasser oder Pufferlösung unter leichtem Schütteln. Schritte 3.3 und 3.4 wiederholt werden, um die Reinheit des IB Fraktion zu verbessern, sobald desired. Proben von Pellet und Überstand Material sollte für die SDS-PAGE-Analyse getroffen werden, um trpLE-TM Fusion Lokalisation an inclusion bodies bestätigen. </li><li> Aufzulösen IB Pellets in Guanidin-Lösung (6 M Guanidin HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME) unter Verwendung von 25 bis 50 ml pro Liter Kultur verarbeitet. Dieser Schritt wird mehrere Stunden unter Rühren und gelegentliche milde Ultraschallbehandlung erfordern. </li><li> Deaktivieren Sie das IB Lysat durch Zentrifugation für 1 Stunde bei 75,000-100,000 xg und 20 ° C. Den Überstand umfüllen und durch ein 0,2 &amp;mgr; m-Membran. </li><li> Kombinieren der freiwerdenden IB Lysat, in einem 50 ml konischen Röhrchen oder einen größeren Behälter, die sicher geschlossen werden kann, mit Nickel Affinitätsharz, das mit Wasser und äquilibriert um Guanidin-Lösung gewaschen wurde. Verwenden Sie 3-4 ml angesiedelt Harzes pro Liter der Kultur für Fusionen, die zu einem ähnlichen Grad auszudrücken, wie trpLE-DAP12TM hier (Abbildung 3, Spur 2) gezeigt, verarbeitet. Batch bind durch Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur t<html> emperatur unter leichtem Rühren. </li></ol> 4. On-Column-oxidative Vernetzung <ol><li> Legen Sie das IB-Lysat / Nickel Harzsuspension in ein leeres Schwerkraft Säule mit porösem Bett Unterstützung, indem kontinuierlich, bis das gesamte Volumen fließt. Sammeln und beiseite der Durchfluss, die gegebenenfalls noch ungebundenen Fusionsprotein. </li><li> Waschen Nickel Harz durch Schwerkraftfluß mit 5 Bettvolumina Harnstofflösung (8 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl), enthaltend 5 mM β-ME. </li><li> Waschen Sie die Nickel-Harz nochmals mit 5 Bettvolumina Harnstofflösung ohne β-ME. </li><li> Wäscht den Nickel-Harz ein drittes Mal mit 5 Bettvolumen von Harnstoff-Lösung, die mit 20 pM CuSO 4 und 2 mM oxidiertes Glutathion ergänzt wurde. Nach diesem Waschen, schließen Sie die Spalte Steckdose und inkubieren 30 min bei Raumtemperatur auf maximal Disulfidbindungsbildung ermöglichen. </li></ol> 5. TFA Elution und Quantifizierung Inhalt &quot;&gt; ACHTUNG: Trifluoressigsäure (TFA) verursacht schwere Verbrennungen bei Berührung mit der Haut und Dämpfe sind stark reizend Concentrated TFA sollte nur in einem zugelassenen chemischen Abzugshaube mit Augenschutz und Nicht-Latex-Handschuhe verwendet werden Überprüfen Sie die chemische Kompatibilität aller.. verwendeten Materialien Polypropylen ist kompatibel mit allen Schritten dieses Protokolls. <ol><li> Auswaschen oxidierende Harnstofflösung mit 10 Bettvolumina Wasser und trocknen Sie die Säulenbett durch Anlegen eines Vakuums Zeile der Spalte Steckdose. </li><li> Schließen Sie die Säulenauslass und fügen 1,5 Bettvolumina ordentlich (99-100%) TFA. Rühren Sie die Nickel-Harz mit einem kleinen Spatel noch Einwirkung von Säure zu gewährleisten und Inkubation für 5 min. Öffnen des Säulenauslaß und sammelt das saure Eluat Unterdrucksetzen vorsichtig mit einer Spritze oder Druckluftleitung ggf. zum Ausschieben gesamte Flüssigkeit. </li><li> Wiederholen Sie den Säureelution Schritt mit weiteren 1,5 Bettvolumina ordentlich TFA. Arbeiten Sie schnell bei diesem Schritt um eine vollständige Auflösung des Beade vermeidend Agarosematrix. Proteinausbeute kann an dieser Stelle gemäß dem Lambert-Beer-Gleichung und dem theoretischen molaren Extinktionskoeffizienten des trpLE-Peptid-Sequenz bestimmt werden. Verdünnen einer Probe des TFA-Eluat (1.20 bis 01.50) in Trifluorethanol (TFE) und Messung der Absorption bei 280 nm, mit TFA / TFE bei gleicher Verdünnung als Blindprobe. </li></ol> 6. CNBr Verdauung ACHTUNG: Bromcyan (CNBr) ist extrem giftig und sollte nur in einem zugelassenen chemischen Abzugshaube behandelt werden. PSA einschließlich Schutzbrille, Kittel und Nicht-Latex-Handschuhe sind zwingend erforderlich. CNBr reaktiv ist gegenüber Feuchtigkeit und auf Raumtemperatur vor dem Öffnen. Kontaktieren Sie Ihren institutionellen Safety Office Anweisungen zur Neutralisierung / Entsorgung von CNBr-kontaminierten Lösungen und Materialien. <ol><li> Verdünnen des sauren Eluats auf 80% TFA endgültige Konzentration durch tropfenweise Zugabe von Wasser unter Mischen sanft. Wenn ein Niederschlag bildet, eindd zurück ein kleines Volumen (0,5 bis 1 ml) von reinem TFA bis die Lösung klar, dann wieder richtig zu 80% mit Wasser. Nehmen Sie eine 5 ul pre-Digest Probe für SDS-PAGE-Analyse, das Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lyophilisieren die Probe sofort. </li><li> Fügen CNBr Kristalle etwa 0,2 g / ml, wobei darauf zu achten die giftige Chemikalie sicher wiegen in geschlossenen, vorgewogenen Rohren oder mit einer Waage in der chemischen Abzugshaube. Vorsichtig mischen, bis sie vollständig aufgelöst. Spül-und versiegeln das Reaktionsgefäß unter Schutzgas (Stickstoff oder Argon-Strom) und inkubieren 3-4 Stunden bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. </li><li> Nehmen Sie eine 5 ul post-Digest Probe für SDS-PAGE-Analyse und frieren und lyophilisiert sofort. Übertragen des Digest Reaktion auf eine Regeneratcellulose Dialysekassette oder Schlauch (Celluloseacetat wird in konzentrierter Säure auflöst) mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3,5 kDa oder weniger, je nach der Größe des erwarteten Peptid-Komplexes. Dialysieren über Nacht auf 4 l Wasser in derLaborabzug zur Verringerung der TFA-Konzentration und zersetzen nicht umgesetztes CNBr. Lassen Sie Platz in der Dialyse Kassette oder Schläuche für eine signifikante Zunahme des Volumens (so viel wie zwei-bis drei-fach) während Dialyse über Nacht. </li><li> Entfernen der dialysierten Reaktionslösung mit suspendierten Niederschlag aus der Dialyse-Kassette oder Schlauch (meiste Protein auszufällen wird, wenn die Konzentration verringert wird TFA) und übertragen die Suspension auf 50 ml konischen Röhrchen. Einfrieren und lyophilisieren, um Wasser und Spuren von CNBr / TFA zu entfernen. Dieser Schritt ist wahrscheinlich erfordern mehrere Tage. ACHTUNG: Sowohl die dialysierten Digest Reaktion und die Dialyse Wasser sollte weiterhin als giftig und behandelt / entsorgt mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. </li><li> Proben der Kulturen aus Vorinduktion und Ernte Stufen Einschlusskörper Überstand und Pellet, TFA-Eluat und CNBr-verdaute Material kann durch SDS-PAGE analysiert werden. Planen Proben durch Erhitzen auf 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS sample Puffer. TFA Eluat und verdauen Proben sollten sowohl in reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen hergestellt werden, um Produkt-Identifikation und Bewertung von oxidativen Vernetzung zu erleichtern. </li><li> Trennen der Proben auf einem 12% NuPAGE Bis-Tris vorgegossenen Acrylamidgel unter Verwendung MES-SDS Laufpuffer für eine optimale Auflösung der kleinsten Digest Produkte. </li></ol> 7. Reversed-Phase HPLC Aufreinigung von Disulfid-vernetztes Peptid-Komplexen <ol><li> Man löst bis zu 100 mg lyophilisiertes Digest Produkte in 2-3 ml Ameisensäure und ordentlich Last auf einem präparativen Maßstab (21,2 x 150 mm) Agilent Zorbax SB-300 C3 PrepHT Spalte in Lösungsmittel A (typischerweise 10-20% Acetonitril oder 5 -10% Isopropanol in Wasser mit 0,1% TFA). </li><li> Eluieren die Digest-Produkten in einem Gradienten von Lösungsmittel B (Acetonitril oder Isopropanol mit 0,1% TFA) über mindestens 5 Säulenvolumen. Siehe die Diskussion um Vorschläge für die Auswahl der optimalen Gradienten Bedingungen für verschiedene Peptidsequenzen. </li><li> Nehmen50-100 ul-Proben von jedem HPLC-Fraktion für die SDS-PAGE-Analyse und frieren und lyophilisiert sofort. Entfernung von Lösungsmittel HPLC erfolgt rasch und sollte in 1-2 h abgeschlossen. </li><li> Planen lyophilisiert HPLC-Proben für SDS-PAGE durch Erhitzen auf 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS-Probenpuffer ohne Reduktionsmittel. Cool und aufgeteilt jeder Probe gleichmäßig in 2 Mikrozentrifugenröhrchen, Zugabe von 100 mM DTT, einer von ihnen und Nachwärmsysteme kurz. </li><li> Trennungen reduzierten und nicht reduzierten HPLC-Proben auf einem 12% NuPAGE Bis-Tris vorgegossenen Acrylamidgel mit MES-SDS Laufpuffer wie oben. Klein, hydrophobe Peptide oft nicht nehmen Coomassie gut färben und kann nicht an ihren erwarteten Molekulargewichten laufen. Jedoch sollte Vergleich reduzierten und nicht reduzierten Proben zu erleichtern Identifizierung der vernetzten Peptidprodukte und Beurteilung der Reinheit. </li><li> Analysieren der Kandidaten-Peptid-haltigen Fraktionen durch Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie (siehe Diskussion) zur Identifizierung der interessierenden Spezies und bestätigen die erwartete Masse. </li><li> Kombinieren, einfrieren und lyophilisieren HPLC-Fraktionen, die das reine, vernetzten TM-Peptid-Komplex und einen Trockengewicht des Endprodukts an Ausbeute zu bestimmen. Fraktionen mit hoher Isopropanol Inhalte dürfen nicht eingefroren bleiben. Wenn Peptidfraktionen trocknen auf einem Film anstatt einem flauschigen lyophilisierten Produkts, wieder auflösen den Film vollständig in einem kleinen Volumen von reinem Hexafluorisopropanol (HFIP), einfrieren und lyophilisieren erneut. Der HFIP-behandeltes Produkt sollte eine kleine, weiße Kegel, einfach gekippt wird und abgewogen werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Expression von trpLE-TM Fusionen. Nach unserer Erfahrung sind trpLE-TM Fusionen schlecht in eine reiche Kultur-Medium bei 37 ° C angegeben, und die Kultur hier beschriebenen Bedingungen bewährt für viele verschiedene Sequenzen mit 1-4 Transmembrandomänen mit Ausbeuten bis hin bewährt haben 50 bis 150 mg / l reines, intaktem Fusionsprotein. Fusions-Codierung Drei-oder Vier-TM GPCR Fragmente (TM1-humanen CCR5 TM3 und TM4-TM7 bezeichnet) oder ein Kern katalytisches Fragment von menschlichem Signalpeptidpeptida...

Dieses Protokoll Angaben eine Prozedur entwickelten wir zu Disulfid-stabilisierten Komplexe von Transmembran (TM)-Peptide für strukturelle Untersuchungen mittels NMR-Lösung zu erzeugen haben. Das Verfahren nutzt die Expression durch die robuste ΔtrpLE1413 Fusionssystem (siehe unten) ergab und ermöglicht TM-Peptid-Komplexe mit definierter Zusammensetzung zu erzeugenden mit hochentwickelten stabilen Isotopen Markierungstechniken für moderne mehrdimensionalen NMR-Experimente werden. Wir haben diese Techniken eingesetzt werden, um mehrere NMR-Strukturen, die wichtige neue Informationen darüber, wie Lymphozyten-Aktivierung Immunrezeptoren werden aus mehreren Membran-Protein-Untereinheiten durch Interaktionen zwischen ihren TM-Domänen zusammengesetzt (kürzlich in 1 bewertet) ergab bestimmen. Diese Techniken sind auf viele andere Membranprotein Systeme sowie einer Vielzahl von nachgeschalteten analytischen Methoden zusätzlich zur Lösung NMR. Während die hier angegebene Beispiel nutzt nativen Cysteinresteum einen Komplex, der die natürliche Disulfid-gebundenen Proteins nachahmt, das Design ist gleichermaßen gut für die Erstellung von engineered Disulfidbindungen, um Komplexe, die normalerweise miteinander durch schwächere, nicht-kovalente Wechselwirkungen, wie Homo-und Hetero-dimeren TM Komplexe stabilisieren geeignet gehaltene epidermal growth factor receptor (EGFR)-Familie Proteinen 2-4 oder heterodimeren αβ Integrin-Komplexen 5,6. Extrem hydrophoben Peptidsequenzen wie die von der Lipid-Doppelschicht abgeleitet umspannenden Teile TM Proteine ​​sind äußerst schwierige Themen für biochemische und biophysikalische Studien. Zusätzlich dazu, dass sehr schwierig zu manipulieren Verwendung von Standard-Protein-und Peptidchemie Techniken, sind sie oft ziemlich toxisch für Zellen und sind daher schwer rekombinant herzustellen. Wir 7,8 und andere 9-11 gehabt haben bedeutende Erfolge Ausdruck solch schwierigen Peptidsequenzen in Bakterien als in-frame carboxyterminalenFusionen mit einer modifizierten Version des ΔtrpLE1413 Sequenz aus dem E. abgeleitete coli trp Operon 12. Die ~ 13 kDa Polypeptid trpLE von dieser Sequenz codierten können in hohen Konzentrationen unter einem T7-Promotor erzeugt werden und vollständig in Einschlusskörpern, wo Probleme bezüglich Toxizität und / oder Instabilität umgangen lokalisiert. Modifikation der Sequenz durch Hinzufügen einer Amino-terminalen Histidin-Tag 9-13 und Eliminierung von internen Methionin und Cystein-Reste aus der Sequenz 14 trpLE erlaubt trpLE-Peptid-Fusionen durch Metallionen-Affinitätschromatographie gereinigt werden und verdaut mit Cyanogenbromid (CNBr ), um den gewünschten Peptidsequenz. Wir haben erfolgreich dieses System verwendet, um mehr als ein Dutzend verschiedene Sequenzen als trpLE Fusionen darstellen Membranprotein-Fragmente, die weniger als vier Transmembrandomänen enthalten und exprimieren (7,8 und unveröffentlichte Ergebnisse; siehe auch Abschnitt Diskussion). Diewichtige Neuerung in diesem Protokoll ist die Identifizierung von Bedingungen, unter denen die unstrukturierte und sehr schlecht löslich trpLE-TM Fusionen effizient im Rahmen eines optimierten Workflow Disulfid-vernetzt werden können. Mehrere Aspekte der Expression mit hoher Ausbeute, die Handhabung und Reinigung von Peptid Produkte wurden ebenfalls gründlich optimiert, und den Empfehlungen hier vorgestellten gleichermaßen relevant für die Produktion von Nicht-Disulfid-vernetztes (monomeren) TM Peptid Produkte.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromcyan </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> STOFF. Gefahrgut. Sehr giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Berührung mit Säure sehr giftige Gase. Sehr giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen in der aquatischen Umwelt. </td></tr><tr><td> Trifluoressigsäure </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE-1000984387, CAS-Nummer 76-05-1 </td><td> STOFF. Gefahrgut., Verursacht schwere Verätzungen. Gesundheitsschädlich beim Einatmen. Schädlich für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen in der aquatischen Umwelt. </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, CAS-Nummer 60-24-2 </td><td> STOFF. Gefahrgut. Giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Reizt die Haut. Gefahr ernster Augenschäden. Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich. Sehr giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen in der aquatischen Umwelt. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Product Number 52512, CAS-Nr. 920-66-1 </td><td> STOFF. Gefahrgut. Gesundheitsschädlich beim Einatmen und Verschlucken. Verursacht Verätzungen. </td></tr><tr><td> Ameisensäure </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Flüssigkeit und Dampf entzündbar. Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. </td></tr><tr><td> Harnstoff </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Product Number, 817, CAS-Nr 57-13-6 </td><td> Beim Erhitzen Dezemberomposes zu Kohlendioxid und Ammoniak; wenn verbrannt, emittiert geringe Mengen von Stickoxiden. Kann Rötungen und Reizungen an Haut und Augen verursachen. </td></tr><tr><td> Guanidinhydrochlorid </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, CAS-Nummer: 50-01-1 </td><td> Gesundheitsschädlich beim Verschlucken Verursacht schwere Augenreizung, Verursacht Hautreizungen, Akute Toxizität Oral, hautreizend, Eye Reizend. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Product Number-T8532 CAS Nr.: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 ist ein nichtionisches Detergens, 100% Wirksubstanz, die oft in biochemischen Anwendungen verwendet wird, um Proteine ​​löslich zu machen. Triton X-100 hat keine antimikrobielle Eigenschaften und prüft eine vergleichsweise milden nicht-denaturierenden Detergenz </td></tr><tr><td> His-Select Nickel-Affinity Gel </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Katalog Num-P6611 </td><td> IS-Select Nickel Affinity Gel ist ein immobilisierter Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) Produkt. Die HIS-Select Nickel Affinity Gel ist ein proprietäres vierzähnigen Chelat auf Perlen Agarose mit Nickel, die speziell für den binden Histidin enthaltenden Proteinen aufgeladen ist. </td></tr><tr><td> (-)-Glutathion, oxidiertem </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Katalog num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 Sonicator </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (eingestellt) </td><td> Max. Ausgangsleistung 600 Watt. 1/2-Zoll auswechselbaren-tip-Sonde nimmt 1/2-Zoll hoher Intensität, High-Volume-Tipps und eine Reihe von hoher Intensität, Low-Volume-Tipps. Closest derzeit verfügbaren Modelle dieser Firma sind Q500 und Q700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: BioLogic DuoFlow Chromatographie-System, Software Version 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Katalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 </td><td> Peptide bindet an HPLC-Säulen in hoher aq umkehrenueous mobile Phase und werden von RP-HPLC-Säulen mit hohen organischen mobilen Phase eluiert. In RP HPLC Peptide werden auf der Grundlage ihrer hydrophoben Charakter getrennt. Peptide können durch Ausführen eines linearen Gradienten von organischem Lösungsmittel abgetrennt werden. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-analytische HPLC-Säule, 21,2 x 150 mm, 5 mm Korngröße </td><td> Agilent </td><td> Artikel-Nr: 895150-909 </td><td> Umkehrphasen-HPLC colum </td></tr><tr><td> 12% NuPAGE Bis-Tris-Gele </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Pre Gele für Protein-Elektrophorese </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer G2 Dialyse Kassetten, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> Artikel Nr.: 87724 </td><td> Beispiel Dialyse </td></tr></tbody></table>

produktion von disulfid-stabilisierte transmembrane peptid-komplexe für structural studies

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physikalische Wechselwirkungen zwischen den Lipid-eingebetteter Alpha-Helix-Domänen von Membranproteinen spielen eine entscheidende Rolle bei der Faltung und Montage von Membranprotein-Komplexen und bei dynamischen Prozessen wie Transmembran (TM)-Signalisierung und Regelung Zelloberflächenprotein Ebenen. Das Verständnis der strukturellen Merkmale der Fahrt die Assoziation von bestimmten Sequenzen erfordert ausgefeilte biophysikalische und biochemische Analysen der TM-Peptid-Komplexe. Allerdings macht die extremen Hydrophobie Transmembrandomänen sie sehr schwierig zu handhaben Verwendung von Standard-Techniken der Peptidchemie, und Herstellung von geeigneten Lehrmaterial erweist sich oft als prohibitiv anspruchsvoll. Identifizieren Bedingungen, unter denen Peptide stabile helicale Konformationen und bilden Komplexe annehmen kann spontan fügt eine weitere Schwierigkeit. Hier stellen wir ein Verfahren zur Herstellung von Homo-oder Hetero-dimeren TM-Peptid-Komplexe aus Materialien, die in E. exprimiert werden coli, wodurch Einbau von stabilen Isotopenmarker für Kernspinresonanz (NMR) oder nicht-natürlichen Aminosäuren für andere Anwendungen relativ kostengünstig. Die wichtige Neuerung an diesem Verfahren ist, dass TM-Komplexe gebildet werden und gereinigt, wie kovalent assoziiert (Disulfid-vernetzt) ​​Anordnungen, die stabile, homogene stöchiometrische und Strukturen bilden können, wenn sie in Wasch-, Lipid oder eine andere Membran-mimetischen Materialien rekonstituiert. Wir präsentieren auch sorgfältig optimierten Verfahren zur Expression und Reinigung, die in gleicher Weise anwendbar, ob die Herstellung von ein TM-Domänen oder vernetzte Komplexe sind und beraten für die Anpassung dieser Methoden, um neue TM-Sequenzen.

Die Höhe der Ausdruck für trpLE Fusionen erreicht ist variabel und hängt stark von der Aminosäure-Sequenz der angehängten Peptid. Abbildung 3 zeigt die SDS-PAGE-Analyse von Vorinduktion (Spur 1) und Time-of-Ernte (Spur 2) Proben aus einer Kultur, die ca. 120 mg reines, intakte trpLE-DAP12TM Fusionsprotein aus 1 Liter Kultur und 4 ml Nickelmatrix ergab. Alle der trpLE-DAP12TM Fusionsprotein wurde zu der Einschlusskörper Pellet (Spur 4), um Überstand (Bahn 3) gegenüberliegenden lokalisiert. <p class="...

Biophysikalische und biochemische Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen den membranständigen eingebettet Proteindomänen stehen viele technische Herausforderungen, von denen der erste Abschluß einer entsprechenden Studie Material ist. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Reinigung Disulfid-stabilisierten Transmembran-Peptid-Komplexe, die geeignet für die Strukturanalyse durch Lösungspolymerisation Kernspinresonanz (NMR) und andere analytische Anwendungen sind.

Produktion von Disulfid-stabilisierte Transmembrane Peptid-Komplexe für Structural Studies

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Dieses Protokoll erzeugt kovalent stabilisierte Komplexe von Transmembranpeptiden für Strukturstudien, die darauf abzielen, zu verstehen, wie Membranproteine über ihre in Lipide eingebetteten Domänen miteinander interagieren. Exprimieren Sie zunächst ein hist-markiertes Fusionsprotein, das die Transmembransequenz von Interesse in e coli enthält. Extrahieren Sie dann das Protein aus der Einschlusskörperfraktion mit Guine und Detergens mit einer Nickel-Affinitätsmatrix.Das hist-markierte Fusionsprotein wird konzentriert und durch Disulfid mit der diametralen Form vernetzt, indem die Säule in einer Lösung mit Oxidationsmitteln gewaschen wird. Als nächstes eluieren Sie das vernetzte Fusionsprotein in Trifluoressigsäure und behandeln Sie es mit Cyanogenbromid, um den Fusionspartner freizusetzen, und fahren Sie fort, das vernetzte Peptidprodukt aus dem Verdauungsgemisch durch Umkehrphasen-HPLC zu isolieren. Letztendlich werden die Identität und Reinheit der Produkte durch SDB-Seiten- und Massenspektrometrie-Analysen überprüft.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass reine soziometrische Komplexe für Strukturstudien mit Techniken wie Lösungs- oder Festkörper-NMR hergestellt wer

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Ein Protokoll für die quantitative, Expressionsscreening mit hohem Durchsatz und analytischen Reinigung von Fusionsproteinen aus kleinen Escherichia coli-Kulturen beschrieben und auf die Expression von Disulfid-reichen Tiergift-Protein-Targets aufgebracht.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Es wird ein Verfahren zur effizienten Reinigung von Doppel Strep-tag-Fusionsproteine ​​und deren Komplexe spezifisch auf modifizierte Streptavidin beschrieben (Strep-Tactin)-Harz kovalent mit Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) vernetzt. Das Verfahren hat die Vorteile der schnellen Geschwindigkeit, gute Zielprotein Recovery und hohe Reinheit und ist mit nachfolgender Analyse durch Massenspektrometrie kompatibel.

Ein-Schritt-Reinigung von Twin-Strep-markierten Proteine ​​und ihre Komplexe auf Mit Bis (Sulfosuccinimidyl) Strep-Tactin Resin Vernetzte suberat (BS3)

Um Krebsmedikamente mit hoher Spezifität und reduzierten Nebenwirkungen an Tumorstellen zu bringen, sind neue Methoden auf Basis von Nanopartikeln erforderlich. Hier beschreiben wir disulfidvernetzte Mizellen, die durch Wasserstoffperoxid-vermittelte Oxidation leicht hergestellt werden können und in der Lage sind, unter einer reduzierenden Tumorumgebung effizient zu dissoziieren, um Nutzlasten freizusetzen.

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Bewertung der Wechselwirkungen und Assemblierungen von integralen Membranproteinen in vitro mit verschiedenen Partnerfaktoren in einer lipidproximalen Umgebung.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen In Vitro

Prolin-Prolin-Endopeptidase-1 (PPEP-1) ist eine sezernierte Metalloprotease und ein vielversprechendes Wirkstoffziel aus dem humanpathogenen Clostridium difficile. Hier beschreiben wir alle Methoden, die für die Herstellung und Strukturbestimmung dieses Proteins notwendig sind.

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Verfahren zur Stabilisierung und Trenn nativen Proteinkomplexe aus unmodifizierten Gewebelysat gekoppelt, um ein Amin-reaktives Protein Vernetzers unter Verwendung von auf eine neuartige zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -System dargestellt.

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Wir präsentieren ein Protokoll für den Bau von Thioether/Vinyl sulfid angebunden spiralförmige Peptide mit Foto-induzierte Thiol-ene/Thiol-Yne Hydrothiolation.

Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Hier präsentieren wir Ihnen eine Prozedur zum eindringmittel Funktionalisieren Disulfides auf Qβ VLP mit Dibromomaleimide. Wir beschreiben Qβ Ausdruck und Reinigung, die Synthese von Molekülen Dibromomaleimide funktionalisiert und die Konjugation-Reaktion zwischen Dibromomaleimide und Qβ. Das daraus resultierende gelbe fluoreszierende konjugierte Teilchen kann als Fluoreszenz Sonde innerhalb der Zellen verwendet werden.

Konjugation-induzierte fluoreszierende pegylierten virusähnliche Partikel durch Dibromomaleimide-Disulfid Chemie zu machen

Ein Protokoll für die Synthese von 1,2-Dithiolane modifizierte Peptid und die Charakterisierung der supramolekularen Strukturen durch das Peptid Selbstmontage.

Synthese und Charakterisierung von 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptide

Cystein-Rich-Peptide Falten in verschiedene dreidimensionale Strukturen abhängig von ihrer Disulfid-Konnektivität. Gezielte Synthese von einzelnen Disulfid Isomere ist erforderlich, wenn Puffer Oxidation nicht zu dem gewünschten Disulfid-Konnektivität führt. Das Protokoll geht es um die selektive Synthese von 3-Disulfid-gebundenen Peptide und ihre strukturellen Analyse mit NMR und MS/MS-Studien.

Synthese und Strukturaufklärung von µ-vor PIIIA Isomere mit verschiedenen Disulfid Verschaltungen

Die Verbindung von Disulfiden ist seit langem bekannt, um die Struktur vieler Proteine zu stabilisieren. Eine einfache Methode, um multimerische Komplexe zu analysieren, die durch diese Verknüpfungen stabilisiert werden, ist die Nicht-Remation der SDS-PAGE-Analyse. Hier wird diese Methode durch die Analyse der nuklearen Isoform von DUTPase aus der menschlichen Knochen osteosarcoma Zelllinie U-2 OS veranschaulicht.

Die Kombination von nicht-reduzierender SDS-PAGE-Analyse und chemischer Vernetzung mit Detect Multimerischen Komplexen, die durch Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture stabilisiert wurden

Erfahren Sie die Herstellung disulfid-stabilisierter Transmembran-Peptidkomplexe für Strukturbiologie mittels NMR. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Membranprotein-Interaktionen in Lipidumgebungen.

Produktion von Disulfid-stabilisierte Transmembrane Peptid-Komplexe für Structural Studies

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